细胞生物学研究技术

1、细胞生物学研究技术课程论文题 目: 逆境胁迫下植物细胞的生理变化的测定 姓 名: 尹新强 学 院: 生命科学学院 专 业: 植物学 班 级: 一班 学 号: 2014116001 导 师: 蔡庆生 2014 年 12 月 8 日逆境胁迫下植物细胞的生理变化的测定摘要：植物在生长发育过程中往往会受到不良因素的影响，包括各种生物胁迫以及非生物胁迫，植物自身为了生存必须抵抗这些不良条件，或是适应这种条件。由于植物种属的差异性，不同植物的抗性不同，为此研究植物的逆境胁迫，对于种质资源的选择，不良环境的生态修复都具有重要意义，为此本文主要根据自己所在实验室的研究内容简单介绍在各种非生物胁迫下，植物的渗透

2、势、细胞膜损伤、活性氧的生理变化。关键字：逆境 胁迫 渗透势 膜损伤 活性氧 一、逆境胁迫下植物细胞的生理变化 一般植物要完成从种子然的萌发、生长、运动、开花、结果等生长发育过程，需要充足的水分、矿质营养，适宜的光照、温度和足够的氧气等环境条件。然而在自然条件下，各地所处的地理位置、气候条件、病虫害及由于工农业发展所带来的环境污染等情况的差异，即使同一地区，一年也有冷热旱涝之分。植物常常生活在多变的环境中，同动物相比，植物的空间位移比较差。植物在生活的环境中常常遭受到不良环境的袭击。因此植物在生长过程中几乎不可避免要受到不良环境的影响，譬如干旱、高盐、高温、低温、冷冻、病虫害、重金属、辐射、大

3、气污染有时这种影响是严重的甚至是致命的。因植物种类不同，植物会有不同的表现，有的能够生存，有的则受害致死。农业生产在我国具有十分重要的地位，为此研究植物在逆境胁迫下的生命活动规律，特别是逆境胁迫下抵御不良环境的生理分子机制，就显得十分重要。逆境胁迫胁迫下植物生理代谢会发生变化，众多研究表明植物在干旱、高盐、低温等胁迫下，都会产生水分亏缺现象。植物吸水减少，蒸腾不足，但是蒸腾大于吸水，组织含水量减少，造成植物萎焉。植物细胞质膜、液泡膜等膜结构发生变化，渗透性加大，胞内物质明显外渗，电解质渗漏率加大，所以通常用渗漏率衡量植物抗逆性的强弱。逆境下植物的光合作用减弱，可能由于逆境条件下叶绿体结构遭到破

4、、光合酶失活、气孔关闭增大气体扩散阻力引起的。植物呼吸速率发生改变，逆境下植物体内磷酸化酶、蛋白酶活性升高，淀粉水解，蛋白质水解加强，可溶性糖含量升高，逆境蛋白表达升高，脱落酸含量增加1。研究植物逆境胁迫下生理变化往往可从渗透调节物质，膜损伤，活性氧三个方面进行分析。首先渗透调节物质，逆境胁迫下植物通过积累各种有机或无机物质提高细胞液的浓度，降低渗透势，提高细胞吸水或保水能力。值得注意的是无机离子调节经济但积累过多会产生毒性，有机物质调节虽然无直接毒害，但消耗大量光合产物。通过测定相同植物或不同植物在胁迫组和对照组细胞内渗透调节物质的含量，无机离子有k、Na、Cl等，有机物质脯氨酸、甜菜碱、可

5、溶性糖（葡萄糖、蔗糖）2。然后膜损伤方面，正常情况下植物细胞膜有选择通过功能，细胞的物质交换、信号传导都由膜结构完成。胁迫下膜结构首先会遭受损伤，如果膜结构破坏会导致选择透过性功能丧失，电解质外渗，因此可以通过测量细胞浸提液的电导率（无机离子），紫外吸收值（有机物质）。最后可从活性氧角度测定胁迫伤害程度，正常植物体内活性氧的产生和消除处于动态平衡，植物体内清除活性活性氧的系统有两种，一种酶系统，一种非酶系统，前者主要通过抗氧化物质起作用，譬如，GSH、维生素C、类胡萝卜素。后者通过SOD、CAT、POD、APX等发挥酶促清除作用。植物受到环境胁迫，一旦这种平衡被打破，活性氧积累加剧，清除不足，

6、造成膜质过氧化，产生丙二醛（MDA），丙二醛释放后结合蛋白质和核酸，改变分子构型，使分子交联，功能丧失，作用的结果导致膜系统会破坏，造成生理紊乱。因此通过测定各种抗氧化物质和各种酶活性及丙二醛的含量可以反映植物胁迫下的生理变化，作为植物抗逆性的指标1。二、胁迫下植物细胞常见的生理指标的测定以下实验过程仅作参考，用于辅助说明，不具代表性，具体实验以个人实验设计为准。以高温、低温胁迫为例简单说明细胞膜损伤后离子浓度的测定方法3-6，首先培育幼苗，选取生长一致、苗龄适当的幼苗，分成叶片、根、茎和芽4部分，选取上部刚展开的叶、全部根系、中部茎和顶端两片嫩芽。然后将叶片剪成12小片，茎剪成0.5小段，用

7、去离子水洗净，纱布擦干，每部位称取约0.1，装入密封袋内，分别进行温度梯度处理，譬如，低温温度梯度可设为为4、0、-2、-4、-6、-8和-10 ，（可根据自己实验材料合理设置）在低温冷冻槽内进行，采用连续降温的方法，每个温度梯度处理1，取出室温静置解冻2后，测定电导值(0)。高温处理的温度梯度可设为：25、30、35、40、45、50、55和60 ，处理时间为15，测定电导值。最后以室温下植物叶片的电导值为对照()，以相对电导率表示细胞伤害率，计算公式：相对电导率(%)=(-)/(0-)×100%。以紫外辐射胁迫为例简单说明细胞膜损伤后各物质的生理指标7。采用漂浮育苗方式育烤烟苗，

8、取苗龄35d的烟苗移栽至装有基质的塑料盆内，待还苗后将烟株转移到装有紫外线灯管(波峰值在295nm)的架子上进行试验处理，灯管离烟苗顶部30一50cm。试验设3个UVB辐射梯度，外源增加UV一B的强度分别为18.71士2.13 µW·-2(UV一B1)、24.00士4.06 µW·-2(UV一B2)，无外源UV一B处理时紫外线强度为5.55士0.84 µW·-2（CK），外源增加UV一B处理的时间为每天6h(10:00一16:00)，处理7d为1个试验周期，重复3次。UV一B辐射量用紫外线辐射计测定，处理期间定量浇灌Hoagland营

9、养液维持烟苗正常生长。以UV一B辐射处理7d后幼苗的新鲜叶片(取完全展开叶片)测定各项生理指标：生物量和含水量、根冠比、叶绿素和总类胡萝卜素含量、丙二醛含量（MDA）、脯氨酸含量，紫外线吸收物质类黄酮的含量，可溶性总糖含量。植株高度、地上部生物量和含水量测定： 随机取各处理幼苗30 株，剪掉根部，立即称地上部鲜重，并测量其高度。之后将地上部于4050的烘箱内烘至恒重， 以干重表示生物量并计算含水量。将地上、地下部分分离，于105杀青15min，65恒温烘干至恒重，并用万分之一电子天平称重，计算根冠比8。叶绿素和总类胡萝卜素含量测定：根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定

10、波长测定其吸光度即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比。A=CL , 比例常数，各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A 并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。例如取新鲜叶片或其它组织或干材料，擦净组织表面污物剪碎去掉中脉混匀。将取好的

11、样品放入25ml容量瓶中加混合浸提液无水乙醇：丙酮=5:5 20ml放在黑暗条件下，浸泡至叶片发白，用浸提试剂定容至25ml摇匀备用。把叶绿体色素提取液倒入1cm光径的比色皿内，以浸提试剂为空白测定吸光度。选择波长663 646 和470nm，测定OD值，计算对应色素含量8。光合强度、蒸腾速率和气孔导度测定：用便携式TPS-1 型光合测定仪随机测定各处理幼苗第一片真叶的光合强度、蒸腾速率和气孔导度( 各指标测定均为烟叶第一片真叶) 。每次测定5 株幼苗, 测定于每日13: 0014: 00时进行, 测定光强为1 000 1 100 Lmol·m- 2·s- 1。MDA含量测

12、定：采用硫代巴比妥酸法测定，在酸性和高温条件下，MAD可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5三甲基恶唑-2，4二酮)，其最大吸收波长在532nm。首先称组织鲜样0.5g，加入4ml pH7.8磷酸缓冲液冰浴研磨至匀桨，再用4ml缓冲液冲洗，用四层纱布过滤至小烧杯中，并转移到离心管，4下10000xg，取上清液即为酶液。然后取1.5ml酶液，加入2.5ml TBA一CTA液，在沸水浴上加热10min，迅速冷却，以1800xg离心10min，取上清液于532nm和600nm下比色，测定OD值8。脯氨酸含量测定：原理为用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液

13、中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。例如准确称取不同处理的待测叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml 3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min

14、。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得OD值8。黄酮含量测定：采用亚硝酸钠，硝酸铝氢氧化钠比色法。该方法是目前应用最广泛的总黄酮含量测定方法，该法的原理是在待测物的水溶液中加入亚硝酸钠、硝酸铝氢氧化钠试液、铝离子与黄酮类化合物3，4二羟基发生络合反应显色来进行测定。例如芦丁化合物B环上有邻二酚羟基与铝离子络合在500nm处有最大吸收，如果供试品显色后在同一地方有最大吸收即可以芦丁做对照品，用比色法进行测定。称取0.60.8g样品粉末，加入60ml 60%乙醇于100ml圆底烧瓶内，置于水浴锅上，70条件下回流提取60min。

15、过滤、定容于100ml，吸取样品量（根据样品的吸光度调整）1.0ml，放入10毫升容量瓶内（写明标记），用60%乙醇加到2.0ml；加入5%亚硝酸钠溶液0.5ml摇匀，放置6min；加入10%硝酸铝，溶液0.5ml，放置6min后；加入4%氢氧化钠溶液4.0ml，摇匀后，加60%乙醇定容，放置15min；在510nm处测定吸光度。根据标准曲线计算总黄酮的含量。总黄酮含量=A/M·100×稀释倍数 A为标准曲线中的含量6。可溶性总糖的测定：采用蒽酮比色法测定可溶性糖的含量。糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。在625 nm

16、波长下的OD值与糖含量成正比。由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。将植物叶片在110烘箱烘15 min，然后调至70过夜。干叶片磨碎后称取50 mg样品倒入10 ml刻度离心管内加入4 ml 80%乙醇，置于80水浴中不断搅拌40 min，离心，收集上清液，其残渣加2 ml 80%乙醇重复提2次，合并上清液。在上清液中加10 mg活性炭，80脱色30 min，80%乙醇定容至10 ml，过滤后取滤液测定。 吸取上述糖提取液1ml，放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5mL混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm，

17、测得吸光度。从标准曲线上查得滤液中得糖含量，然后再计算样品中含糖百分数。（需要绘制标准曲线）以重金属镉胁迫为例从活性氧角度测定胁迫伤害程度9-10。精选番茄种子500粒，用纱布将种子包起来，清水浸种34h，放入0.5%高锰酸钾浸种2040min，取出后用清水冲洗干净。保湿于28光照培养箱内催芽24h，25发芽3一5d，发芽后22砂床育苗。播种后14d选长势一致幼苗移至温室内不含镉的营养液预培养14d。然后进行镉处理：设0(CK)，0.1，1.0，5.0，10.0 µmo1L-1处理，镉以CdCl2形式供给。镉处理后，第7d、14d、21d、33d取样提取酶液，以测定根、叶片中SOD、

18、POD、CAT酶活性。酶液提取参照MDA中酶液提取方法。SOD活性测定：由于超氧自由基为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2·-，当加入NBT(氧化硝基四氮哇兰)后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色物质生成速度减慢。例如吸取3ml NBT反应液于小烧杯中，加入50µl酶液，于40001ux光照15min，以50µl NBT代

19、替50µl酶液为CK，OD560下比色。通过在反应液中加入SOD酶液，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，依据绘制的二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性7。POD活性测定：在H2O2存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚。可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。吸取酶液50ul于10ml试管中，加入3ml蒸馏水，lml 0.3%愈创木酚，lml 2%H2O2(计时)，5 min(25恒温下)后比色OD470，以水调零，以不加酶液测为CK，计算活性。CAT活性测定：紫外吸收法  H 2 O 2

20、在 240nm 波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度 A 240 随反应时间而降低。根据测量吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。首先取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3ml 30%的H2O2（原液）摇匀制成反应液。取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（测定40s），计算酶活性。近年来，随着人类活动频繁，工业“三废”排放量日益增加，农业生产中化肥、农药等大量施用，全球土壤污染愈来愈严重，已成为危害人类的重大因素，近年来很多学者都从事污染地生态修复，重金属污染土壤的植物修复技术及污染地能源植物资源开发技术日益兴起，我们实验室主要研究逆境胁迫下不同植物生理耐受，研究了高盐、低温、干旱、紫外辐射下的耐受植物，同时利用植物针对重金属土地污染进行修复，符合当前发展潮流，环保、洁净、应用前