琼脂糖凝胶电泳注意事项实用教案

1、 什么(shn me)是电泳？ 带电颗粒在电场作用(zuyng)下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。 生物大分子如蛋白质,核酸,多糖等大多都有阳离子和阴离子基团,称为两性离子在电场中,带电颗粒向正极或负极迁移,迁移的方向取决于它们带电的符号。第1页/共27页第一页，共27页。按分离原理的不同(b tn)，电泳分为4类: 移动界面电泳 区带电泳 等电聚焦电泳 等速电泳电泳电泳(din (din yn)yn)有几类？有几类？第2页/共27页第二页，共27页。琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，以琼脂凝胶作为(zuwi)支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和

2、分子筛效应，达到分离混合物的目的。琼脂糖凝胶电泳原理琼脂糖凝胶电泳原理(yunl)(yunl)第3页/共27页第三页，共27页。 琼脂糖凝胶电泳的操作(cozu)操作步骤 配胶 点样 电泳(din yn) 成像拍照 EB染色 胶图分析第4页/共27页第四页，共27页。1、配胶 按所要分离的DNA分子的大小，称取适量的琼脂糖粉末，放入锥形瓶，加适量1TAE电泳缓冲液; 然后置微波炉内加热摇匀至完全溶化呈透明(tumng)状，适当冷却后倒入胶托; 胶完全冷凝后放入电泳槽，电泳槽里的缓冲液必须没过胶面。第5页/共27页第五页，共27页。第6页/共27页第六页，共27页。2、点样！根据样品不同可分两种

3、点样体系：A、样品+6Xloading bufferB、样品可直接点样（如ssp）最后(zuhu)记得点marker，并摆正胶的位置第7页/共27页第七页，共27页。点样第8页/共27页第八页，共27页。3、电泳！ 点完样后连接电源，设置(shzh)好电源的参数，开始电泳。当溴酚兰的带（蓝色）的移动至一定长度即可停止电泳。 电压要求：20V/CM胶，在样品出孔用低压（3V/CM，15min），然后调回标准电压，跑出的条带较好。第9页/共27页第九页，共27页。电泳槽第10页/共27页第十页，共27页。4、EB染色 溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射EB-DNA

4、复合物时，出现不同的效应。注意：严格区分污染区和非污染区，不把污染区的物品拿到非污染区，碰过EB的手套(shuto)要及时丢弃！第11页/共27页第十一页，共27页。EB染胶区第12页/共27页第十二页，共27页。5、成像拍照 Tanon-2500数码凝胶图像分析系统(xtng)把图像摄录、处理、打印一体化。采用高分辨率CCD，高质量、高清晰度，保证摄录凝胶图像在低照度下的灵敏 度、不掉失条带。第13页/共27页第十三页，共27页。 Tanon-2500数码凝胶图像分析(fnx)系统第14页/共27页第十四页，共27页。6、胶图分析 以SBT-PCR为例，主要(zhyo)做A、B、DR三个位点

5、，每个位点条带大小不同.第15页/共27页第十五页，共27页。第16页/共27页第十六页，共27页。一、配胶 1.电子称的使用，要时刻注意保持电子称的精确性，保持清洁，根据不同的浓度的胶称琼脂糖。 2.加TAE的量要适当，以免配出来的胶太薄导致胶孔太浅或浓度太低。 3.倒胶前胶托一定要洗干净，并擦干；倒胶时要待胶冷到一定温度摇匀尽量( jnling)不要产生气泡。若胶液的温度太高要顶在胶托防止胶托变形。第17页/共27页第十七页，共27页。二、点样电泳(din yn) 1.96孔塑料板要干净(gnjng)，loading要点均匀，控制在12ul的量，并做好对应标记。 2.加样时，枪头要上紧，吸

6、样均一准确，排液时吸头不要有残留。 3.点完样后及时盖上胶垫，注意不要盖反。 4.点电泳前最好检查待用胶是否合格；点电泳时要对准胶孔，尽量点完所有的样。 5.点完样勿忘点marker并摆正胶位，电泳仪正负极不要插反，电泳槽的盖子要盖紧。第18页/共27页第十八页，共27页。三、EB染色(rns) 1.切胶要准，取胶要稳，泡胶要慎，避免EB溅起。 2.碰到EB的手套要及时丢弃。 3.EB液要适时跟换，盘子要清洗。 4.抹布要严格区分，不可交叉( jioch)使用。第19页/共27页第十九页，共27页。四、Tanon Tanon-2500 数码凝胶图像(t xin)分析仪的使用 1.使用前要注意清洁，以免影响胶图的清晰度。 2.照胶时尽量减少开紫外灯的时间。 3.拍照时先关摄像头再关紫外灯，不可颠倒，严格按照(nzho)照胶的流程进行。 4.照好的胶及时丢弃。第20页/共27页第二十页，共27页。第21页/共27页第二十一页，共27页。第22页/共27页第二十二页，共27页。第23页/共27页第二十三页，