实验一蛋白质变性凝固及沉淀WT实用教案

1、实验(shyn)目的能够说出蛋白质变性(binxng)、凝固反应的原理及实验方法能够说出蛋白质沉淀反应的原理及实验方法能够运用盐析法及重金属沉淀法第1页/共20页第一页，共20页。主要(zhyo)实验内容 蛋白质的加热变性(binxng)凝固 蛋白质沉淀反应 蛋白质盐析 重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂沉淀蛋白质第2页/共20页第二页，共20页。 在某些理化因素(yn s)的作用下，蛋白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起若干理化性质和生物学性质改变的现象。第3页/共20页第三页，共20页。变性(binxng)因素物理(wl)因素高温、高压紫外线、X射线、电离辐射和超声波等化学因

2、素强酸、强碱有机溶剂、重金属盐高浓度尿素、盐酸胍等变性实质：变性实质： 破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、分子量不变）。分子量不变）。第4页/共20页第四页，共20页。变性(binxng)的可逆性可逆变性(binxng)：除去变性(binxng)因素，蛋白质空间结构可以恢复原状。不可逆变性(binxng)：除去变性(binxng)因素，蛋白质空间结构不能恢复原状。消灭病原微生物消灭病原微生物蛋白质制剂的保存蛋白质制剂的保存保护体内蛋白质保护体内蛋白质第5页/共20页第五页，共20页。 蛋白质分子颗粒大小(dxio)1-100nm之间,属胶体

3、颗粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体。原因(yunyn)表面形成水化层表面同种电荷的斥力除去这两个因素，就会发生沉淀。蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。+第6页/共20页第六页，共20页。+-蛋白质胶体颗粒(kl)的沉淀 带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质酸酸碱碱脱水(tu shu)脱水(tu shu)脱水不稳定的蛋白质颗粒 （沉淀）带正电荷的蛋白质 （疏水胶体）带负电荷的蛋白质 （疏水胶体）碱酸（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）-第7页/共20页第七页，共20页。结构结构(jigu)(jigu)和性质都不变和性质都不变适当条件下可重新溶解适当条件下可重新溶解是分离

4、和纯化的基本方法是分离和纯化的基本方法结构和性质都发生变化结构和性质都发生变化沉淀不再溶解于水沉淀不再溶解于水蛋白质的沉淀第8页/共20页第八页，共20页。蛋白质变性沉淀并凝聚成块状称为凝固(nngg)。不可逆变性状态第9页/共20页第九页，共20页。蛋白质变性、沉淀(chndin)与凝固的关系 变性属于蛋白质本质的变化，沉淀和凝固属于一种现象 变性不一定沉淀，变性蛋白质只在等电点附近才沉淀 变性蛋白易于(yy)沉淀， 沉淀蛋白不一定变性 沉淀的变性蛋白质也不一定凝固第10页/共20页第十页，共20页。蛋白质的加热(ji r)变性凝固 蛋白质分子受热作用，分子空间结构变化，疏水基团( j tu

5、n)暴露于分子表面，溶解度降低。 当蛋白质分子不带电荷（处于等电点条件下），则蛋白质发生聚集出现沉淀； 当蛋白质分子带电（处于非等电点条件下），则蛋白质因静电排斥作用而不出现沉淀；第11页/共20页第十一页，共20页。实验(shyn)内容 取三只小玻璃试管，各加入10%蛋白质溶液10d，分别标记为1、2和3号管；向1号管中加入：pH4.8缓冲液10d 。混匀，于酒精灯上缓慢加热至沸点，观察(gunch)变化（ ）；高温下，蛋白质发生不可逆的变性(binxng)并凝固。第12页/共20页第十二页，共20页。2.向2号管中加入：H2O 8d, 0.1mol/L HCl 2d。混匀，于酒精灯上缓慢加

6、热至沸点，观察变化（ ）3.停止加热，向2号管中逐滴加入：0.1mol/L NaCO3 。摇匀后继续(jx)滴加，一旦出现絮状物即停止。4.将2号管于酒精灯上加热，观察现象（ ）5.冷却后，再加入： 0.1mol/L HCl 2d。观察现象（ ）蛋白质变性(binxng)不一定出现沉淀；蛋白质变性(binxng)后在特定条件下发生沉淀；沉淀加热后发生不可逆变性(binxng)并凝固。第13页/共20页第十三页，共20页。3.向3号管中加入：H2O 8d, 0.1mol/L NaOH 2d。混匀，于酒精灯上缓慢(hunmn)加热至沸点，观察变化（ ）；4.停止加热，向3号管中逐滴加入：0.1mo

7、l/L HAC。一旦出现絮状物即停止。5.继续滴加：0.1mol/L HAC 1d。观察现象（ ）6.将3号管于酒精灯上加热，观察现象（ ）7.向3号管中加入： 0.1mol/L NaOH 。一旦出现絮状物即停止。8.将3号管于酒精灯上加热，观察现象（ ）9.冷却后，再加入： 0.1mol/L NaOH 2d。观察现象（ ）蛋白质变性(binxng)不一定出现沉淀；蛋白质变性(binxng)后在特定条件下发生沉淀，并可逆；第14页/共20页第十四页，共20页。蛋白质沉淀(chndin)反应 蛋白质的盐析 一定浓度中性盐 （ (NH4)2SO4、Na2SO4等）可去除蛋白质分子所带电荷及其表面的

8、水化层，从而使蛋白质从溶液中聚集沉淀出来。利用这个原理使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法为盐析。 不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，可以(ky)通过不同浓度盐溶液分离不同蛋白质，就是分段盐析。 大部分蛋白质都可用饱和(NH4)2SO4溶液盐析出来。 某些蛋白质在半饱和(NH4)2SO4溶液中析出。 盐析是一个可逆沉淀反应。第15页/共20页第十五页，共20页。实验(shyn)内容 取一只小玻璃试管，加入2mL蛋白质溶液； 加入等体积饱和(NH4)2SO4溶液，混匀后静置3min。观察(gunch)现象（ ） 对该溶液进行过滤，将滤液收集于一只干净试管中，取部分转入另一只试管中； 向一只试管中加入结

9、晶(NH4)2SO4粉末，直到粉末不再溶解（成为饱和(NH4)2SO4溶液）； 比较两只试管现象（ ）第16页/共20页第十六页，共20页。蛋白质沉淀(chndin)反应 重金属盐沉淀蛋白质 在碱性( jin xn)条件下，重金属离子与蛋白质结合成不溶性蛋白盐而沉淀。 取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液； 加入0.1mol/mL NaOH 2d，混匀； 逐滴加入CuSO4，摇匀，直至出现沉淀为止。第17页/共20页第十七页，共20页。蛋白质沉淀(chndin)反应 生物碱试剂沉淀蛋白质 在酸性条件下，蛋白质可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些(mu xi)酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀，此时蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。 取一只小玻璃试管，加入1mL蛋白质溶液； 加入饱和苦味酸 6d，观察现象（ ）；注意：苦味酸属危险试剂，操作时勿接触皮肤第18页/共20页第十八页，共20页。 实验实验(