牛奶中雌激素残留检测方法研究进展

1、牛奶中雌激素残留检测方法研究进展摘 要：雌激素作为一种类固醇激素，因其对动物及人类内分泌系统的潜在危害已经引起了越来越多的关注。牛奶在人类日常饮食结构中占有重要位置，而研究表明在如今的商业牛奶中雌激素含量呈持续上升趋势。本文阐述了牛奶中雌激素的来源与危害，并重点介绍了对其残留纯化及检测方法的研究进展。关键词：牛奶；雌激素残留；检测Research Progress of Detection Methods on Estrogen Residual in MilkAbstract: In recently years, estrogen, a steroid hormone, has inten

2、sively been investigated due to its functionalities of human and animal endocrine system disorders and carcinogenic elements. More importantly, milk occupies a momentous position in people diet structure, while some researches demonstrate there is an escalating tendency on content of estrogen in com

3、mercial milk nowadays. In this paper, the source and harm of estrogens in milk is present, and the current research of purification and detection methods on estrogen residual in milk is summarized in detail. Key words: milk; estrogen residual; detection 雌激素是一类可直接影响动物代谢与繁殖，具有相似化学结构的类固醇激素。该类物质进入机体后，可干

4、扰体内正常分泌物的合成、释放、运转、代谢及结合，激活或抑制内分泌系统功能，最终造成机体代谢调控紊乱1 。雌激素在自然界中分布广，危害大，即使在极低浓度下也会对生物产生很大的影响。近年来，为促进动物生长而使用雌激素，导致蛋类、肉类和乳类的雌激素残留问题日益严重。己烯雌酚等合成类雌激素虽然早在2002年就已被我国农业部列为禁止使用的药物，并规定食品中不得检出，但在食品安全国家标准乳粉（GB19644-2010）中，关于乳粉中雌激素的检测并没有提出要求2。与此同时，国际上已公认，残留在食品内的雌激素极有可能增加人类睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌以及子宫内膜癌的发病率3-6，鉴于此西方各国纷纷制定相

5、应标准，其中以欧盟最为严格，明确对其禁止使用。人类摄入雌激素的途径很多，其中乳制品是主要来源7，因此，为保障饮用牛奶的健康与安全，对其进行相应检测十分必要，随着雌激素残留问题日益受到重视，各种针对牛奶中雌激素含量的检测技术也迅速发展。1 牛奶中雌激素的来源与危害1.1 雌激素的分类雌激素按来源可分为内源性雌激素和环境雌激素两大类。内源性雌激素在通常情况下主要由卵巢合成分泌，包括雌二醇、雌酮和雌三醇等，其中以雌二醇的活性最高；环境雌激素主要是指人工合成的，具有模拟雌激素作用的化合物，一般被作为药物使用，常见的有双烯雌酚、己烯雌酚、乙炔雌醇、炔雌醚等8。除此之外，环境雌激素还包括自然界中存在的真菌

6、性雌激素和植物性雌激素。1.2 牛奶中雌激素的来源如今商业牛奶中所含的雌激素既有内源性雌激素，即奶牛内分泌产生的雌激素；也有人工合成雌激素，即应用于奶牛的雌激素2。牛奶中内源性雌激素的浓度主要取决于产奶动物的种类，年龄和生理状态等9。牛奶本身即含有种类丰富的类固醇，如雌二醇就可在奶牛乳腺中生物合成10。时下牛奶早已成为人们日常膳食中的重要组成部分，无论国内外牛奶的生产消费都保持着猛烈地增长势头，但需认识到现在的商业牛奶与过去早已不同，就奶牛品种和饲养方法而言，现代饲养的高产奶牛多经基因改良，其分泌牛奶中的雌激素含量较之过去显著提高；而且为增加牛奶产量，通常使用高蛋白饲料喂养母牛，这也可能导致牛

7、奶中雌激素含量的提高11；由于人工授精技术的介入，现代奶牛几乎可以在整个孕期持续泌乳，其血液中的雌激素含量在妊娠后期增加尤为显著5。人工合成雌激素是牛奶中雌激素的重要来源。与天然雌激素相比，合成雌激素更为稳定，易在动物组织内残留，进而通过食物链危害人类健康，早在上世纪六十年代，人工合成雌激素因对畜禽动物生长催肥作用明显，就被多国作为促生长剂广泛用于畜牧业，如己烯雌酚，双烯雌酚12。以双烯雌酚为例，作为非营养饲料添加剂使用可显著提高动物体重和饲料利用率；亦可诱导乳腺发育的改变，继而调控泌乳，提高奶牛的产奶量；还可作为兽药，治疗禽畜代谢紊乱等13。1.3 牛奶中雌激素的危害食物链并非雌激素进入人体

8、的唯一途径，直接接触也是重要渠道之一。雌激素通过模拟或拮抗正常的内源性激素，干扰内分泌功能，进而对生殖系统、神经系统和免疫系统等产生多方面影响，大量研究表明雌激素可刺激细胞分化，并与人体癌症的发生存在因果关系14,15。Akio Sato等7研究发现，现在消费的牛奶雌激素含量较高，而这可能与女性乳腺癌，卵巢癌和子宫内膜癌的产生有关。米兰，意大利一项病例对照研究指出，牛奶饮用量与患前列腺癌之间有强烈关联，其让步比（OR）为5.1，与不饮用牛奶的人相比，每天饮用超过两杯牛奶的人更易患前列腺癌16；纽约的一项研究也有类似的结果，其OR值为2.49 17。另外有研究表明雌激素极有可能对婴儿和青少年的生

9、长发育造成严重影响，尽管目前尚无直接证据，但多国政府已给予了高度重视。相比于人类而言，雌激素对于哺乳动物的影响已日趋显现。Jonathan J Li18以仓鼠肾脏腺癌为模式探究不同雌激素与肿瘤发生的关系，试验结果表明己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚在仓鼠中诱导肿瘤发生的机率是相同的。而雌激素促使幼鼠性早熟的报道早已屡见不鲜。除此之外，雌激素对于水生生物也有不可估量的影响。Islinger M等19研究发现长期暴露在低浓度17A-乙炔雌二醇（50 ng/L）中的雄斑马鱼表现出明显的内分泌失调和睾丸发病迹象, 导致性器官自溶, 同样的现象也出现在江鳕和黑呆头鱼中, 而且暴露在雌激素环境中的成年斑马鱼性

10、器官无法再生。2 牛奶中雌激素残留的纯化及检测技术牛奶基质比较复杂，含有许多不同种类的大分子物质，如脂肪、蛋白质等，而雌激素残留一般是痕量的，因此在进行分析前往往需要复杂的样品前处理过程。2.1 牛奶中雌激素残留的前处理方法2.1.1 液液萃取（LLE）液液萃取也称溶剂萃取，是利用提取物在两种互不相溶的溶剂中溶解度或分配系数不同而达到分离的目的，是比较经典的萃取方法，简便，无需特殊器材，但费时，溶剂用量大。目前雌激素分离萃取中常见的萃取剂有丙酮、甲醇、乙腈、二氯甲烷等。Ban Ivan等20利用液液萃取，以乙酸乙酯作为萃取剂，获得了一种天然共轭马雌激素且同时去除了非共轭亲脂性的化合物。2.1.

11、2 固相萃取（SPE）固相萃取作为一种常见的预处理技术，是利用固体吸附剂将目标物从液体样品中吸附出来，然后再用洗脱剂洗脱，从而达到分离和富集的目的。固相萃取可分为正相SPE，反相SPE，离子交换SPE和吸附SPE四大类，近年来SPE吸附剂不断推陈出新，如免疫亲和SPE，分子印迹SPE等。其中分子印迹SPE是当前各国研究的热点21，它是基于分子识别理论发展而来，虽然发展时间较短，但因其独特的性能而倍受关注，如制备简单、稳定性强、使用寿命长、可抵抗恶劣环境，尤其是可以定做特殊的分子结构和官能团，可特异识别印记分子等。Wang等22以雌酮为模板，丙烯酰胺为功能单体，-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基

12、硅烷作交联剂，制备出了对雌酮有特异识别和选择性的印迹材料，与液相色谱联用，最低检测限（LOD）可达9.3 ng/L。如今，分子印迹领域正逐步引入新的功能特性，如亲水性、超导性、超顺磁性等。2.1.3 固相微萃取（SPME）兴起于上世纪末的固相微萃取技术是依托SPE发展而来的一项样品前处理技术，包括直接萃取，顶空萃取和膜保护萃取。与SPE相比，SPME具有溶剂用量少，目标物更易洗脱等特点，但美中不足的是，它的精密度较低，且无法有效地分离一些极性差异较小的物质（如植物色素等）。Yang等23采用碳纳米管强化固相微萃取技术联合液相色谱检测牛奶中的己烯雌酚，经检验该方法快速简便，效果良好，且LOD为5

13、.1g/L，适于日常饮用牛奶的分析。2.1.4 液相微萃取（LPME）液相微萃取技术集分离、浓缩、进样于一体，其基本原理与LLE相似，是微型化了的LLE，LPME仅使用很少的有机溶剂，就可对微量目标物产生良好的富集作用，其不足之处在于重现性较差，萃取剂体积不易控制等。顾东海等24采用液相微萃取-气相色谱质谱法，以苯为萃取剂，检测奶粉中的双酚A，结果显示该方法相对标准偏差为4.9，LOD为0.2 g/kg，加标回收率为100.9103.4，方法快速准确，适于此类分析。2.2 牛奶中雌激素残留的仪器分析检测方法2.2.1 气相色谱法（GC）气相色谱法是利用样品中不同物质在气相和固定液液相间的分配系

14、数不同而实现分离，以气体为流动相（如氮气、氢气等），传质速度快，固定相一般由固定液涂渍在载体上制备而成。虽具高效和高灵敏性的特点，但只对可气化且不易分解的物质有效，而且进样量不易固定。在雌激素的检测中，GC往往采用雌激素先与二氯乙酰氯衍生，然后用电子捕获检测器检测，虽然灵敏度较高，但由于衍生化步骤较为复杂且很难控制过程中产生的水解反应，所以此方法的应用受到一定限制13。2.2.2 高效液相色谱法 (HPLC)作为一种较为成熟的理化检测方法，高效液相色谱在农兽药残留领域应用广泛，它是利用物质在两相中吸附或分配系数的微小差异，配以高压泵，从而实现快速分离。与GC相比，液相可分析不易挥发或热稳定性强

15、的组分，适用范围广，但分析时间相对较长。HPLC按液相分离模式可分为正相，反相和离子交换等，其中以反相HPLC发展最快，且已成为大多数雌激素残留的常规检测方法。周建科等25以乙腈-水作流动相，建立了同时测定牛奶中五种雌激素的液相色谱法，分离效果良好，误差小，平均回收率为67.0 %95.5 %，LOD为1.02.0g/ L。2.2.3 毛细管电色谱法（CEC）作为一种新兴的微柱电分离技术，CEC是以电渗流为驱动力，兼具毛细管电泳及HPLC的双重分离机理，具有样品用量少，灵敏度高等优点，但CEC在操作中容易产生气泡，造成电流不稳，影响试验结果。近来发展的加压毛细管电色谱（pCEC），通过将高压直

16、流电场引入CEC中，克服了气泡问题，分辨能力极大提高，尤为适用于分析结构及荷质比均相似的一类化合物。Liu等26采用梯度加压毛细管电色谱法，有效地分离了己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚，且三种雌激素的检测限在1.22.2×107 mol/L范围内。2.2.4 气相色谱-质谱联用方法（GC-MS/MS）联用技术因其可以取长补短，能集分离、定性(分子结构)和定量于一身，是现代农兽药残留分析的重要发展方向。GC-MS/MS将气相色谱与质谱结合，具有分离能力强，灵敏度极高等特点，且定性、定量数据准确，在雌激素的分离与检测中发挥重要作用。目前GC-MS/MS 技术已相当成熟，面对日益加剧

17、的环境污染，关于GC-MS/MS在测定各环境组分中雌激素残留的研究日益活跃，邓晓丽等27用GC/MS法对奶粉中四种雌激素雌酮、雌二醇、雌三醇和炔雌酮进行检测，分离效果良好，且在低浓度下的加标回收率为61.285.4%，LOD为0.130.3 ng/g，方法可靠。2.2.5 高效液相色谱-质谱联用方法（HPLC-MS/MS）与HPLC通过保留时间对物质定性不同，HPLC-MS/MS通过电子将物质击碎，然后经核质比来定性，相对来说更为准确；同时它弥补了GC-MS的不足，可对热稳定性差，强极性物质以及生物大分子（如蛋白、核酸等）进行分离，这也因此使LC-MS成为近年来激素类药物研究检测的热点。张爱芝

18、等28采用正离子采集模式，建立牛奶中7种激素的超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS/MS)检测方法，待测物以甲醇为萃取剂，辅以超声提取，经LC-C18柱净化，BEH-C18(100mm×2.1mm,1.7m)柱分离后进行UPLC-MS/MS多反应监测模式下的定性及定量分析，LOD为0.010.25 g/kg，定量限为0.060.5 g/kg，添加水平为10 g/kg时，平均回收率为83%124%。2.3 基于生物技术的雌激素检测分析方法2.3.1 免疫分析法（IA）免疫分析法是免疫化学测定方法的一种，基本原理是基于抗原抗体的特异性结合，方法选择性好、经济且灵敏度高，适于痕量雌激素的半

19、定量分析，不过影响因素较多，易出现假阳性结果。目前测定雌激素的免疫分析方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析法、发光免疫分析法以及分辨荧光免疫分析法等。Sun等29建立了对环境样品中多种雌激素分子的酶联免疫检测方法，方法简便可靠，对雌激素分子具有良好的专一性，且灵敏度约为普通液相的100倍。2.3.2 蛋白质芯片技术（PCT）蛋白质芯片技术是基于DNA芯片技术的发展应运而生，它将各种微量纯化的蛋白质阵列在高密度固相载体上，而后与待测样品杂交进行高灵敏度的分析，可同时检测几百甚至上千种目标蛋白，但由于蛋白质作用动力学的多样性与复杂性以及生物样品中目标分子含量的不确定性，如何分辨假阳性信号和阳性弱

20、信号尚待解决。曹巧玲30将蛋白质和小分子偶联，通过Cy3对蛋白标记，从而间接标记小分子，利用非标记小分子对标准液中偶联物产生竞争强度确定待测物质的含量，成功地将壬基酚、雌二醇、阿特拉津、氯霉素和罂粟碱五种小分子与卵清蛋白偶联，标记后的偶联物均能与各自的抗体结合，实现了五种小分子在一张芯片上的同时检测。2.3.3 电化学分析方法（EC） 电化学分析方法是基于电化学原理与物质的电化学性质而建立的一种分析方法，可快速准确地测定微量或痕量组分，适用于有机生物、临床药物及苛刻环境中，但在操作过程中，易发生副反应，影响电流效率，且电极易受污损。Ji-Eun Im等31通过分子水平上硫醇基和羰基的表面变性，

21、制造出了带有雌激素受体的电极共价键，形成了打开侧装有羰基末端的自组装单层膜，然后引入交联剂与雌激素受体形成稳定共价键以满足分析的需要，结果显示该方法雌激素检测限在106 M级。3 展望雌激素在环境中通常以较低浓度存在，有时甚至是ng/L级，在水、土壤、空气、沉积物和生物相中均有检出，对人类和动物生殖，发育，免疫，致癌和生态等方面存在潜在的危害效应32。在经历了牛奶产业多重问题事件之后，我国消费者早已变得人人自危，部分人群更是谈奶色变，鉴于牛奶中雌激素残留是涉及人类健康的公共安全问题，加强检测刻不容缓。国外对于雌激素的潜在危害及检测手段研究较早，无论是制度还是技术都较为成熟，国内虽然起

22、步较晚，但近来年也引起了多方重视，此方面的研究也取得了迅猛发展。加快发展我国雌激素残留的检测技术，尤其是雌激素复杂基质的前处理技术，与仪器分析法互补，进而发展快速便携化的多残留筛选分析技术，争取实现分析过程自动化或智能化，以提高分析效率、降低成本，保证消费者的安全与健康，无论是对于估测食品安全，使国内消费者对乳业重拾信心，还是突破进出口贸易壁垒，让我国乳业走向世界，进一步扩大国际市场都是非常必要的。参考文献：1 潘尚霞, 张建鹏, 戴昌芳.环境内分泌干扰物研究进展J.中国环境卫生, 2006, 9(12):29-32.2 唐晓姝, 张秋香, 杜先锋, 等.DSPE-LC-MS/MS

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