红、黄荷包花原生质体分离文献综述

1、红、黄荷包花的原生质体分离文献综述学院： 生命科学学院年级： 2013级姓名： Molly爱杨洋学号：杨洋一 前言原生质体一词来源于原生质（protoplasm）。原生质指组成细胞的有生命物质的总称，是物质的概念。原生质体是组成细胞的一个形态结构单位。后来发现了原生质，对细胞的认识与Hooke时期不同了，1880年Hanstein提出“原生质体”一词。由于细胞一词的出现较原生质体早，故沿用至今。原生质体由原生质分化形成，具体包括细胞膜和膜内细胞质及其他具有生命活性的细胞器。原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。就单个细胞而言，除了没有细胞壁外，它具有活细胞的一切特

2、征。1960年英国植物生理学家Cocking首次利用纤维素酶等从番茄根细胞分离原生质体获得成功。1971年Takebe等培养烟草叶片原生质体获得再生植株，首次证实了原生质体的全能性。二 主题1 材料与方法1.1 材料红、黄荷包花的种子1.2 方法1.2.1播种及幼苗的培养 精选饱满的荷包花种子，用01升汞表面消毒10 min，再用无菌水洗涤4次，将种子接入12 MS培养基中。置于温度(254-2)。光照度1 000 Ix， 光照1416 hd的条件下培养7 d左右。 1.2.2原生质体分离所用的酶液 CPW为水溶液，含KH2PO4 272 mgL、KNO2 101 mgL、CaCl2·

3、;2HzO 1 480 mgL、Mgso4 ·7H2o 240 mgL、CuSO4·5H2o 0025 mgL，溶解不同质量分数的甘露醇于CPW中成混合液，再将不同质量分数的纤维素酶和果胶酶溶解在混合液中。调节pH值到5.81.2.3 材料处理 用剪子和镊子分别将红、黄荷包花的子叶剪成细条，分别放进建立好的酶液当中进行酶解；1.2.4酶解 设立2,4,6,8,10h酶解原生质体，并用倒置显微镜观察原生质体状态。1.2.5原生质体的收集和纯化。将酶解完全的荷包花的子叶的原生质体分别放入150目、300目的尼龙膜中进行过滤， 去掉网上未能酶解的材料块后移入10mL离心管中离心离

4、心速率为l 000 rmin吸取上层液体于培养皿中去掉离心管底层的沉淀物(破碎后的细胞碎片)；用无菌纸吸去酶液，再用5 mL原生质体培养液洗涤，吸干重复2次，便可得到纯净的原生质体溶液。1.2.6原生质体产量和活力的测定 采用血球计数板测定原生质体的产量；采用伊文斯兰染色法测定原声质体的活力，原生质体活力=（未染色原生质体数/观察的原生质体总数）*100%1.2.7 原生质体分离方法1.2.7.1机械法 由高等植物中分离原生质体的研究最早是Klercker在1892年进行的。当时他所用的主要是机械法把细胞置于一种高渗的糖溶液中，使细胞发生质壁分离，原生质体收缩成球形，然后用利刃切割。在这个过程

5、中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体。在某些贮藏组织中，如洋葱的鳞片、萝卜的根、黄瓜的中皮层、甜菜的根组织等，应用这个方法可由它们高度液泡化的细胞中分离出原生质体。然而，这个方法有明显的缺点：一是产量很低，二是在由分生细胞和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不适用。1.2.7.2 酶解法 1960年，Cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分离原生质体的可能性。他使用了一种由疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液以降解细胞壁。然而，进一步的研究只是到了有商品酶供应之后才成为可能。自从1968年纤维素酶

6、和离析酶投入市场以后，植物原生质体才变成了一个热门的研究领域。 首先用商品酶进行原生质体分离的是Takebe等(1968)。在他们分离烟草叶肉原生质体的程序中，上述两种酶是依次使用的，即先用离析酶处理叶片小块，使之释放出单个细胞，然后再以纤维素酶消化掉细胞壁，释放出原生质体。Power和Cocking(1968)证实，这两种酶也可一起使用。这种“同时处理法”或“一步法”比“顺序处理法”快，并且由于减少了步骤，从而减少了微生物污染的机会。多数研究者现在都使用这种简化的一步法，现在市面上有各种酶制品出售，取决于组织性质的不同，它们可以不同配比搭配使用。三 总结2.1影响原生质体分离的因素虽然已有很

7、多植物原生质体分离取得成功，但并不是在任何情况下均能得到大量活力好、质量高的原生质体。原生质体分离受到较多因素的影响，包括植物的类型、基因型、外植体类型及生理状态和酶液类型及浓度等。2.2再生植株 在过去几十年间，高等植物原生质体培养已经取得了重大成绩，但就若干重要的农作物来说，到目前为止成功还仅限于少数基因型，并且一般而言再生植株的频率也不高。因此尚须不断改进培养基和培养方法，力争克服基因型的局限性并提高植株再生的频率。此外，目前所用的原生质体分离和培养的程序还比较复杂，重复性也不高，所知道的一些有关培养的规律多数只是经验的总结。从这个角度考虑，今后的工作应更注意研究基本规律，并使培养技术系

8、统化、程序化、更简单实用。2.3植物原生质体是遗传转化的理想受体，原生质体能够捕获外源基因、细胞器、染色体及DNA片段，常被用于基因转化、新品种培育或品种改良、新物种的创造等领域。原生质体融合避开了有性杂交过程中的不亲和障碍，在获得种间、属间甚至科间杂种方面均发挥着重要作用。2.4原生质体分离技术的现状由于商品酶的出现，现在实际上已有可能由每种植物组织分离出原生质体，只要该组织的细胞还没有木质化即可。据报道，由以下各种组织中都已分离出原生质体：叶肉细胞，根组织，豆科植物的根瘤，茎尖，胚芽鞘，块茎，花瓣，小孢子母细胞，果实组织，糊粉细胞，下胚轴和培养的细胞等。2.5展望原生质体的分离融合与培育不

9、仅可以转移细胞核中的染色体组、染色体片段，还可转移细胞质中的叶绿体 DNA及线粒体DNA并在一定程度上克服远缘杂 交的不亲和性。配合使用常规育种技术已在多种 作物育种中培育筛选出具有优良特性的种质材料 甚至是创造出自然界不存在的新种质资源。与基因 工程相比通过体细胞杂交途径进行育种具有其独 特的优势主要在于体细胞杂交可以转移基因工程 无法实现的多基因控制性状且不至于造成生物污 染和对人体的潜在危害。随着融合方法、技术的不断探索和改进近年来逐渐发展起来 的亚原生质体融合技术尤其是微核技术可在不同属 植物间定向转移单条或多条染色体实现部分基因 组转移的技术且能获得性状稳定的再生植株。2.6分析与讨

10、论（1）最佳酶组合的确定 将叶片用已确定的最佳预处理时间处理后入不同质量分数的纤维素酶(w=00.5、1.0、1.5) 和和果胶酶(w= 0、03、06、o.9)的cPw酶解 液(含w=10甘露醇)中，pH调至58，振荡(约 30 rmin，25士1，黑暗)6 h，在显微镜下观察原生 质体分离情况，以确定最佳酶组合（2）最佳酶处理时间的确定将叶片用已确定的最佳预处理时间处理后转人 加有最佳酶组合液中振荡(约30 rmin，25±l，黑暗)，设4 h、6 h、8 h、10 h、12 h共5个时间处 理，pH调至58，比较不同处理时间对叶片原生质 体产量、活力的影响，以确定最佳酶解时间四

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