流式细胞术中免疫荧光染色的质量控制

1、流式细胞术中免疫荧光染色的质量控制(沈阳军区兴城疗养院检验科 辽宁葫芦岛125105)【摘要】流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞牛物学、 细胞遗传学、牛物化学等基础医学和临床医学的硏究中，并提供了成熟的临床常 规检测项目。流式细胞术广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性, 提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。【关键词】流式细胞术；免疫荧光染色；质量控制【中图分类号】r446【文献标识码】a【文章编号】1007-8231 (2016) 15-0026-02流式细胞术己广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准 确度和室间结果的可比性

2、，流式细胞术质量控制越来越受到重视。流式细胞术常 规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样木釆集和处理、免疫荧光染色、 流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可 以确保室内质量控制(iqc)和室间质量控制(eqa)顺利达标。现对免疫荧光染 色的质量控制方法进行分析如下。1.单克隆抗体和荧光素流式细胞术免疫荧光染色分析所用的荧光探针来源于两方面：一是荧光素标 记的单克隆抗体或探针，二是单纯的荧光素。1.1单克隆抗体的选择用于流式细胞术测定的单克隆抗体可分为两类，即直标抗体和纯抗体，前者 指单克隆抗体与荧光素己按比例连接，不需要二次染色即可直接用于流式细胞仪 测定，

3、这类抗体产牛的非特异性结合较少，适于临床常规检测1。纯抗体是指 抗体木身不连接有荧光素，需要在标木制备过程中对抗体进行荧光素标记，乂称 间接染色，间接染色容易产生较多的非特异性荧光信号，可用于研究，但不建议 临床常规使用，除非抗体是明确标志的体外诊断(ivd)试剂或分析特异性(asr) 试剂。1.2抗体组合的原则有些情况下，一种荧光抗体的单一免疫荧光染色(单染色法)不能满足临床检 测的要求，往往需要两种或以上荧光抗体组合染色进行双色或多色分析。如在进 行t4或t8淋巴细胞亚群分析吋，不能采用单一的荧光素标记的cd4或cd8抗 体进行荧光染色，必须将二者与cd3抗体进行组合染色，才能准确通过 c

4、d3+cd4+cd8-和cd3+cd4-cd8+组合抗体检测到的细胞群来分析t4和t8细胞亚 群。1.3单克隆抗体的质量控制(1)ivd抗体和asr试剂是临床常规项目的首选抗体，其特异性、灵敏度、 精密度和适用范围均符合临床常规的流式细胞术检测要求。(2)商品化质控物可以帮助监测部分单克隆抗体的检测效率，现有的商品化室 内质控物主要是针对淋巴细胞系系列抗体、免疫表型分析、cd4绝对计数、cd34 绝对计数及细胞绝对荧光强度的监控。(3)部分抗原在正常或异常细胞上表 达是已知的，因此，实验室可以自做阳性或阴性质控物以检测抗体的质量。2.免疫荧光染色和质量控制2.1细胞膜免疫荧光染色目前，大多数流

5、式细胞术免疫表型分析主要是针对细胞膜表面抗原进行免疫 荧光染色分析，即细胞膜免疫荧光染色。为保证细胞膜表面抗原活性不被破坏和 防止细胞内抗原对膜表面抗原检测的干扰，在进行细胞膜染色时，应特别注意正 确使用红细胞裂解液和淋巴细胞分离液。除非在绝对计数抗原表达量时不能改变 初始细胞浓度，否则，建议红细胞裂解或分离后至少洗涤1次，以减少红细胞碎 片、血小板、血浆蛋h和淋巴细胞分离液对检测的干扰。2.2细胞内免疫荧光染色有些细胞内抗原的表达情况对疾病的诊断和预后判断非常重要，如细胞内髓 性过氧化物酶(mpo)、cd3和cd79a的表达可以帮助白血病免疫分型。采用荧光 索或荧光抗体对细胞内抗原进行免疫标

6、记和分析的方法，称为细胞内免疫荧光染 色。细胞内染色的关键是使细胞膜通透增强但不影响细胞骨架的完整性，细胞膜 通透增强后抗体或核酸染料可以进入细胞内与细胞内抗原进行免疫标记，同时, 抗原与相应抗体的结合力或核酸与染料的结合力不受固定和透膜的影响。皂角素 是目前用于分析细胞内抗原表达的较好的破膜剂，70%冷乙醇作为破膜剂通常用 于荧光染料pi与细胞内dna结合分析细胞倍体和周期时相，但细胞内染色不能 与细胞活性检测同时进行3。某些情况下，当荧光染料分子的颗粒足够小时， 细胞内染色不需要破膜也可以进行，如活细胞染料dapi、to和ao等对细胞内 核酸的染色。3 讨论3.1制备样本的保存为避免荧光淬

7、灭，无论是细胞膜染色还是细胞内染色，整个荧光染色过程和 流式细胞仪测定前都需要避光；染色完成后标本保存在4°c下并尽快在4小吋内 完成测定。如不能在短吋间内测定，可保存在终浓度为1%多聚甲醛溶液中达72 小吋；3.2对照设置对照可以分为两类，一类对照用于设定流式细胞仪的检测阈值，包括同型对 照、空白对照和正常对照等；另一类对照用于监测抗体和试剂的质量及整个实验 过程，类似于质控品，包括阳性对照、阴性对照和正常对照等。同型对照：理 论上是理想的对照，主要用于监测细胞自发荧光和抗体的非特异结合，但实际使 用时同型对照与测试抗体对细胞的标记偶尔会岀现偏差，尤其对表达量很低的抗 原进行细胞计

8、数时；空白对照：主要用于监测细胞的自发荧光，在无法设置同 型对照时，可采用空白对照设置检测阈值，如采用荧光素to对网织红细胞染色 吋。同型对照或空白对照通常在每个实验组进行流式细胞仪测定吋都需要设定, 以本人多年的体会，这两种对照都不是绝对的“对照”，只能作为一种参考，在 某些情况下，如阴性峰和阳性峰分界很清楚时，对照的作用不是很大；阳性对 照和阴性对照：对于某些实验无法得到商品化质控品时，必须设置实验室内阳性 对照和阴性对照用于监测整个实验过程。如针对pnh诊断进行cd55和cd59计 数和针对血小板无力症和巨大血小板综合征进行血小板膜糖蛋白检测时，必须设 置来源于健康人的标本作为阳性对照。正常对照：除具有质控品的作用外，正 常对照在某些实验中也起到设定阈值的作用，如在pi染色进行细胞周期和倍体 分析时，正常淋巴细胞和鸡红细胞的二倍体峰所在位置决定了待测细胞倍体是否 正常或异常。【参考文献】1 何丽容，冯海林.流式细胞仪的保养和常见故障的排除j分子诊断与治疗