当归多糖对人黑素瘤A375细胞黑素合成及抗氧化损伤的作用

1、当归多糖对人黑素瘤a375细胞黑素合成及抗氧化损伤的作用1黑龙江屮医药大学佳木斯学院1540072黑龙江屮医药大学附属第二医院150009摘要fi的：观察不同质量浓度的当归多糖对人黑素瘤a375细胞黑素合成及抗 氧化损伤的作用。方法：以终浓度为1.0mmol/l h2o2作用于人黑素瘤a375细胞， 制备氧化损伤模型。并以当归多糖进行干预，采用mtt法测细胞活力，并测定 黑素含量、tyr活性及氧化应激相关指标。结果：不同浓度的当归多糖处理后, 其细胞活力、黑素含量、tyr活性、t-aoc和sod活性均有所增加，mda含量和 nos活性逐渐降低，以10ug/ml和20ug/ml效果好。结论：当归

2、多糖对人黑素 瘤a375细胞的氧化应激损伤具有保护作用，可能从抗氧化应激角度对口瘢风患 者发挥一定的治疗作用。关键词:当归多糖；人黑素瘤a375细胞；白瘢风1实验材料1.1仪器倒置显微镜（ckx4-a32ph,日本olympus）,全自动酶标仪（680,美国 bio-rad）, facscalibur流式细胞仪（美国bd公司），超净工作台（sw-cj-1f,苏 州工业园区三兴净化科技有限公司），co2培养箱（mco-20aic, 本三洋公司） 1.2试剂与药物当归多糖（cy130421,陕西慈缘生物技术有限公司，纯度≥95%）, t-aoc> sod、mda、nos检测试剂

3、盒（南京建成科技有限公司），mtt （美国sigma 公司），dmem培养基（gibc0公司），胎牛血清（杭州四季青公司），h2o2等其 他试剂均为国产分析纯。1.3细胞株：人黑素瘤a375细胞购白中科院上海生物细胞研究所1.4方法1.4.1细胞培养将人黑素瘤细胞a375放入含10%胎牛血清、100iu/ml青霉素和 100iu/ml链霉素的dmem培养液中，并静置于37°c、5% c02培养箱中常规培养， 2天换液一次，取对数生长期的细胞用于实验。1.4.2细胞氧化损伤模型的制备取对数生长期的a375细胞用于实验，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细 胞，以dmem培养液调整细胞浓度，

4、再置于co2培养箱中继续培养,24 h后取出， 分别加入终浓度为1.0mmol/lh2o2,为下一步实验做准备。1.4.3分组及给药分为6组：正常组、模型组和当归多糖不同浓度组。模型组给予终浓度 为1.0mmol/lh2o2；当归多糖组先给予终浓度为1.0mmol/l h2o2,再分别加入 终浓度为10、20、40、80ug/ml当归多糖；正常组给予相同体枳的dmem培养 液。1.4.4mtt法测细胞活力将a375细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为1.5×104个/ml, 接种到96孔板内，每孔200ul,置于co2培养箱中继续培养24 h后,弃掉培养液， 各组给予相应的药

5、物处理，继续培养48h,每孔再加入5g/l mtt20ul,继续培养4 h后,去掉培养液，每孔加入dmso150ulz缓慢震荡10min,放置酶标仪上在490nm 处测吸光值，以a代表细胞活力。每组设8个复孔，测定3次，取其平均值。 1.4.5黑素含量将细胞密度为1.5×104个/ml的a375细胞悬液接种到24孔板内， 每孔lml,置于co2培养箱中继续培养24h后，弃掉培养液，各组分别给予相应 的药物处理，各组溶液均为每孔lml,继续培养48h,去掉培养液，用pbs缓冲液 漂洗1次,再用0.25%胰酶消化，收集各孔细胞到离心管中，1500rpm离心3min, 去掉上清液

6、，向沉淀加入lmol/lnaoh 100 ul, 37°c放置lh,每孔再加入400 ul 双蒸水将naoh稀释为0.2mol/l,轻微震荡混匀后分别取200ul加入96孔板中, 应用酶标仪在490nm处测a, a表示黑索含量。每组设4个复孔，测定3次，取 其平均值。1.4.6酪氨酸酶活性将a375细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为1.5×104个/ml, 接种到96孔板内，每孔200ul,置于c02培养箱中继续培养24h后，弃掉培养液， 各组给予相应的药物处理，继续培养48h后，每孔需加入l%trion x100溶液looul, 于80°c放置30mi

7、n,室温缓慢溶解，每孔再加入0.2%左旋多巴溶液50ul, 37°c 放置lh,应用酶标仪在490nm处测a, a表示tyr活性。每组设4个复孔，测 定3次，取平均值。1.4.7氧化应激相关酶的测定将细胞密度为1.5×104个/ml的a375细胞悬液接种到24孔板内， 每孔1.5ml,置于co2培养箱中继续培养24h后，弃掉培养液，各组分别给予相应 的药物处理，各组溶液均为每孔1.5ml,继续培养48h,收集各孔培养液，用于aoc、 sod、mda、nos的测定，具体按试剂盒操作说明进行。1.5统计学处理采用统计学分析软件spss17.0处理，所有数据均采用均数&

8、amp;plusmn;标 准差(±s)表示，应用t检验进行显著性分析。2结果2.1当归多糖对a375细胞活力、黑素含量和tyr活性的影响模型组经h2o2处理后，细胞活力、黑素含量和tyr活性均明显比空白 组降低，有显著性差异(p<0.01)o与模型组比较，受到氧化损伤的a375细胞 给予不同浓度的当归多糖处理后，其细胞活力、黑素含量利tyr活性均有增加， 以终浓度为10ug/ml和20ug/ml效果好，有统计学差异，见表2.2当归多糖对a375细胞氧化应激相关酶的影响模型组经h2o2处理后，与空白组比较,t-aoc和sod活性均明显降低, mda含量和nos活性明显增加，有显著性差异(p<0.01),说明造模成功。与 模型组比较，受到氧化损伤的a375细胞给予不同浓度的当归多糖处理后，t-aoc 和sod活性均有所增加，mda含量和nos活性逐渐降低，其中以终浓度为 10ug/ml和20ug/ml效果好，有统计学差异。3讨论当归多糖具有抗氧化、提高机体免疫功能、抗肿瘤等药理活性。本 研究表明：不同浓度的当归多糖处理后，其细胞活力、黑素含量、tyr活性、taoc 和sod活性均有所增加，mda含量和nos活性逐渐降低，其中以1 oug/ml和 20ug/ml效果好。说明当归多糖对人黑素瘤a375细胞的氧化应激损伤具有保护 作