根瘤菌和植物(豆科)之间的相互作用分子机制

1、生命科学学院遗传学冯刚1.1.相关概念相关概念1.1 1.1 根瘤菌根瘤菌( (Rhizobia) )：是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，它可以侵染豆科植物根部形成根瘤，固定空气中的分子态氮形成氨，为植物提供氮素营养。1.2 根瘤菌的分类：根瘤菌的分类：表表1根瘤菌分类系统根瘤菌分类系统Table 1 Fred Rhizobium classification system种名 寄主植物的属名苜蓿根瘤菌(R.meliloti) 菖蓿属(Medicago) 胡芦巴属(Trigonella)三叶草根瘤(R.trifolii) 车轴草属(Tri如lium)豌豆根瘤菌(R.leguminasar

2、um) 豌豆属(Pisum)野豌豆属(Vicia) 香豌豆属(Lathyrus)兵豆属(Lens)菜豆根瘤菌(R.phasoli) 菜豆属(Phaseolus)羽扇豆根瘤菌(R.lupini) 羽扇豆属(Lupinus) 1932年，Fred等人首次提出了根瘤茵分类系统，他们根据互接种族的关系，将全部根瘤菌定义为1属5种。 根瘤菌的早期分类一直是以互接种族(cross-in-oculation group)为主要依据的。 Jordan Jordan在在19841984年出版的伯杰系统细菌学手册年出版的伯杰系统细菌学手册( (第第一卷一卷) )中，总结了前人数值分类、中，总结了前人数值分类、DN

3、ADNA碱基组成、碱基组成、DNADNA同源同源性、血清血分析、胞外多糖成份分析、全细胞可溶性蛋白性、血清血分析、胞外多糖成份分析、全细胞可溶性蛋白电泳和电泳和rRNA-DNArRNA-DNA杂交等大量研究结果，对根瘤菌科分类系杂交等大量研究结果，对根瘤菌科分类系统进行了修订。统进行了修订。随着原核生物分类技术的改进和根瘤菌研究工作的深入，对根瘤菌系统发育的研究也随着根瘤菌分类系统的不断补充与完善而得以系统化、科学化。其后又发现了许多新种，并确定了其分类地位，目前，根瘤菌科已发展到7属36种。1.3 1.3 共生关系共生关系(Symbiosis)(Symbiosis)： 根瘤菌与相应的豆科植物

4、及少数非豆科植物根系共生形成根瘤，能将空气中的分子态氮还原为植物可利用的氨，对自然界的氮素循环起着十分重要的作用，豆科植物为根瘤菌提供生长繁殖所需的能量和营养物质。根瘤菌感染豆科植物形成根瘤共生体，是由根瘤菌和寄主植物2方面的遗传因素所决定，根瘤菌具备实现固氮功能的全部遗传因子，寄主植物提供固氮作用所需的条件。 指一个以上的有机体，双方建立互利共存或一方有利对方无害地生活在一起的一种关系，生物之间共生关系有利于共生体对外界自然环境的生存适应。2. 参与共生固氮的物质基础参与共生固氮的物质基础 从生物化学和分子生物学角度来看，豆科植物一根瘤茵的相互识别属亲和性(阴性)识别系统，吸附的专化性取决于

5、分子识别，参与分子识别的物质包括豆科植物凝集素豆科植物凝集素(lectin)(lectin)、类黄酮类黄酮和根根瘤菌表面多糖瘤菌表面多糖，并将它们分别称为植物识别子植物识别子(cognor)(cognor)与细菌识细菌识别子别子(cognon)(cognon)。分子识别即植物识别子与细菌识别子间结构互补的特异结合。2.1 2.1 豆科植物凝集素豆科植物凝集素作为媒介联结菌体和根毛细胞；对糖残基结合的特异性使吸附具有专化性；与细菌的cognon结构互补、相互联结。 豆科植物的凝集素是其分泌的一种糖蛋白，它在吸附中有3种功能：2.2 2.2 类黄酮类黄酮 类黄酮属于植物次生物质，不直接参与豆科植物

6、根瘤菌分子识别反应。 已有研究证实类黄酮能专一地诱导nod基因的表达，从而刺激NodRm因子的产生。 TonVan Brussel等认为nod基因的诱导物是nod基因本身，并发现豌豆根瘤菌胞外多糖能诱导8种新的诱导nod基因表达的类黄酮产生，这种受根瘤菌诱导而新合成的类黄酮又通过诱导nod基因的表达而控制根瘤菌表面多糖的产生，这样识别信号不断放大。2.3 根瘤菌表面多糖根瘤菌表面多糖 根瘤菌表面具有与凝集素有特异结合能力的多糖，包括胞外多糖、荚膜多糖和脂多糖：EPS是根瘤菌分泌到细胞之外的多糖，CPS存在于根瘤菌的荚膜中，LPS是细胞壁成分。 EPS或CPS本身是一种可以与相应植物凝集素特异结

7、合的半抗原，而LPS作为cognon时必须是完全型的，即含O一抗原；O一抗原中的糖组分有细菌种的特异性，使LPS在作为cognon起作用时表现出专化性。sander等(1978)从豌豆根瘤菌和寄主共生的相互作用中，证实了豌豆根瘤菌荚膜多糖和胞外多糖的重要性，他们指出豌豆根瘤菌的突变株由于不能合成正常量的胞外多糖，以致不能使豌豆植物结瘤。 根瘤菌的cognon依互作体系的不同而不同，是3种多糖中的1、2或3种，它们调节不同类型的吸附，并非同时参与作用。3. 与共生固氮相关的基因与共生固氮相关的基因3.1 与共生固氮有关的根瘤菌基因与共生固氮有关的根瘤菌基因 在豆科植物根瘤菌共生固氮体系中，参与根

8、瘤发育的根瘤菌基因可分为3类：第1类是结瘤基因(nod, nol, noe)；第2类是与细菌细胞表面结构有关的基因(exs, lps, ndv)；第3类是固氮基因(nif, fix)。结瘤基因结瘤基因 主要功能是共生关系早期过程中信号分子的形成与交换。它们位于根瘤菌的共生质粒(sym plasmid)上，包括3组：调节基因(nodD)，共同结瘤基因(nodABCIJ)和宿主专一性基因（又叫基因hsn），如nodH。调节基因调节基因nodD 存在于所有根瘤菌中，一般是组成型表达。其产物可激活其它nod基因的表达，但它的激活又受到宿主植物专一的黄酮类物质的调节。原因是，nod蛋白在类黄酮的存在下能

9、够和nodD基因启动子中的3060bp长的高度保守的核苷酸序列，即nod box结合。所以一般认为，nodD是一转录结合物，调节其它nod基因的表达。共同结瘤基因共同结瘤基因nodABCIJ 存在于所有根瘤菌中，具有较高同源性，并且在功能上是互补的，它对豆科植物根毛卷曲和皮层细胞分裂是必须的。宿主专一性基因宿主专一性基因 控制根瘤菌的宿主范围。目前，已克隆的结瘤基因约有50多个。 根瘤菌的结瘤基因表达后，将合成并分泌一类脂寡糖化合物，即结瘤因子，作为根瘤菌返还给宿主植物的信号分子。与根瘤菌细胞表面结构有关的基因与根瘤菌细胞表面结构有关的基因 研究表明，所有根瘤菌分泌的结瘤因子都具有相似的骨架结

10、构：一个由研究表明，所有根瘤菌分泌的结瘤因子都具有相似的骨架结构：一个由35个个N乙酰氨基葡糖组成的糖骨架和在还原糖末端乙酰氨基葡糖组成的糖骨架和在还原糖末端C2上连的一条脂肪酸链上连的一条脂肪酸链构成。但不同根瘤菌来源的结瘤因子在侧链上羟基的取代基团、脂肪酰链的构成。但不同根瘤菌来源的结瘤因子在侧链上羟基的取代基团、脂肪酰链的长度和不饱和方面表现出较大的差异，而这些结构的差异是与根瘤菌的宿主长度和不饱和方面表现出较大的差异，而这些结构的差异是与根瘤菌的宿主范围紧密相关的。范围紧密相关的。 与根瘤菌细胞表面结构有关的基因，即与胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS)和中性葡聚糖合成有关的基因，分别

11、称exs, lps和ndv基因。它们对建立共生固氮关系是很重要的，这类基因突变，导致不能形成侵入线或形成空瘤。固氮基因固氮基因 固氮基因可分为固氮酶基因（nif基因）和共生固氮基因（fix基因）。 nif基因是固氮微生物所共有的，有高度的保守性，它与肺炎克氏杆菌(K.Pneumonic)有同源性的固氮酶结构或调节基因。其中，nifA是转录调节基因，它对其它nif基因和某些基因进行正调控；nifDH是固氮酶的结构基因；nifL是负调节基因。 fix基因是只在根瘤菌中发现的、控制共生固氮作用的基因，其中fixABC在电子传递中可能具有作用；已报导fixC对膜嵌入有一个信号序列；fixLJ对nifA

12、基因转录调节。3.2 与共生固氮有关的植物基因与共生固氮有关的植物基因 在根瘤发育的各个阶段，一些植物基因得到特异性表达，这些在根瘤发育中特异表达的植物基因被称为结瘤素(nodulin)基因。 在根瘤固氮开始之前，表达的植物基因被叫做早期结瘤素基因(ENOD)，相反在固氮开始时和之后，表达的植物基因则称为晚期结瘤素基因(NOD)。 Enod一般是在根瘤接种数小时后到根瘤形成、固氮作用之前出现。据报道，不同植物根瘤的Enod有所不同，但共同的是都有Enod2, Enod5, Enod12, Enod40等。Nod大多数在根瘤有固氮活性前表达，与固氮作用密切相关。研究最多的是豆血红蛋白(Lb)，为

13、固氮过程中固氮酶兼氧所需。4.4.共生固氮过程共生固氮过程 豆科植物根瘤菌相互识别属亲和性(阴性)识别系统，它们之间相互作用形成根瘤的过程可分为5个阶段：（1）根瘤菌趋化性地接近根毛细胞，并在植物根际繁殖，即根际的 殖民化；（2）根毛细胞变形弯曲；（3）细菌诱导根毛细胞形成一种管状结构侵染线；（4）根皮层细胞分裂形成根瘤原基；（5）根瘤原基分化形成各种根瘤组织，最后形成成熟的固氮根瘤。 当豆科植物在幼苗期幼苗期，土壤中的根瘤菌便被其根毛分泌的有机物吸引而聚集在根毛的周围，并大量繁殖。同时产生一定的分泌物，这些分泌物刺激根毛，使其先端卷曲和膨胀卷曲和膨胀，同时，在根菌瘤分泌的纤维素酶的作用下，根

14、毛细胞壁发生内陷溶解内陷溶解，随即根瘤菌由此侵入根毛。 在根毛内，根瘤菌分裂滋生，聚集成带，外面被一层粘液所包，形成为感染丝感染丝，并逐渐向根的中轴延伸。同时，在根瘤菌的刺缴下，根细胞相应地分泌出一种纤维素，包围于感染丝之外，形成了具有纤维素鞘的内生管，又称侵入线侵入线。根瘤菌顺侵入线进入幼根的皮层中。 在皮层内，根瘤菌根瘤菌迅速分裂繁殖分裂繁殖，皮层细胞受到根瘤菌侵入的刺缴，也迅速分裂，产生大量的新细胞。致使皮层出现局部的膨大。这种膨大的部分，包围着聚生根瘤菌的薄壁组织，从而形成了外向突出生长的根瘤根瘤。 之后，含有根瘤菌的薄壁细胞的细胞核和细胞质逐渐被根瘤菌所破坏而消失，根瘤菌相应地转为拟

15、菌体拟菌体(bacterioid)。具体过程： 主根瘤菌主根瘤菌刚刚进入豆科植物根部的时候，并不能固氮，只能发展到拟菌体拟菌体阶段，才能进行固氮作用。 在根瘤内，根瘤菌根瘤菌从豆科植物根的皮层细胞中吸取碳水化合物、矿质盐类及水分。以进行生长和繁殖。同时它们又把空气中游离的氮通过固氮作用固定下来，转变为植物所能利用的含氮化合物，供植物生活所需。这样，根瘤菌与根便构成了互相依赖的共生关系共生关系。（1）根际的殖民化根际的殖民化 根瘤菌对豆科植物根际的殖民化殖民化是由细菌的趋化性趋化性和根分根分泌物泌物刺激根瘤菌生长的潜力来决定的，关于趋化性的信号机理还不清楚。选择吸附学说选择吸附学说认为，根瘤菌对

16、豆科寄主植物寄主植物与非寄主植物非寄主植物根毛吸附的选择性，是致瘤专化性致瘤专化性的重要原因，一种根瘤菌或其特定菌系（菌株）只能特异性地侵染其来源寄主和少数其他寄主并诱发根瘤。5.5.共生固氮各阶段的信息传递共生固氮各阶段的信息传递和基因表达和基因表达（2）根毛细胞变形和卷曲）根毛细胞变形和卷曲 有两种mRNA体外翻译蛋白：RH-42和RH-44只在接种后的根毛细胞中得到增强，这两种蛋白质可能和根毛变形与卷曲有关，而根瘤菌能促进根毛细胞发育。RH-42基因的诱导表达和RH-44基因表达的增强需要nod基因产物的存在。 分离纯化的结瘤因子在高于1nmol/L的浓度可以诱导其宿主植物根毛变形。研究

17、表明，结瘤因子的脂肪酸链是其诱导根毛变形所必需的，而脂肪酸链的结构相对来说不是很重要。 对根毛变形和卷曲有关的基因表达的研究主要是，通过比较接种野生型根瘤菌和nodABC突变体的，或者未接种的根毛细胞mRNA的体外翻译蛋白图谱的差异来完成的。（3）侵染和侵染线的形成）侵染和侵染线的形成 随着侵染线向根毛基部生长，在被侵染部位高度液泡化的根皮层细胞被激活，这些活化的细胞进行细胞质重排，形成横跨中央大液泡的辐射状胞质桥，这种胞质桥被认为是“为侵染线通过作准备”，因而被称为前侵染线前侵染线。 侵染线侵染线,即在根毛卷曲部位植物细胞壁局部水解，细胞质膜向内生长，同时新的细胞壁物质沉积在内陷的质膜处，形

18、成一种管状结构。细菌就是通过侵染线传递到根内皮层的植物细胞中去的。 RNA原位杂交原位杂交研究表明，PsENOD12基因特异地在根瘤菌接种后的根毛细胞和含侵染线的根皮层细胞中表达，而PsENOD5基因只在侵染线前部的皮层细胞中表达。ENOD12和ENOD5编码的多肽都含有较高的脯氨酸。 ENOD12多肽的大部分是由重复的Pro-Pro-Gln-Lys-Glu和Pro-Pro-His-Lys-Lys2种五肽单位组成，在该蛋白的N-端有一个可能的信号肽。这些特征表明，ENOD12多肽很可能是富含（羟）脯氨酸的细胞壁蛋白，因此很可能是侵染线和为侵染线形成作准备的细胞壁组成部分。 ENOD5蛋白在其N

19、-端也有潜在的信号肽，它除了富含脯氨酸外，还含有较高的丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸。这表明，ENOD5蛋白可能是一种类似阿拉伯半乳聚糖蛋白的蛋白质，因而ENOD5可能是侵染线壁或膜的组成部分。分离纯化的结瘤因子能诱导与侵染有关的结瘤素基因ENOD12和ENOD5，但不能诱导侵染线形成。 对根瘤菌的诱变研究证明，细菌表面物质在侵染过程中起重要作用。 与EPS, LPS和葡聚糖合成有关的突变体一般不能有效地侵染植物细胞，如纯化的EPS可以与三叶草根瘤菌EPS突变体互补，使该突变体获得形成固氮根瘤的能力。缺少O-抗原的豌豆根瘤菌LPS突变体在箭舌豌豆上形成小的无效根瘤，而且细菌不能从侵染线中释放到植物细胞

20、中去，说明含O-抗原的LPS对细菌的释放是非常重要的。 不能分泌环化葡聚糖的豌豆根瘤菌突变体诱导植物形成小的根瘤，在这种根瘤中只有少量侵染细胞，而且与植物防卫反应有关的基因苯基苯乙烯酮合酶(CHS)基因在侵染细胞周围的细胞中表达了。由此证明：环化葡聚糖在避免植物的防卫反应中起作用。另外，环化葡聚糖也与细菌的渗透适应有关，说明它在为细菌创造适当生长环境中起一定作用。（4）根瘤原基和分生组织的形成）根瘤原基和分生组织的形成 在根瘤菌侵染根毛细胞的同时，根皮层细胞根皮层细胞也被激活并开始细胞分裂。哪些皮层细胞分裂，以及形成什么样的根瘤是由宿主植物宿主植物决定的，而不是由根瘤菌决定的。根内皮层细胞分裂

21、构成根瘤原基，根外皮层细胞被激活形成前侵染线结构。侵染线通过前侵染线向根瘤原基生长并分叉，根瘤原基基部的细胞首先被侵染。而在根瘤原基顶端的细胞则很小，并富含细胞质，构成顶端分生组织。 在根皮层细胞分裂形成根瘤原基时，一些植物基因得到特异性表达，如早期结瘤基因ENOD12、ENOD40。PsENOD12不仅在含侵染线的细胞中表达，而且也在根瘤原基细胞中表达。PsENOD40的表达模式和PsENOD12相似。这2个基因都不在分生组织中表达，所以它们可以作为分子标记来区别根瘤原基和分生组织。除了在根瘤原基的诱导表达外，PsENOD40也在面对根瘤原基的根中柱鞘细胞中表达，因此该基因有可能控制中柱和根

22、皮层之间的物质运输和信息传递。结瘤因子能够诱导根结瘤因子能够诱导根内皮层，特别是对着原生木质部的部分，形成根瘤原基。早期结瘤素基内皮层，特别是对着原生木质部的部分，形成根瘤原基。早期结瘤素基因因PsENOD12和和PsENOD5的表达模式与结瘤因子诱导根瘤原基的形成的表达模式与结瘤因子诱导根瘤原基的形成是一样的。因此，结瘤因子可能是根瘤原基形成和早期结瘤素基因表达是一样的。因此，结瘤因子可能是根瘤原基形成和早期结瘤素基因表达所需的唯一的细菌信号分子。所需的唯一的细菌信号分子。（5）根瘤发育）根瘤发育 在根瘤的生活周期中，分生组织连续不断地向基部分化形成中央组织和外周组织。中央组织是被根瘤菌侵染

23、的组织，而外周组织不是。它包括根瘤皮层、内皮层和根瘤薄壁组织，后者是根瘤维管束存在的地方。 中央组织中央组织 分生组织不断地分化形成根瘤组织，其结果是中央组织含有处于不同发育时期的细胞。据此可将其分为5个区段，即顶端分生组织、固氮前区、间隔区、固氮区和衰老区。 目前为止，分离到的结瘤素基因没有一个只在根瘤顶端分生组织中特异表达。 CHS基因只在根瘤分生组织顶端的一至二层细胞及其附近的根瘤皮层细胞中表达，因此CHS的表达标明了分生组织的上限。 PsENOD12只在固氮前区的上部表达（第1层细胞即达到最高水平），这表明在分生组织和固氮前区之间可以作明确的区分，并可作为分生组织的下限。 而PsENO

24、D5在所有固氮前区的侵染细胞中表达，且在该区的基部达到最高。而PsENOD40则在整个固氮前区具有相同的表达水平。在从固氮前区向间隔区过渡时，以上3个结瘤素基因的表达水平突然降低。 在固氮前区的上部，根瘤菌nod基因表达了，而在其基部不表达。这表明，nod基因在侵染线或刚释放的根瘤菌中是表达了的，进而结瘤因子可能是在根瘤的该区合成的。免疫细胞化学研究证明，该基因编码的蛋白主要存在于侵染线中和刚释放的根瘤菌外膜上，而在固氮根瘤菌中则不存在。 有几个结瘤素基因的表达开始于固氮前区的基部而持续到固氮区，比如PsENOD3、PsENOD14和豆红蛋白基因Lb。PsENOD3和PsENOD14的表达始于

25、固氮前区的上部，在间隔区达到最高水平，而在间隔区向固氮区过渡时表达开始下降。Lb基因在固氮前区的基部开始表达，在间隔区开始时达到最高水平，而且在整个固氮区保持这一水平。 固氮前区向间隔区的过渡是以淀粉积累的开始与根瘤菌基因固氮前区向间隔区的过渡是以淀粉积累的开始与根瘤菌基因ropA和几和几个结瘤素基因表达的急骤下降，及几个晚期结瘤素基因个结瘤素基因表达的急骤下降，及几个晚期结瘤素基因PsENOD6和根瘤和根瘤菌基因菌基因nifH开始表达为标志的。开始表达为标志的。PsENOD6和和nifH的表达始于间隔区的第的表达始于间隔区的第1层细胞，并且一开始就达到最高水平。层细胞，并且一开始就达到最高水

26、平。 尽管已研究过的基因没有一个是特异地在从间隔区向固氮区过渡时表达，但PsENOD3/14mRNA浓度在这时降低。结瘤素基因，如PsENOD6、Lb、根瘤菌基因nifH都在固氮区表达了。 对根瘤衰老机理的分子研究还很不深入，但可能在其他衰老植物器官中表达的基因（如编码水解酶的基因）极可能也在根瘤衰老过程中表达。 外周外周组织组织 大部分结瘤素基因是在根瘤中央组织中表达的，只有2个早期结瘤素基因，即ENOD2和ENOD40在外周组织中表达，其中ENOD2特异地在根瘤薄壁组织中表达。6. 6. 存在问题及展望存在问题及展望6.1 结瘤因子作用机理结瘤因子作用机理 根瘤菌产生的结瘤因子被认为是一类

27、新型的植物生长调节因子，无论是其粗提物还是纯化的组分都具有较为广泛的生物学功能：（1）能诱导根毛变形、分支、卷曲；（2）抑制根的生长，形成粗短根；（3）诱导侵染线形成；（4）苜蓿、豌豆的根瘤菌结瘤因子NodRm, NodR1能诱导根部内皮层细胞分 裂和形成根瘤原基，纯化的NodRm还能继续诱导到形成根瘤，而且在结 构上与菌体感染形成的根瘤相同；（5）增加根系分泌物浓度水平；（6）诱导植物早期结瘤素基因表达，包括ENOD5和ENOD12。 由此可见，结瘤因子的生物学功能大致上涉及了根瘤菌正常侵染过程的各个阶段，但其具体作用机理却不很清楚。 有人认为，豆科植物存在可识别不同结瘤因子的专一性受体专一性受体，但尚缺乏足够的实验证据。新近的研究结果证明：结瘤因子大分子骨架上的不同侧链基团是决定细菌与宿主植物间相互识别的关键因素，根瘤菌细胞中一系列结瘤基因编码能够合成Lipo chito oligosaccharides(LCOs)的各种酶类，进而确