定性免疫学检验的性能验证与质量控制PPT课件

1、 CNAS-CL39：2012医学实验室质量和能力认可准医学实验室质量和能力认可准则则在临床免疫学检验领域的应用说明：在临床免疫学检验领域的应用说明： 检验方法和程序的分析性能验证内容检验方法和程序的分析性能验证内容应参考试剂应参考试剂盒说明书上明确标示的性能参数进行验证盒说明书上明确标示的性能参数进行验证，至少应包，至少应包括：括：检出限检出限、符合率符合率（采用国家标准血清盘或临床诊（采用国家标准血清盘或临床诊断明确的阴阳性样品各断明确的阴阳性样品各2020份或与其他分析方法比对）份或与其他分析方法比对），精密度精密度（包括重复性和批间精密度）；并应明确检（包括重复性和批间精密度）；并应明

2、确检验项目的预期用途，如验项目的预期用途，如筛查筛查、诊断诊断、确认确认。一、定性免疫试验的性能验证一、定性免疫试验的性能验证第1页/共46页n筛查试验筛查试验n诊断试验诊断试验n确认实验确认实验nC50C50nC5C5nC95C95性能验证相关概念性能验证相关概念第2页/共46页n一份样本，在多次重复实验中各有一份样本，在多次重复实验中各有50%50%的几率获得的几率获得阳性或阴性的结果时该分析物的浓度。对特定试剂，阳性或阴性的结果时该分析物的浓度。对特定试剂， C50C50一旦确定，是恒定不变的。一旦确定，是恒定不变的。临界点（临界点（C50）浓度的定义）浓度的定义C50第3页/共46页n

3、一份样本，在多次重复实验中有一份样本，在多次重复实验中有95%95%的几率获得阴的几率获得阴性结果时该分析物的浓度。性结果时该分析物的浓度。C5 浓度的定义浓度的定义C5第4页/共46页n一份样本，在多次重复实验中有一份样本，在多次重复实验中有95%95%的几率获得阳的几率获得阳性结果时该分析物的浓度。性结果时该分析物的浓度。C95 浓度的定义浓度的定义C95第5页/共46页n质控品：商用或自备，含阳性和阴性。质控品：商用或自备，含阳性和阴性。nC50C50和和C5C5（C50-20%C50-20%）及）及C95C95（C50+20%C50+20%）浓度样本：）浓度样本：用于用于重复性及最低检

4、出限重复性及最低检出限验证，不少于验证，不少于4040次检测量。次检测量。n临床样本或血清盘：用于临床样本或血清盘：用于准确性准确性验证，不少于验证，不少于5050份份阳性和阴性样本。阳性和阴性样本。性能验证的样本准备性能验证的样本准备第6页/共46页n纯定性试验纯定性试验：采用浓度接近临界值的分析物作为检采用浓度接近临界值的分析物作为检测材料，测材料，不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性检测方法的不精密度。检测方法的不精密度。n量值化定性试验量值化定性试验：以：以COICOI（cut-off Indexcut-off Index）或）或S/COS/CO

5、比值作为分析方法的精密度评价指标。比值作为分析方法的精密度评价指标。（一）不精密度的验证（一）不精密度的验证第7页/共46页n定性测定精密度分析质量指标为定性测定精密度分析质量指标为C5-C95C5-C95浓度区间（浓度区间（亦即亦即“灰区灰区”），），这一区间范围这一区间范围C50C5020%20%。纯定性测定不精密度的评估方法纯定性测定不精密度的评估方法第8页/共46页分析物浓度接近临界值时的不精密度曲线分析物浓度接近临界值时的不精密度曲线第9页/共46页两种不同方法的不精密度曲线比较两种不同方法的不精密度曲线比较第10页/共46页n检测试剂或系统的检测试剂或系统的说明书说明书可能会注明分

6、析物的临界可能会注明分析物的临界浓度，但需验证。浓度，但需验证。n如果临界浓度未知，则可以将阳性样本进行一系列如果临界浓度未知，则可以将阳性样本进行一系列稀释，然后将他们进行重复检测以确定能够获得稀释，然后将他们进行重复检测以确定能够获得50%50%阳性和阳性和50%50%阴性结果的那个稀释度，这一稀释度的分阴性结果的那个稀释度，这一稀释度的分析物浓度即为临界点（析物浓度即为临界点（C50C50）。）。如何获得如何获得 “临界点（临界点（C50）”第11页/共46页n制备评价用样本制备评价用样本 制备制备3 3份样本：一份浓度为份样本：一份浓度为C50C50，一份为，一份为C50+20%C50

7、+20%，一份为，一份为C50-20%C50-20%。 每份样本的体积需保证每份样本的体积需保证4040次或更多次重复检测的次或更多次重复检测的需要。需要。n评价方法评价方法 每份样本检测每份样本检测4040次，确定每一份样本结果为阳性次，确定每一份样本结果为阳性和阴性的百分比。和阴性的百分比。纯定性试验不精密度评价步骤纯定性试验不精密度评价步骤 第12页/共46页-20%-20%+20%+20%浓度范围在浓度范围在C5-C95C5-C95区间之内；用该方法检测，浓度超过区间之内；用该方法检测，浓度超过C50C5020%20%的样的样本检测结果不一致；此结论错误率本检测结果不一致；此结论错误率

8、5% 5% ，需使用更宽浓度范围的样本（如，需使用更宽浓度范围的样本（如30%30%）进行另外的试验。进行另外的试验。 不精密度评价结果判断不精密度评价结果判断-1 第13页/共46页-20%-20%+20%+20%浓度范围包含了浓度范围包含了C5-C95C5-C95区间；用该方法检测，浓度超过区间；用该方法检测，浓度超过C50C5020%20%的样的样本检测结果一致本检测结果一致不精密度评价结果判断不精密度评价结果判断-2第14页/共46页用该方法检测，用该方法检测，C50+20%C50+20%的样本检测结果一致，的样本检测结果一致，C50-20%C50-20%的样本不一定能得到一致的样本不

9、一定能得到一致结果；需要用低于结果；需要用低于C50C50更大百分率浓度的样本（如更大百分率浓度的样本（如-30%-30%）进行补充试验。）进行补充试验。不精密度评价结果判断不精密度评价结果判断-3第15页/共46页用该方法检测，用该方法检测，C50-20%C50-20%的样本检测结果一致，的样本检测结果一致，C50+20%C50+20%的样本不一定能得到一致的样本不一定能得到一致结果；需要用高于结果；需要用高于C50C50更大百分率浓度的样本（如更大百分率浓度的样本（如+30%+30%）进行补充试验。）进行补充试验。不精密度评价结果判断不精密度评价结果判断-4第16页/共46页n有些定性免疫

10、测定，如有些定性免疫测定，如ELISAELISA等，样本的测定结果等，样本的测定结果可以可以COICOI（cut-off Indexcut-off Index）或）或S/COS/CO比值来表示，检测比值来表示，检测系统或试剂厂家会在其试剂说明书中给出试剂的批内系统或试剂厂家会在其试剂说明书中给出试剂的批内和批间变异，这对于对实验室评价试剂的精密度以及和批间变异，这对于对实验室评价试剂的精密度以及评估其室内质控的批间变异结果有参考价值。评估其室内质控的批间变异结果有参考价值。n分为批内精密度评估和批间精密度评估分为批内精密度评估和批间精密度评估数值化定性免疫测定的精密度评价方法数值化定性免疫测定

11、的精密度评价方法第17页/共46页n操作者必须熟悉检测系统工作原理，了解并掌握仪操作者必须熟悉检测系统工作原理，了解并掌握仪器的操作步骤和各项注意事项，应在评估阶段维持仪器的操作步骤和各项注意事项，应在评估阶段维持仪器的可靠和稳定。器的可靠和稳定。n用于评估试验的样本一般常采用临床实验室收集的用于评估试验的样本一般常采用临床实验室收集的血清血清( (浆浆) )样本；当实验室收集的样本不稳定或不易得样本；当实验室收集的样本不稳定或不易得到时，也可考虑使用稳定的、以蛋白质为基质的商品到时，也可考虑使用稳定的、以蛋白质为基质的商品物质，如物质，如校准品或质控品校准品或质控品。精密度评估的基本原则（精

12、密度评估的基本原则（1）第18页/共46页n评估精密度时，应至少评估两个浓度水平样本的精评估精密度时，应至少评估两个浓度水平样本的精密度。密度。n所选样本浓度应在测量范围内有医学意义，即至少所选样本浓度应在测量范围内有医学意义，即至少有有一个浓度在医学决定水平一个浓度在医学决定水平左右，在定性测定，左右，在定性测定，即为即为接近临界水平的浓度接近临界水平的浓度。精密度评估的基本原则（精密度评估的基本原则（2）第19页/共46页n评估方法：三个不同浓度的样本，在一个测试批内评估方法：三个不同浓度的样本，在一个测试批内重复进行至少重复进行至少2020次检测，计算所得次检测，计算所得S/COS/CO

13、值的均值和值的均值和SDSD，计算批内，计算批内CV%CV%。n质量控制：检验时应同时至少测一个质控品。质量控制：检验时应同时至少测一个质控品。n判断结论：应判断结论：应试剂说明书所标明的批内变异。试剂说明书所标明的批内变异。ELISAELISA的批内变异的批内变异CV%CV%应应10%10%。批内精密度的评估批内精密度的评估第20页/共46页n评估方法：三个不同浓度的样本，在评估方法：三个不同浓度的样本，在1010天以上时间天以上时间内单次重复进行至少内单次重复进行至少2020批检测，计算所得批检测，计算所得S/COS/CO值的均值的均值和值和SDSD，计算批间，计算批间CV%CV%。n质量

14、控制：质量控制：n判断结论：应判断结论：应试剂说明书所标明的批间变异。试剂说明书所标明的批间变异。 ELISAELISA的批间变异的批间变异CV%CV%应应15%15%。批间精密度的评估批间精密度的评估第21页/共46页n检测限（检测限（limit of detectionlimit of detection）是指检测方法可检）是指检测方法可检测出的最低被测量浓度，也称检测低限（测出的最低被测量浓度，也称检测低限（lower lower limit of detectionlimit of detection）或最小检出浓度（）或最小检出浓度（minimum minimum detectabl

15、e concentrationdetectable concentration），），有时也称为分析灵有时也称为分析灵敏度敏度（analytical sensitivityanalytical sensitivity）。）。n如前所述，分析物浓度位于如前所述，分析物浓度位于C5-C95C5-C95区间之外（小于区间之外（小于C5C5或大于或大于C95C95）时，候选方法对同一样本的重复性检）时，候选方法对同一样本的重复性检测将得到相同结果。因此，测将得到相同结果。因此，C95C95代表了某一试剂可以代表了某一试剂可以测出的最低被测量浓度测出的最低被测量浓度。（二）检出限的验证（二）检出限的验证

16、第22页/共46页n样本选择：评估试剂分析灵敏度所使用的样本，如样本选择：评估试剂分析灵敏度所使用的样本，如检测项目有检测项目有国家参考品国家参考品，则可使用国家参考品或经国，则可使用国家参考品或经国家参考品标化的参考品进行检测，如没有国家参考品家参考品标化的参考品进行检测，如没有国家参考品，则使用，则使用可以溯源或量化可以溯源或量化的样本，如国际标准物质，的样本，如国际标准物质，或与国际标准物质溯源的样本。或与国际标准物质溯源的样本。n验证方法：处于测定下限浓度（验证方法：处于测定下限浓度（C95C95）的样本，重）的样本，重复检测复检测2020次，应至少有次，应至少有1818次以上为阳性反

17、应。次以上为阳性反应。检出限的验证方法检出限的验证方法第23页/共46页 验证方法及指标：验证方法及指标： 以与以与临床诊断临床诊断、金标准方法金标准方法和和标准血清盘的检标准血清盘的检测测比较来评价，常以比较来评价，常以敏感性敏感性（包括临床敏感性）（包括临床敏感性）/ /特异性特异性（包括临床特异性）和（包括临床特异性）和阳性符合率阳性符合率/ /阴性符阴性符合率合率来表示。来表示。（三）准确度验证（三）准确度验证第24页/共46页n临床敏感性：在患有明确临床疾病的患者中，其检临床敏感性：在患有明确临床疾病的患者中，其检测结果呈阳性或者超过正常值范围的比率测结果呈阳性或者超过正常值范围的比

18、率 （即出现（即出现阳性结果和确定患者患病）。阳性结果和确定患者患病）。n临床特异性：在没有特定临床疾病的患者中，其检临床特异性：在没有特定临床疾病的患者中，其检测结果呈阴性或者在正常值范围内的比率。测结果呈阴性或者在正常值范围内的比率。临床特异性和临床敏感性临床特异性和临床敏感性第25页/共46页n阳性预测值：即测定为阳性的标本实际上为阳性的阳性预测值：即测定为阳性的标本实际上为阳性的可能性。可能性。 =真阳性真阳性/ /（真阳性（真阳性+ +假阳性）假阳性） 100%100%n阴性预测值阴性预测值: :则为一份给出阴性结果的样本实际上则为一份给出阴性结果的样本实际上为阴性的可靠性。为阴性的

19、可靠性。 = = 真阴性真阴性/ /（真阴性（真阴性+ +假阴性）假阴性） 100%100%阳性预测值和阴性预测值阳性预测值和阴性预测值第26页/共46页试剂的检测结果试剂的检测结果 共计共计分析物阳性分析物阳性分析物阴性分析物阴性阳性结果数阳性结果数TPFPTP+FP阴性结果数阴性结果数FNTNFN+TN共计共计TP+FNFP+TNTP+FP+FN+TN敏感性敏感性100%特异性特异性100%阳性预测值阳性预测值100%阴性预测值阴性预测值100%符合率符合率100%TP分析物存在时检测结果为阳性的数量。分析物存在时检测结果为阳性的数量。FP分析物不存在时结果为阳性的数量。分析物不存在时结果

20、为阳性的数量。TN分析物不存在时检测结果为阴性的数量。分析物不存在时检测结果为阴性的数量。FN分析物存在时检测结果为阴性的数量。分析物存在时检测结果为阴性的数量。 FNTPTPFPTNTNFPTPTPFNTNTNFNTNFPTPTPTN敏感性、特异性和阳性预测值、阴性预测值的计算敏感性、特异性和阳性预测值、阴性预测值的计算第27页/共46页n作为筛查试验，检测的作为筛查试验，检测的敏感性敏感性应应95%95%；作为诊断试；作为诊断试验，检测验，检测敏感性和特异性敏感性和特异性均应均应95%95%；作为确认试验特；作为确认试验特异性应异性应98%-99%98%-99%。定性免疫检验项目敏感性、特

21、异性要求定性免疫检验项目敏感性、特异性要求第28页/共46页n如果如果没有可用的诊断标准没有可用的诊断标准，那么需提供待评价试剂，那么需提供待评价试剂与某一已验证方法进行比较与某一已验证方法进行比较的结果，在这种情况下，的结果，在这种情况下，则不能够计算敏感性和特异性，而是计算阳性符合率则不能够计算敏感性和特异性，而是计算阳性符合率和阴性符合率。和阴性符合率。n这种计算反映的并非方法的准确度，而是这种计算反映的并非方法的准确度，而是待评价试待评价试剂和已验证方法的一致性程度剂和已验证方法的一致性程度。阳性符合率和阴性符合率阳性符合率和阴性符合率第29页/共46页待评价试剂与已验证方法相比较进行

22、阳性符合率和阴性符合率的计算待评价试剂与已验证方法相比较进行阳性符合率和阴性符合率的计算阳性符合率和阴性符合率的计算阳性符合率和阴性符合率的计算待评价试剂的检测结果待评价试剂的检测结果已验证方法已验证方法+-+ab- cd共计共计a+cb+d阳性符合率阳性符合率= a/(a+c) = a/(a+c) 100%100%。阴性符合率阴性符合率= d/(b+d) = d/(b+d) 100%100%。 总符合率总符合率=(a+d)/(a+b+c+d)=(a+d)/(a+b+c+d)100%100%。第30页/共46页n第三方质控品第三方质控品n检测系统配套质控品检测系统配套质控品n自制质控品自制质控

23、品质控品的来源质控品的来源二、检验结果质量的保证二、检验结果质量的保证-室内质控室内质控第31页/共46页n基质：应尽量选择基质：应尽量选择人血清基质人血清基质，动物源性的基质由，动物源性的基质由于人体内有大量的异嗜性抗体的存在引起假失控。稀于人体内有大量的异嗜性抗体的存在引起假失控。稀释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水。释液也应用人血清，冻干品复溶可以使用生理盐水。n稳定性：有效期为稳定性：有效期为6 6个月以上个月以上, ,实验室应对有效期进实验室应对有效期进行验证。行验证。质控物的选择质控物的选择 第32页/共46页n质控物数量、实验位置和频次：质控物数量应满足质控物数量、实验

24、位置和频次：质控物数量应满足一个批号至少一个批号至少半年半年的实验量。每分析批至少安排一个的实验量。每分析批至少安排一个弱阳性弱阳性和一个和一个阴性阴性质控质控( (高值阳性血清只用于监控高值阳性血清只用于监控“HOOKHOOK效应效应”) )。检测位置不能固定而应随机放置。检测位置不能固定而应随机放置。n试剂盒所设的试剂盒所设的阴、阳性内对阴、阳性内对照照是用来计算是用来计算CUT OFFCUT OFF值值及有效性判断标准及有效性判断标准，只能在同批号试剂内使用，只能在同批号试剂内使用，不不能作为质控指标能作为质控指标，质控必须是可以监控到不同批号试质控必须是可以监控到不同批号试剂间的变化的

25、剂间的变化的外对照。外对照。质控物的选择质控物的选择 第33页/共46页n 阴性质控品阴性质控品：特定项目人阴性血清混合物（若为：特定项目人阴性血清混合物（若为ELISA质控品浓度宜质控品浓度宜0.5倍临界值左右）倍临界值左右）n 阳性质控品阳性质控品：特定项目人阳性血清混合物：特定项目人阳性血清混合物o ANA 1:1000o anti-dsDNA 1:100或以上或以上o anti-ENA 中强度阳性：若组合式检测，至少有中强度阳性：若组合式检测，至少有2个项目为阳性个项目为阳性质控物的选择质控物的选择 第34页/共46页n 弱阳性质控品弱阳性质控品：o ELISA：临界值：临界值24倍的

26、样本倍的样本o IIF:比临界值高比临界值高1个滴度。特定项目人阳性血清或阴阳个滴度。特定项目人阳性血清或阴阳性血清混合物。性血清混合物。nANA ：1：1001:320 ，ANA荧光模型：均质型，颗荧光模型：均质型，颗粒型，核仁型，或胞浆型等（可以每粒型，核仁型，或胞浆型等（可以每6个月变换，存储质控个月变换，存储质控品至少有品至少有2个模型）个模型）nanti-dsDNA：1:101:32nanti-ENA：低度阳性或：低度阳性或临界值临界值24倍的样本倍的样本（若组合式（若组合式检测，至少有检测，至少有2个项目为弱阳性）个项目为弱阳性）质控物的选择质控物的选择 第35页/共46页1 1

27、收集阳性血清收集阳性血清( (无明显溶血、黄疸、脂血及污染血清无明显溶血、黄疸、脂血及污染血清) )到一到一定量（至少够本室使用定量（至少够本室使用6 6个月以上）；个月以上）；2 2 传染性病原体需经传染性病原体需经5656、1010小时灭活后使用；小时灭活后使用；3 0.2m3 0.2m生物滤膜过滤，去除纤维沉淀物和细菌；生物滤膜过滤，去除纤维沉淀物和细菌；4 4 稀释：用正常人血清稀释；稀释：用正常人血清稀释；5 5 定值：与定值参考品进行对比、求值，无参考品时选择在定值：与定值参考品进行对比、求值，无参考品时选择在2 2- 4- 4倍倍Cut OffCut Off值值附近的阳性值；附近

28、的阳性值；6 6 分装小瓶（每日用量），加盖、贴签，分装小瓶（每日用量），加盖、贴签，-20-20冻存备用；冻存备用；7 7 稳定性及瓶间差评价。稳定性及瓶间差评价。自制质控品自制质控品第36页/共46页n 不同保存条件下：不同保存条件下： 2-8 2-8：CVCV值（滴度符合率）、累计值（滴度符合率）、累计CVCV值（符合值（符合率），稳定期率），稳定期 -70 -70：CVCV值、累计值、累计CVCV值，稳定期值，稳定期 室温：室温：CVCV值、累计值、累计CVCV值，稳定期值，稳定期1 1）均一性评估：同批号质控品随机抽取）均一性评估：同批号质控品随机抽取5 5支支（瓶），（瓶），80%

29、80%符合为合格。符合为合格。2 2）稳定性评估：评估）稳定性评估：评估1 1周，周，1 1月，月，3 3月，月，6 6月，月，1 1年年。有。有效期一般可标定为效期一般可标定为1 1年。年。质控品稳定性的评价质控品稳定性的评价第37页/共46页o纯定性试验：纯定性试验：如免疫印迹、免疫金标等，除膜条如免疫印迹、免疫金标等，除膜条本身的内对照外：本身的内对照外：n 每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两个水平进行质控。个水平进行质控。n 质控判定规则质控判定规则o 阴性质控品的检测结果为阴性阴性质控品的检测结果为阴性o 弱阳性质控品的检测结果为

30、弱阳性弱阳性质控品的检测结果为弱阳性纯定性试验的质控要求纯定性试验的质控要求如：抗如：抗ENA抗体谱检测抗体谱检测第38页/共46页o以滴度或稀释度判定的试验：如间接免疫荧光法、凝集试验以滴度或稀释度判定的试验：如间接免疫荧光法、凝集试验等。等。n 每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两个每检测日或分析批，应使用弱阳性和阴性质控品两个水平进行质控。水平进行质控。n 质控判定规则：质控判定规则：o 阴性质控结果为阴性阴性质控结果为阴性o 弱阳性质控结果在弱阳性质控结果在靶值上下一个滴度或稀释度靶值上下一个滴度或稀释度纯定性试验的质控要求纯定性试验的质控要求如：ANA、ANCA等第39页/共

31、46页o 用数值判定结果的试验：如用数值判定结果的试验：如ELISAELISA等。等。n 浓度：弱阳性质控品浓度宜在浓度：弱阳性质控品浓度宜在2 24 4倍临界值左右，阴倍临界值左右，阴性质控品浓度宜性质控品浓度宜0.50.5倍临界值左右（两个水平）。倍临界值左右（两个水平）。n 频次：频次：ELISAELISA应每板做质控。应每板做质控。n 质控判定规则：至少利用其多规则中一个偶然误差及一质控判定规则：至少利用其多规则中一个偶然误差及一个系统误差规则。个系统误差规则。12s警告，警告，13s和和22s失控失控。数值化定性试验的质控要求数值化定性试验的质控要求第40页/共46页n发现问题发现问题n分析问题产生的原因分析问题产生的原因n采取纠正措施加以改进，进而预防采取纠正措施加以改进，进而预防n验证和追踪验证和追踪 避免同样的问题出现第二次！避免同样的问题出现第二次！失控原因分析及处理失控原因分析及处理第41页/共46页n阳性质控品阳性质控品失控的常见原因失控的常见原因: : 加样不准、温育时加样不准、温育时间不稳定、偶然误差。间不稳定、偶然误差。n阴性质控品阴性质控品的常见失控原因：污染、洗板不干净的