OCTET相互作用系统理论与实验设计培训

1、Better Lives. Better Planet.SMThis presentation is the Confidential work product of Pall Corporation and no portion of this presentation may be copied, published, performed, or redistributed without the express written authority of a Pall corporate officer 2014 Pall CorporationOCTET相互作用系相互作用系统统理理论论与

2、与实验实验设计设计培培训训培培训训人人 :陈陈涛涛应应用用经经理理2Agenda生物膜干涉技术原理与动力学基础OCTET相互作用仪的大体应用生物分子的固化与传感器的选择结合解离的注意点和数据分析再生条件的摸索定量分析3Octet平台组成4Fiber optic rodReference layerForteBio传传感感器的基本构造器的基本构造固化方式与固化（检测）物质的不同，创造出了不同传感器。5 当一束可当一束可见见光从光光从光谱仪谱仪射出后，在射出后，在传传感器末端的光学膜感器末端的光学膜层层的两个界面的两个界面会形成两束反射光会形成两束反射光谱谱，并形成一束干涉光，并形成一束干涉光谱谱

3、。 任任何由于分子何由于分子结结合而形成的膜合而形成的膜层层厚度厚度变变化，能够通化，能够通过过干涉光干涉光谱谱的位移的位移值值而体而体现现。 生物膜干涉技生物膜干涉技术术（ （Bio-Layer Interferometry ， ，BLI） ）6Biolayer Interferometry (BLI)Application of white light interferometry in monitoring molecular interactionsWhite lightConstructive interferencePartially constructive interferen

4、ceDestructive interferenceInternal Reference (reflection surface 1)Interface with Liquid (reflection surface 2)Relative IntensityWavelength100%07Interferometric Pattern Changes withIncreased Molecular ThicknessRelative IntensityWavelength100%08干涉光谱位移-时间曲线图可以提供动力学参数Distance between the two reflecting

5、 surfaces = Intensity =(, )Function of density and optical thicknessRelative IntensityWavelength (nm)100%0nm shiftTime9Octet仪仪器中内部主要器中内部主要结结构构10BufferLigand-Biotin(ligand)Protein of Interest(analyte)Binding (nm)Time BaselineLoadingBaselineAssociationDissociation一次检测8个通道所有数据是实时的反应的时间，位置，转速，温度，步骤可以自行设

6、定Baseline, Association和Dissociation三步对于计算动力学参数KD值是必须得。Octet BiosensorsOctet平台平台动动力学力学检测检测自自动动化流程化流程11R=R0+Rte-kd*tR=R0+Req(1-e-kobs*t) A(ligand) + B(analyte) AB kakdKD = kdka 1:1 binding模型模型:ka = 结结合合常常数数，Konkd = 解解离离常数，常数，Koff动力学参数的计算Kobs=Ka*B+Kd，表观结合常数Req为一定analyte浓度下的平衡信号，相当于无限长结合时间的最终信号。Rt为解离起始的

7、信号。12简明操作仪器传感器样品程序设定(acquisition software)测试数据分析（analysis software）Warm for 30minHydrate(prewet) for at least 10minPrepare sample plate and warm it to RT.13有奖问答下面哪些说法是对的？A 生物膜干涉技术的光源是可见光B 动力学检测可以获得Kon,Koff,KD;亲和力检测只能获得KDC 生物膜干涉技术的信号只和传感器表面的结合分子的厚度相关D 主要根据结合曲线的信号来进行浓度定量E 如果没有分析物浓度信息，无法获得Kon,Koff,KDF

8、动力学常数和浓度无关14Agenda生物膜干涉技术原理与动力学基础OCTET相互作用仪的大体应用生物分子的固化与传感器的选择结合解离的注意点和数据分析再生条件的摸索定量分析15功能功能动力学（kinetic） 浓度测定（Quantitation）Yes or NoAffinity(KD)Kinetic(Koff,Kon,KD)16Octet平台上应用的生物分子范围CellsBacteriaVirusIgMIgAIgG, IgD, IgEAntibody FragmentsProteinsPeptidesNucleotides (DNA)Small MoleculesAtoms200 nm100

9、0 nm0.1 nm11,000100,0001,000,00075 nm150MWSize7 nm1 nmBacteriaVirusAntibody - AntigenReceptor - LigandDNA - DNA DNA - ProteinAntibody Fragment - AntigenAntigen Fusion ProteinAntibody - PeptideMultiple Antibody PairingsAntibody - Small MoleculeProtein - Small Molecule17OctetOctet仪器系统对于科研用户的应用仪器系统对于科研

10、用户的应用 非标记（直接的）、实时在线、快速地对样品进行测定 与其他分子相互作用检测方法（双向电泳，FP，Co-IP，Western Blot，HPLC，ELISA，NMR，ITC，晶体衍射等 ）互补，BLI技术更快更直接 可以fishing蛋白，洗脱后用电镜观察 分子结合模式研究，信号传导通路，药物靶点，蛋白晶体筛选， DNA aptamer 筛选，蛋白/多肽/分子抑制协同实验，蛋白突变体，膜蛋白受体研究等涉及所有分子相互作用的应用 基于相互作用的分子活性研究 表达产量的预估18Agenda生物膜干涉技术原理与动力学基础OCTET相互作用仪的大体应用生物分子的固化与传感器的选择结合解离的注意

11、点和数据分析再生条件的摸索定量分析19固化物质的选择 有tag（GST，Fc,his,FLAG，biotin）的蛋白优先作为固化物质，但是分析物不得含有相同的tag。 如果需要获取KD值，分析物需要清楚分子量和浓度，否则做为固化物质。 含有多个结合位点的物质优先作为固化物质 实验的简易性，比如A蛋白需要和很多蛋白相互作用，则将A蛋白进行固化 不易获取高浓度的物质优化作为固化物质，比如RNA,DNA，多糖等。 容易和传感器发生非特异性反应的物质作为固化物质20用于动力学检测的传感器种类固化物质种类固化物质是否需要纯化固化方式Streptavidin (SA)生物素标记物质是biotin-avid

12、inSuper Streptavidin (SSA) 生物素标记物质是biotin-avidinAmine Reactive (AR)含有氨基物质是化合键Aminopropylsilane (APS) 疏水物质是疏水作用，静电作用Anti-hIgG Fc Capture Surface (AHC)人免疫球蛋白（含Fc）否Ag-AbAnti-MIgG Fc Capture surface(AMC)鼠免疫球蛋白（含Fc）否Ag-AbAnti-GSTGST tag否Ag-AbNTAhis Tag否NTA-HisAnti-Human Fab-CH1 (FAB)CH1否Ag-Abanti-Flagfla

13、g否Ag-Ab直接固化抓取固化每种传感器都有其说明书！21Capture Based vs Direct Immobilization抓抓取固化取固化直直接固化接固化AR or Streptavidin 传传感器感器 优优点点: 非非常常稳稳定的固化定的固化 所所有蛋白都可以有蛋白都可以进进行固化行固化 缺点缺点: 需需要要纯纯化的蛋白化的蛋白 无无序的固化序的固化 产产生共价生共价键键，可能，可能对对蛋白活性有影响蛋白活性有影响 再再生生时时需要考察固化蛋白的耐受性需要考察固化蛋白的耐受性AMC， ，AHC传传感器感器结结合抗体合抗体Fc 优优点点: 不不会会产产生共价生共价键键，易于保持蛋

14、白活性，易于保持蛋白活性 可可以固化在粗以固化在粗样样品的蛋白品的蛋白 固固化的有序性化的有序性 将固化蛋白与分析蛋白一并再生，回到将固化蛋白与分析蛋白一并再生，回到传传感器感器原始状原始状态态 缺点缺点: 固化的密度少于前者固化的密度少于前者 固固化化稳稳定性弱于前者定性弱于前者ONHONH22Biosensor selectionCapture chemicalcouplingabsorbance AHCAMCAnti-GSTAnti-FLAGNTAproAproGAnti-CH1Streptavidin AR2G APSSSA biosensor is best for small mo

15、lecule measurement.23固化的注意要点 蛋白浓度10-30ug/ml 蛋白固化稳定：在固化后的baseline必须稳定（0.05nm/min） 蛋白固化信号1nm 固化到最大信号的80%（结合曲线开始弯曲时） 如果测试小分子（分析物），最好使用SSA传感器，蛋白固化信号越大越好 固化缓冲液氨基偶联：pH比PI小0.5-1pH，且不得有其他含有氨基的物质APS疏水偶联：不得含有去污剂固化固化后的basline，需要稳定！24特殊物质的固化 DNA/RNA的固化：合成时带上生物素，然后用SA传感器固化。 多糖：可以利用氨基或者羧基，偶联在AR2G或者APS传感器上，也可以通过生物

16、素化进行固化 多肽：合成时带上生物素，然后用SA传感器固化 半抗原：APS传感器疏水固化 酸性蛋白：APS传感器疏水固化 化合物：固化非常困难，一般合成时带上生物素 纳米材料：APS传感器疏水固化 病毒：APS传感器疏水固化，或者生物素化用SA传感器固化 脂质体： APS传感器疏水固化 其他多聚物：利用氨基，羧基或者醛基固化在AR2G或者APS传感器上25有奖问答固化的好坏需要考察哪些因素A 固化越牢越好B 固化物质在固相上的方向一致性要好C 易于再生D 固化密度越高越好E 使用氨基固化的时候，固化物质不得含有其他含有氨基的物质F 使用生物素固化的时候，生物素固化试剂与蛋白的摩尔比需要大于32

17、6Agenda生物膜干涉技术原理与动力学基础OCTET相互作用仪的大体应用生物分子的固化与传感器的选择结合解离的注意点和数据分析再生条件的摸索定量分析27结合解离注意要点 Baseline,association,dissociation的缓冲液（基质）必须一致（非常重要） 必要的時候在association的緩沖液中添加BSA和去污剂，盐等以去除非NSB。（0.02%tween20,0.1% BSA,PBS pH7.4），但是固化物质是脂质体时，不得加入去污剂。 一般需要对非特异性进行考察，即观察没有ligand的传感器直接与analyte直接作用的信号是否可以忽略 结合步骤一定要加入ref

18、erence well（0浓度，即只有缓冲液）28预实验 确立每步的大概时间。 观察固化是否成功，是否牢固。 观察分析物是否有结合。 观察是否有非特异性结合。ligandanalyte宽泛的浓度检查非特异性结合有信号，并且有浓度依赖性大大高于分析物与传感器本身的信号则说明有特异性结合！29预实验（单浓度实验）Binding (nm)Time BaselineLoadingBaselineAssociationDissociation5-10min,可以手动调节有曲线出现一定要达到平衡，斜率0.02nm/min，5-10min最高浓度需要有曲线状，5-10min有明显的解离.5-30min.1-

19、2分钟，判断传感器结合曲线是否有异常30如果发现非异性吸附？主要是由于分析物和传感器上基质结合导致。 颠倒分析物和固化物 更换传感器 更换缓冲液，加入更高浓度的去污剂或者盐 检查一下分析物中是否含有其他物质Capture 传感器SA传感器AR2G传感器APS传感器31分析物浓度选择如果要获得准确的KD值，需要检测至少4个适合的浓度。最佳的浓度范围是10-20*KD 到 0.1*KD值,有良好的分散性。如果不知道浓度范围，可以在预实验中尝试宽泛的浓度范围，比如10倍梯度稀释，比如10nM,100nM,1000nM最高浓度结合曲线需要出现适中太高太低32数据处理-图形处理原始数据处理后数据1.as

20、sociation/dissoication步骤的提取2.起始信号的归零3.reference well的扣除4.reference sensor的扣除5.“gap”的调整Reference well:association 步骤为零浓度（buffer），但是与其他传感器一样loadingReference sensor:well:association 步骤为测试浓度（buffer），无 loading33数据处理-拟合分析Local fitting&global fittingLocal fittingglobal fittingLocal fitting:computes kin

21、etic constants for each curve Global fitting:an analysis includes all of the binding curve data in the group and generates kinetic constants for the entire group 拟合之前先去掉一些没有信号的曲线！34如何判定数据是否可信目测拟合曲线与实测曲线较为一致（1:1拟合），拟合曲线贴近实测曲线R2 和2 值的考察 R2 表示拟合曲线与实测曲线的相似度，越接近与1越好，一般要求大于0.95. 2表示了拟合曲线与实测曲线的误差，越小越好。计算的误

22、差值，应该比计算值小一个数量级（比如Kon值为105，那么Kon error应该小于104）。35如果发现拟合的不好？拟合曲线与实测曲线差别太大，则说明获得KD值不准确计算方法：去掉一些高浓度点进行拟合。实验改进：将含有多个结合位点的物质进行固化优化缓冲液，加入更高浓度的去污剂和盐，DTT有可能本身就不是1:1结合！36小分子（4nm）,一般固化使用SSA传感器 小分子的亲和力比较低（uM级别），分析浓度比较高，起始浓度100-200uM 必须做reference sensor,并进行双扣除Sensor and sample plate layoutSetting in data proces

23、singSetting in processing data analysis37Agenda生物膜干涉技术原理与动力学基础OCTET相互作用仪的大体应用生物分子的固化与传感器的选择结合解离的注意点和数据分析再生条件的摸索定量分析38快解离 如果解离的比较快，而且可以回到与结合前baseline相同的信号水平，说明传感器的分析物充分脱落，不需要加入额外的再生试剂进行再生解离后回到起点结合起点传感器可以进行下一个分析物的测试。39传感器的再生再生再生回回到原始到原始传传感器感器固固化抗体化抗体结结合抗原合抗原原原始始传传感器感器再生再生固固化化分析物分析物结结合合原原始始传传感器感器SA传感器的

24、再生Capture method:Direct method:40再生效果验证KD (M)Kon(1/Ms)Kdis(1/s)3.66E-093.97E+051.45E-033.45E-094.06E+051.40E-033.75E-093.89E+051.46E-033.94E-093.84E+051.51E-033.99E-093.77E+051.50E-03Full assayCycle 1Cycle 2Cycle 3Cycle 441Ligand or analyte?One-shot assayFull kinetic assayregenerationMultiple cycles

25、Capture or chemical couplingBiosensor selectionThe number of samplesWhether the conc. is known?Crude sample or not?Is loading step successful and stable?Is there binding?Concentration range for full kinetic assaydissociation is fast or slowIs there any NSB?Whether fitting is good or not?By witnessX2

26、,R2Koff errorSignal decayKD valueCommercial capture biosensors can ignore this step42有奖问答下面哪些说法是正确的A 分析物缓冲液一般需要加入去污剂B 分析物浓度范围需要适当才可以获得准确的KD值C 分析物每个浓度的结合曲线需要达到平衡D 在拟合KD值前，需要对没有信号的结合曲线进行剔除E 基于氨基偶联方式传感器再生完毕后的需要再做固化F 非特异性是指分析物与传感器本身的结合43Agenda生物膜干涉技术原理与动力学基础OCTET相互作用仪的大体应用生物分子的固化与传感器的选择结合解离的注意点和数据分析预实验的

27、重要性再生条件的摸索定量分析44定量传感器的选择测定物质一般方法测定范围高灵敏度方法测定范围是否可以再生Anti-Human IgG Fc（AHQ）人免疫球蛋白所有亚型1-100ug/mlN/A否Anti-Murine IgG (Fab)2(AMQ)鼠疫球蛋白所有亚型1-100ug/mlN/A否Protein A不同种属不同亚型免疫球蛋白1-700ug/ml0.05-300ug/ml是Protein G不同种属不同亚型免疫球蛋白1-700ug/ml0.05-300ug/ml是Protein L不同种属不同亚型免疫球蛋白1-700ug/ml0.05-300ug/ml是NTAhistag蛋白0.5-1000ug/mlN/A是Anti-GSTGST蛋白0.25-2000ug/ml0.1-200ug/ml是Anti-Human Fab-CH1 (FAB)FAB0.25-2000ug/mlN/A是anti-flagflag0.25-2000ug/mlN/A