elispot实验方法

1、ELISPOT实验操作指南一、物品准备：动物房：小鼠处死所需材料：75%乙醇，酒精棉，PE手套，记号笔，袋子；取血准备材料： 镊子，标好组别的EP管细胞室： 6孔板3块（按每孔放一组脾）；平皿6套(每2组一套)；剪刀、镊子若干；5ml注射器15个；200目纱网（剪成许多块，一般每组3块，一大一小）；折成四折灭菌。蓝、黄枪头若干盒；液体塑料槽5个以上，排枪2把；离心筒(15ml,50ml)按每组2-3个准备，各30个；吸管（10ml ，5ml） 4-5筒，1.5ep管1饭盒，冻存管1饭盒。离心机 T-75 培养瓶 CO2 培养箱 显微镜 血球记数板 水浴锅 96孔板： 1、ELISPOT板：96

2、孔板-Millipore MultiScreen-HA plate (0.45um Surfactant-Free Mixed Cellulose, Ester embrane#MAHAS4510)，每板可测八组样品，共需2块。 注：头一天晚上照两个台子（一个做CTL一个处理靶细胞）二、所需溶液：1需配制并灭菌液体： RPMI 1640 RPMI-3 R5无酚红RPMI 1640(HyQ, cat no: SH30197.03) DMEM 小牛血清 双抗（青霉素/链霉素） 谷氨酰胺无菌水（500ml）、PBS、PBST 、ACK（上述液体均需足够量并无菌）； 2需确认及领用溶液及试剂：IFN-

3、r抗体（BD公司, purified anti-mouse ifn-r(capture) cat no: 551216, 或51-2525kc）； 一抗 (biotinylated mAb for IFN-gamma, BD公司，cat no: 551506)；二抗（BD公司, streptavidin-HRP concentrate A，cat no: 51-9000209(557630)）；ficoll-paque（Amershan公司或GE Healthcare公司，17-1440-02）； 裂解液(10X)：试剂盒中带 或 9%（v/v） Triton X-100 ；trypan bl

4、ue； elispot染色液（AEC substrate set, cat no: 551951, 20ul的chronogen加入到1ml的AEC substrate溶液中)； 洗涤缓冲液（PBS-T）； 稀释缓冲液（PBS+10%FBS）； 终止液（试剂盒带）：1M 醋酸（取醋酸57ml，加水至1L）。醋酸密度1.0492g/ml，分子量60.05。附：ACK裂解缓冲液配方：8.29 g NH4Cl (0.15 M)；1 g KHCO3 (10.0 mM)；37.2 mgNa2EDTA (0.1 mM)加800 ml 水，用1 N HCl 调pH 到 7.2-7.4；加水定容到1升。0.2

5、-目的过滤除菌储存于室温。PBS配方：8g Nacl, 0.2gKcl, 1.44gNa2HPO4, 0.24gKH2PO4, 加H2O 至 1升调PH7.2。四、脾细胞分离准备：ACK提前取出放室温。2个50ml离心筒，1个H2O（灭），1个70%酒精。1. 拉颈处死C57小鼠，死后小鼠分组记号，75%酒精浸泡后拿入细胞室准备取脾（有条件者可于取脾前将动物房紫外线杀菌）； 2. 无菌操作取脾，尽量将结缔组织去除。将脾放在含有RPMI-3培养基的六孔板中，每组脾放置在一个孔内，作好标记。3. 将脾放置纱网中于预先放好RPMI-3培养基的平皿内，用纱网包裹脾用5ml注射器内塞研磨。用一新纱网再过

6、滤一遍至50ml 离心桶（作好分组标记），用4 ml RPMI-3洗涤培养皿，如果必要重复操作。每个脾加入3 mlRPMI-3培养基，终体积约15ml。4. 20C，200 g 离心10 min，去除上清。用RPMI-3培养基重悬细胞沉淀，再加入红细胞裂解液(ACK 缓冲液)每个脾加2-3ml（培养基与ACK 缓冲液比例为1：2）室温放置5 min，时而振动。5. 20C，200g 离心10 min。裂解好的细胞沉淀应呈乳黄色，如果红细胞裂解不彻底可重复裂解。20 ml R-5培养基重悬洗涤2次，20C，200g 离心5min。最后用7.5ml无酚红R-5培养基重悬（此步开始用无酚红培养基R5

7、）。若不做脾细胞分离试验，则此时用2ml培养基重悬。6. 用滤网再过滤一遍。7. 午休吃饭。8. 脾细胞计数：i 一般情况5只鼠脾细胞应稀释至少100倍再计数，990ul PBS+10ul 细胞。ii 取20 ul 的细胞加入到20 ul的Trypan Blue里。iii 在血球计数器上加入20 ul混合液。iiii 计4个方格中白色细胞总数(查上不查下，查左不查有)，细胞密度（cells/ml） =4个方格中白色细胞总数/4*2* 1049. 用RPMI-5(无酚红)培养基稀释脾细胞至1×107 cells/ml 10. 再计数一遍，检查是否达到稀释浓度。若差别大，重新稀释。七、E

8、LISPOT实验ELISPOT 操作规程第一天（杀鼠取脾前一天）1抗体包被板：用IFN-gamma 抗体包被elispot 96-孔板。在5ml PBS 中加入1mg/ml的IFNr R4-6A2 (Pharmingen-18181D)25 ul,使浓度达5ug/ml，每孔加入50 ul。加盖 4过夜。（一块96孔板需5ml）第二天 (杀鼠取脾)操作过程如CTL中脾细胞分离相同2封闭弃去包被抗体，用含10%胎牛血清的完全培养基(RPMI-10)洗涤一次，每孔加入200ul完全培养基，加盖于室温封闭2小时或37 1小时,弃去培养基。3细胞激活（1）每个组设2个副孔，每个孔加入100 ul 的 1

9、×107 淋巴细胞。（2）实验组每孔加入100ul A42多肽 (终浓度为1ug/ml 储存浓度1 ug/ul，应为1：500稀释)。0.2ul/100ul，共需要5ul肽加到2.5ml培养基。 30（3）对照组每孔加入100ul培养基。 3（4）阳性对照每孔加入小鼠 IFN-gamma。3（5）阴性对照加入培养基。 3混匀于37,5% CO2 培养箱中培养24小时。第3天 (ELISPOT 试剂盒R D cat #EL485)4ELISPOT 试剂盒操作（1）用无菌水洗板2次，用1X 洗涤缓冲液或PBST洗涤6次，每次洗涤时浸洗12 min。（2）将抗体(biotinylated

10、mAb for IFN-gamma) 加至12ml（10组量）的稀释缓冲液1中，终浓度为2ug/ml。（3）每孔加入50ul 上步混合液。（4）4 过夜或室温2小时。第4天（也可于第3天当日做完）5洗涤显色1）用1X 洗涤缓冲液或PBST洗涤3次。2）将Streptavidin-HRP concentrate A （BD公司）加至稀释缓冲液比值为1：100。每孔加入50 ul混合液。3）室温培养2小时，或4C过夜。4）用PBST洗涤4次。5）用PBS洗涤2次6） 每孔加 50 ul elispot染色液（AEC substrate set, cat no: 551951, 20ul的chron

11、ogen加入到1ml的AEC substrate溶液中)。7）避光室温放置5-60分钟。8）弃去染色液，用蒸馏水洗涤9）室温空气干燥2小时或过夜干燥，保存数据。体外细胞杀伤实验荧光比例测定法CTL（1）靶细胞的准备：培养与BABL/c实验鼠组织相容性的P815（CT26）细胞。5ml 1640（DMEM）培养基调整P815细胞为2×106个/ml，加表位肽25ul(1ug/ml)标记；5ml 1640（DMEM）培养基调整P815细胞为2×106个/ml，不加表位肽。37孵育2小时以上，经常振动，使得充分接触。靶细胞五倍以上过量。离心，用5ml无血清1640培养基重悬细胞。

12、（2）靶细胞的标记：高浓度的CFSE （5uM）标记的孵育表位肽的P815细胞，低浓度的CFSE（0.5uM）标记的不孵育表位肽的P815细胞。*注：CFSE稀释说明：CFSE 贮存液浓度是10mM每管15ul分装。使用时先稀释50倍，稀释方法是贮存液中加入735ul无血清的1640，此时其浓度为200uM。高浓度标记时，将200uM CFSE稀释液再稀释40倍，方法是5ml靶细胞中加入125ulCFSE低浓度标记时，将200uM CFSE稀释液再稀释400倍，方法是5ml靶细胞中加入12.5ulCFSE37孵育10-15min，每3-5min混匀细胞。用等体积冰冷小牛血清中止2-5 min,

13、以R-3洗2次，200g离心细胞5min，最后分别用10mlR-5培养基重悬并且记数（靶细胞浓度变为1×106个/ml）。整个洗涤及离心过程中要注意避光。（3）效应细胞的准备：取分离好的脾淋巴细胞，调整浓度并计数。（4）效应细胞与靶细胞的混合：按照效应细胞：靶细胞=10：1的比例进行混合。每个实验组取用高浓度的CFSE （5uM）标记的孵育表位肽的P815细胞8×104个（80ul的1×106个/ml靶细胞），用低浓度的CFSE （0.5uM）标记的不孵育表位肽的P815细胞8×104个（80ul的1×106个/ml靶细胞），效应细胞加入 10

14、×105个（160ul的1×107个/ml的脾细胞）。（5）200g, 离心4min，使靶细胞和淋巴细胞充分接触，37培养，杀伤8-10小时。（6）收集细胞，并且用含有1%FBS的PBS清洗重悬，进行流式细胞仪检测。实验组方法：对照：1， 单独脾细胞-分门2， 单独P8153， 无肽P815 8×1044， S1肽P815 8×1045， S5肽P815 8×1046， M1肽P815 8×1047， 无肽P815 8×104；S1肽P815 8×104-使荧光比例为1:18， 无肽P815 8×104；S5肽P815 8×104-使荧光比例为1:19， 无肽P815 8×104；M1肽P815 8×104-使荧光比例为1:1实验组： 无肽P815 8×104；S1肽P815 8×104，PBS组脾16×105 无肽P815 8×104；S5肽P815 8×104