不同工艺条件下肽-紫杉醇包埋体制备时肽对紫杉醇载药量的影响

1、不同工艺条件下肽紫杉醇包埋体制备时肽对紫杉醇载药量的影响阮丽萍，陈会（四川大学化学工程学院，成都，610065）摘要：论文以新型设计短肽ac-pro-thr-phe-lys-phe-lys-phe-glu-pro-nh?为载体材料研究 了肽紫杉醇的包埋体的制备。在包埋体制备过程中使用溶剂挥发法，采取单因索分析法研 究了温度、混合方式、溶剂以及浓度各因素对其包载率的影响。不同实验条件下紫杉醇的包 载率通过高效液相法测定得到。研究表明，使用甲醇作为紫杉醇的溶剂，肽浓度为4mg/ml, 35°c下超声混合加料的方式制备得到的肽紫杉醇的包埋体具有较好的包埋率。关键词：肽；白组装；紫杉醇；包埋

2、；高效液相色谱法中图分类号：tb34the effect of different preparation technology to thedrug-loading rate of paclitaxel in peptide-paclitaxelcomplexesruan liping, chen hui（college of chemical engineering, sichuan university, chengdu, 610065）abstract: tn this work, a novel designed peptide ac-pro-thr-phe-lys-phe-lys-

3、phe-glu-pro-nh? was studied as a carrier for paclitaxel. the peptide-paclitaxel complexes were parepared through solvent volatilization using different temperatures, mixture methods, solvents and concentrations the durg-loading rate of different experiments were detected by hplc the results indicate

4、d that the peptide-paclitaxel complex had better durg-loading rate, which parepared at 35°c, using methyl alcohol as solvent, mixed the peptide （4mg/ml） and paclitaxel by sonication.key words: peptide; self-assembly; paclitaxel; embedding; hplc0引言紫杉醇是一种新型抗微管药物，主要用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、淋巴瘤、脑瘤也有一定的疗效。

5、由于紫杉醇水溶件极差，日前市售的紫杉醇制剂多由聚氧乙烯龍麻汕 与无水乙醇以1： 1的比例为溶媒组成，使用时，经5-20倍生理盐水和右旋糖酊溶液稀释后 静脉滴注2。这类剂型可能引起严重的过墩反应,神经毒性，心血管毒性，胃肠道反应等 副作用。尽管这些毒副作用可以通过预用药加以缓解，但整个用药过程十分不便，严重制约 了紫杉醇在临床上的应用，因此研制无毒性的紫杉醇药物制剂來代替传统剂型应运而牛卩句。阮等设计的两亲性新型肽材料已被证实具有广泛的潜在应川价備6®,如川于药物包埋及控释（.042j,大鼠肝脏快速止血等。两亲性设计肽作为药物包埋体的研究，主要基于一方而设计的多肽町能通过单体的两亲性特

6、点与药物作用、包埋实现対药物分了的增溶，另一方面 由于多肽在体内降解后为氨基酸，可以为人体吸收，无免疫原性等。我们也是基础这些特点， 探索设计肽成为紫杉醇载体材料的可能。在前期的研究屮我们已经证实了紫杉醇能够通过氢基金项目:教育部博士点基金项目（编号:20100181120077）；自然科学基金项目（编号:51003065）作者简介：阮丽萍（1980-）,女，副教授，主要研究方向：纳米功能材料的研'r. e-mail: ruanliping 键和范徳华力与两亲性肽材料发生相互作用，从而影响设计肽的自组装过程。本论文选 择设计肽序列 ac-pro-thr-phe-lys-phe-lys-

7、phe-glu-pro-nh2 （简称 r34）作为代表，该设 计肽具有两亲性特性，并且可以在水溶液中自组装形成纤维结构。论文通过温度、加料顺序、 溶剂及浓度等包埋体制备工艺的研究，探讨了半程匹配电荷短肽r34作为紫杉醇载体材料 的包载率的影响。1实验部分1.1材料和仪器半程电荷匹配短肽 ac-pro-thr-phe-lys-phe-lys-phe-glu-pro-nh2 （简称 r34）采用 fomc 固相肽方法由川抗派德公司（chengdu cp.biochem co.,ltd）代为合成，n端和c端分别采用 乙酰基和酰胺基保护。短肽r34配成lomg/ml储备液，储存于4°c冰箱

8、屮备用。紫杉醉由国 家-药监局提供，其纯度经高效液和分析大于等于98%,实验用水均为二次蒸饰水，试剂均 为分析纯。实验中涉及的仪器冇：高效液相色谱仪（agilent technologies 1200 scricsjp）, 78-1型 磁力加热搅拌器（国华），df-10is集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限公司） kh5200e型超声波清洗仪（昆山禾创超声波仪器有限公司）1.2载药量测定方法本实验采川hplc法进行包埋体中紫杉醉的含虽测定。色谱条件如下：diamonsilcl8（200 nm><4.6 mm ,5 gm）；流动相为甲醇:水=35； 35； 30；流速:1.

9、0ml/min；柱 温:30 °c；检测波长:227 nine以紫杉醇标准品，用乙膳甲醇蒸镭水（35： 35： 30, v： v： v）为溶剂作标准曲线，得标准曲线方程，来计算各方法的载药量。具体为：紫杉醇在包埋体 中的量用高效液相色谱在227 nm条件f,根据线性方程得到的。先将制备好的己挥发完有 机溶剂的包埋体溶液用少量去离子水多次洗涤，并全部定量转移至2ml量瓶中，用去离子 水定容，用0.22 gm微孔滤膜过滤后，进样测量，再由标准1川线计算其浓度。其屮包封率= 包埋在r34屮的质量/投药5x100%,在木实验中市于紫杉醇过量，意义不大。而载药量二 包埋在r34 '|&

10、#39; ptx的质量/包埋体总质量xl00%o1.3制备条件1.3.1温度的影响采用恒温磁力搅拌的方法进行实验。称取一定量ptx,用80%甲醇使其溶解得1.5 mg/ml ptx溶液，移取已制备好的10mg/ml肽r34储备液，用去离子水稀释至1.5mg/ml。 精密量取ptx溶液和r34溶液各1 ml,置于5 ml血清瓶中，加入磁力搅拌子，恒温（20°c, 35°c, 50°c）搅拌4h,在30 °c旋转蒸发，除去甲醇后将剩余物质用少量去离子水转移并定 容至2ml量瓶中。取适量用0.22pm微孔滤牍过滤后，进样测试，再由标准曲线计算其浓度。1.3.2

11、加料方式的影响研究了不同混合方式対载药量的影响。在实验询30 min阶段采用不同的物料混合方式， 分别为：超声，用油相往水相滴加，油相与水相直接混合放入搅拌子搅拌三种方式，其余实 验条件一致，即接下來加入搅拌子同等条件下搅拌三个半小时，然后在30 °c旋转蒸发，除 去甲醉后将剩余物质用少量去离了水转移并定容至2ml量瓶中。取适量用0.22 pm微孔滤 膜过滤后，进样测量，再由标准曲线计算其浓度。1.3.3溶剂的影响研究了不同溶剂对r34对ptx的载药量的影响，分别为80%甲醇和80 %乙醇以及4() %乙jj青为溶剂溶解ptx,在室温下三组同时进行，其余实验步骤参考1.3.1。1.3

12、.4浓度的影响研究了不同肽浓度对ptx的载药量的影响。实验采川常温下，80 %甲醇为溶媒并按照1.3.1步骤，考察质量浓度分别为0.8、2.5、4mg/ml的肽r34对ptx的增溶作用，以此來 判断浓度对制备的影响。2实验结果2.1温度的影响本部分考察了各个温度(20 °c、35 °c以及50 °c)条件下肽r34对紫杉醇的包埋效果。由于多肽在温度过高时易变性，因此我们选用的实验最高温度为50 "co温度对肽对ptx 的包载率的影响列于表1中。从表1可以看出，多肽对紫杉醇具有明显的増溶效果，相较丁 ptx 口身的溶解度，肽的加入将其在水溶液屮的溶解度提高

13、3-5倍。并且随着温度从20 °c 升高到35 °c,多肽的包载率明显増大。但当温度继续升高到50 °c时，包载率却有所下降。 这可能是因为当温度升高时，溶液中分子的热运动增强，ptx分子与r34分子接触机会增 加，较剧烈的分了热运动为r34提供能量，更有利于r34替换原木形成的ptx甲醇分子屮 的甲醇分子，形成r34-ptx复合物，从而提升了 r34对ptx的增溶效果。当温度进一步 提升至5() °c时，由前期的实验研究可知肽r34 口组装能力下降，这可能是影响r34对ptx 包载能力的直接原因，从而最终导致了包载率的下降。表1温度对包载率的影响tab

14、le 1 the inlluence of temperature on the package loading rate反应温度紫杉醇浓度(pg/ml)包载率020 °c0.75761.0135°c134011.78750°c0.942421.2562.2加料方式的影响研究了制备过程屮加料方式对包载率的影响，实验采用了微乳制备方法，具体的制备 研究分逐滴滴加，超声以及直接混合搅拌三种方式。不同的加入方式对ptx包载率的影响 见表2o从表2中我们可以看出，超声的制备效果最好，包载率达1.756 %0。这可能是因为 超声促进了两和间的传质过程，冇利于紫杉醉更好的进入

15、水和与肽r34作用，从而实现包 埋。尽管在很多制备微乳过程比直接混合更有效，但是在木研究中逐滴滴加的制备方法没有 玄接混合搅拌法包载效果好，这可能是由于滴加过程较慢，期间卬醇的挥发使得紫杉醇分子 与水体系中的r34分子相互作用的儿率降低，从而导致了包载率的降低。表2加料方式对包载率的影响tabic 2 the influence of preparation methods on the package loading rate加料方式紫杉醇浓度(pg/rnl)包载率0超声1.317021.756滴加0.506980.676混合0.734750.982.3 溶剂的影响实验考察了 r34 (室温

16、，r34浓度为1.5mg/ml)对不同溶剂体系下(甲醇、乙醇以及乙 月青)的紫杉i惇溶液的包埋效果，包载率如表3所示。从表中可以看到，肽r34对溶于甲醇 的ptx溶液的包载率为0.98 %o要远远高于其在乙醇溶液和乙脯溶液屮，这应该与溶剂木身 性质有关，r34应该更容易从屮醉的ptx溶液中逍换;il ptx分子來形成r34-ptx作川体。 因此在以后的肽包载研究中宜釆用甲醇作为ptx的溶剂。表3溶剂对包载率的彩响table 3 the influence of solvent on the package loading rate反应条件紫杉醇浓度(pg/ml)包载率0甲醇0.734750.9

17、8乙醇0.523570.069乙睛0.45690.062.4浓度的影响实验研究了不同肽浓度(0.6, 1.5, 4.0 mg/ml)对ptx的包载效果的彩响，结果见表4o实验中采用甲醇作为ptx的溶剂。从表屮可以看到，随着r34浓度的增加，肽对紫杉醇 的包载率明显增大。这也许是因为当浓度很低时，肽白纽装形成的纤维比较少，参与包埋的 紫杉醉颗粒也相当较少。当r34浓度增人时，肽口组装能力也显著增加，并能更好地将紫 杉醇包埋起來，而且浓度为4 mg/ml时，肽对紫杉醇的包载率达到了 6.771 %。,说明增加浓 度冇利丁肽对紫杉醉的包埋。表4浓度对包载率的影响table 4 the influen

18、ce of concentration on the package loading rate反应条件紫杉醇浓度(pg/ml)包载率。浓度0.6 mg/nil0.54070.721浓度 1.5 mg/ml0.734750.98浓度4.0 mg/ml5.078116.7713讨论由于紫杉醇的难溶性，我们采川了常川的溶剂挥发法，通过包载率的测定來评价各种 制备方法。首先考虑到溶剂的影响，为了尽可能地避免破坏多肽的生物活性，我们使用了甲 醇、乙醇、乙睹等常见的溶剂，由于甲醇与乙醇小含有oh基i才i,在体系中容易与多肽形成 氢键，因而多肽比在乙膳中更容易进入含紫杉醉的冇机体系，这可能是乙席包载率低的原

19、因。 与甲醇相比，乙醇分子更易形成氮键，在约物以及乙醇与多肽发牛相互作川时，产生竞争作 用，并冃乙醇对于多肽的二级结构有一定的影响，可能直接导致了其相对于甲醇，包载率要 差些。涉及到温度时，当然在35°c时最好，这不仅符合动力学规律，也止好说明了其牛物 活性，温度过低或过高都不利丁蛋口质多肽的止常活性的发挥。对丁制备方式的影响，首先 是混合的程度，山于滴加过程伴随着挥发，所以其混合程度显然不如直接搅拌，但搅拌的力 度显然没有超声强，超声的搅拌湍动作川显然有助于多肽対紫杉醇的包埋。对于肽浓度対紫 杉醇包载率影响可以看到，由于紫杉醇的疏水性，其在水中的溶解度的增加完全借助于多肽 的分散及

20、包埋，当肽浓度越高，其包裹能力就越强，包载率也就越高。此外，cd图显示紫 杉醇的加入对多肽的二级结构冇一定的影响，但影响不大。4结论论文以半程电荷匹配短肽r34为载体材料制备了紫杉醇的包埋体，通过窩效液相法测 足了紫杉酹包载率。在包埋体制备过程中采用了溶剂挥发法，采取单因素分析法研究了温度、 混合方式、溶剂以及浓度各因素对其包载率的影响。研究表明，在本研究中，使用甲醇作为 紫杉醇的溶剂，肽浓度为4 mg/ml, 35°c下超声混合加料的方式制备得到的肽-紫杉醇的包 埋体具有较好的包埋率。参考文献1 pandita d, ahuja a and lather v，et al. deve

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