HER2 in situ hybridization in breast cancer

1、1乳腺癌HER-2原位杂交：17号染色体和遗传异质性的临床意义Wedad M Hanna1, Josef Rüschoff2, Michael Bilous3, Renata A Coudry4, Mitch Dowsett5, Robert Y Osamura6, Frédérique Penault-Llorca7, Marc van de Vijver8 and Giuseppe Viale9曲妥珠单抗疗法是HER2+乳腺癌患者的标准治疗方法。通常采用原位杂交评价HER2基因的扩增情况，当时17号染色体的多体性或肿瘤间的遗传异质性是原位杂交结果的解释变的具有

2、挑战性。显然，17号染色体多体性定义为染色体探针17（CEP17）信号数量增加，在乳腺癌中是一种常见的基因异常，也代表一种异常的HER2拷贝数增加机制。有研究将CEP17数量（染色体倍数）和不良的临床病理学特征以及HER2的过表达相联系，尽管这些研究在CEP17数量上存在差异。这解释了CEP17数量的提高可以是曲妥珠单抗能在HER2:CEP17比值正常情况下与肿瘤反应的原因。然而，最新的研究发现，表面的多倍体性（CEP17增加）通常与局部的pericentromeric区域增加有关，而不是真正的多倍体。存在不同HER2扩增情况的同一肿瘤的亚细胞中HER2的状态可能比较复杂。当使用美国病理协会指

3、南进行评价时，这样的遗传异质性将影响40%以上的乳腺癌诊断。近期的数据显示，这样的异质性与不利的临床变化和差的预后有关。存在HER2扩增的遗传异质性肿瘤患者可能获益于曲妥珠单抗的治疗，这在临床上还未得到证实。在本文中，我们讨论了在临床实践中17号染色体多体性和遗传异质性对HER2状态的影响。我们推荐在着丝粒和HER2共扩增的情况下，使用HER2平均拷贝数来界定HER2是否阳性要优于使用HER2:CEP17来界定。同事我们强调必须使用统一的原位杂交评分原则以支持精确的HER2状态检测，尤其是当确定存在异质性时。关键词：乳腺癌；17号染色体；遗传异质性；HER2检测；原位杂交；多体性HER2是人类

4、表皮生长因子受体家族成员，由位于17号染色体长臂上基因（17q12-21.32）编码。报道显示，大约20%的乳腺癌HER2过表达和/或显示ERBB2基因扩增（这里提到的HER2，符合常规的做法），尽管我们的经验显示的如此，但是事实上，HER2的阳性率只有将近15%。HER2阳性是预后差的一个标志，与肿瘤的浸润和生存率低有关。曲妥珠单抗是HER2的靶标单克隆抗体，其单独或与化疗协同对乳腺癌HER2过表达初级或转移的患者有效。因此，对于HER2+的早期或转移肿瘤，含有曲妥珠单抗的治疗已成为一种 通讯作者：W Hanna，医学博士，加拿大皇家医学院院士，解剖病理学家，多伦多新宁医院健康科学中心，湾景

5、大道2075号，E4 32室。E-mail：wedad.hannasunnybrook.ca接收于2013年1月9日；2013年4月5日修订；2013年4月11日受稿；发表于2013年6月28标准。由于临床上曲妥珠单抗对HER2阳性的肿瘤非常有利，HER2检测被推荐用于所有乳腺癌的诊断，以确定是否有使用曲妥珠单抗治疗的可能。在临床上，目前有两种评价HER2状态的诊断技术被认可：免疫组织化学法（IHC）和原位杂交法(ISH)。IHC利用抗体评价HER2蛋白的表达情况，ISH通过标记了荧光素、显色物或银的DNA探针检测系统（即FISH, CISH或SISH）或者联合使用CISH和SISH系统（明视

6、野双色ISH(BDISH)，或双抗原双色ISH(DDISH)）对HER2的拷贝数进行检测。ISH是使用单一的探针对每个细胞核中的HER2拷贝数进行计数，或使用双探针技术，进行17号染色体着丝粒探针（染色体计数探针17，CEP17）杂交，从而确定HER2:CEP17的比值。双探针的方法可进行双色杂交技术，使两个探针在一张切片上共杂交，或者使用两个探针依次对芯片进行银染分析。对于HER2扩增状态的评价，同时关注HER2:CEP17的比值比只关注HER2的平均拷贝数更有效，后现代病理学杂志(2014)27,4-1816者还依赖于肿瘤的有丝分裂指数、切片厚度、核截断的影响，以及非正常的染色体拷贝数（非

7、整倍体性）。美国FDA早前批准的HER2检测的说明书根据所使用的检测类型（表1）定义HER2阳性：IHC评分2+（弱阳性）或3+（阳性），每个细胞核HER2平均拷贝数>4或HER2:CEP172.0。现今，肿瘤IHC 2+/ISH -的患者不适合于曲妥珠单抗治疗。但是2007版的ASCO/CAP指南提高了HER2阳性的阈值，并提出了IHC和FISH结果中可疑结果的范围。指南指出，出现可疑结果时需进行附加检测，但是作者强调了曲妥珠单抗不应用于可疑检测结果患者的治疗，而根据原来FDA分界点，可疑检测结果应判定为阳性。ASCO/CAP推荐选择IHC或FISH之一作为初步检测，但是其他机构倾向于

8、FISH作为主要检测手段，并且认为由于技术因素和评分的主观因素，IHC检测的准确性有限。表1 FDA和ASCO/CAP 测定HER2状态的IHC或FISH阈值IHCFISHFDAASCO/CAP每个细胞核的平均HER2拷贝数HER2:CEP17比值FDAASCO/CAPFDAASCO/CAP阴性0 - 1+0 - 1+4.0<4.0<2.0<1.8可疑2+(10%的肿瘤细胞中存在不均一的或弱的完整细胞膜染色，或者在30%的浸润性肿瘤细胞中存在强的完整细胞膜染色)4.0 - 6.01.8 - 2.2阳性2+（>10%的肿瘤细胞中存在弱到中度的完整细胞膜染色），3+（>

9、;10%的肿瘤细胞中存在强的完整细胞膜染色）。目前，肿瘤IHC 2+/FISH -的患者不符合曲妥珠单抗的治疗 3+（在>30%的浸润性肿瘤细胞中存在均一的强细胞膜染色）>4.0>6.02.0>2.2尽管ASCO/CAP的算法为HER2评价提供了一个清晰的指导，但是由于乳腺肿瘤的生物复杂性，检测结果的解释将变得困难，比如17号染色体的非整倍体性（包括多倍体性和单倍体性），CEP17和HER2信号的共定位，以及肿瘤间的遗传异质性。由于单倍体性和共定位情况极少，本文将重点放在了17号染色体的多倍体性和遗传异质性上。我们总结了有关这些问题的证据，并讨论了HER2检测解释和临床

10、使用曲妥珠单抗资格的相关性（总结见图1和2）。17号染色体多倍体性特定的染色体区域拷贝数增加而导致的基因扩增，这种情况下通常会影响基因，使其过表达。超过90%HER2过表达的乳腺癌显示HER2的基因座也同时增加。相应的，多倍体性定义为一个或多个完整的染色体出现额外的拷贝。尽管17号染色体的多倍体性提供了一种增加HER2基因数量的机制，并影响HER2的表达，其他临床病理学变量、预后和治疗应答并未得到确定。然而，无论评价依据是HER2的平均拷贝数还是HER2:CEP17比值，CEP17数量提高在乳腺癌报告中常出现，也是ISH情况不一致的主要原因，这些都是重要的问题。有人认为对17号染色体拷贝数的修

11、正对精确判定HER2状态是必须的，但是其他人对这个观点存在质疑。对于是否或如何将CEP17数量提高（多倍体性）整合到HER2检测结果的解释中，目前尚未达成共识。实验室情况下临床情况下0或1+2+3+4.0,<6.06.0<4.0是否双探针ISH（报告HER2，CEP17，细胞计数）高CEP17计数？ISH作为首要检测可疑的IHC结果(2+)增加ISH检测根据指南确定HER2状态IHC检测（如果预先未进行）HER2阳性HER2阴性根据HER2拷贝数确定HER2状态HER2阳性HER2阴性在不同的组织块重复进行IHC检测；如果结果相同，确定为HER2阴性确定17染色体参照基因（如SMS

12、, RARA）或分子核型分析的ISH评价图1 17号染色体多倍体性（CEP17数量增加）乳腺癌样本中EHR2状态检测公认流程。IHC：免疫组织化学法；ISH：原位杂交。界定17号染色体多倍体性缺乏细胞遗传学分析时，通过ISH观察到的CEP17信号数量通常作为17号染色体的拷贝数量（图3和4）。然而，适当的CEP17拷贝阈值用于界定CEP17状态（多倍体性）未被公认，了正常值2，也有可能是G2期细胞的存在和染因为即使二倍体样本人工切片检测时确实偏离色体不稳定造成的。有些定义提出，没有一个可以作为标准被大家接受，但是每个细胞核CEP17信号3被公认为是一个阈值，一大批（100个例子）研究使用这个阈

13、值。图2 遗传异质性乳腺癌样本中EHR2状态检测公认流程。*与IHC染色切片相对应*1-10%扩增细胞1-10%扩增细胞是否对另外的细胞计数（60）病例将被认定为HER2阴性，并确定为不适合使用靶标疗法；但是患者可在随后的远端转移癌的复查中获益HER2阳性(对扩增细胞单独进行评分)搜索整个切片选择2个以上代表区域，对20个以上细胞核进行计数分散的扩增细胞根据整体的平均值评价HER2状态，同时报告扩增细胞比例聚集型扩增细胞对不同的肿瘤块或淋巴结转移癌进行重复分析显示异质性根据平均值评价HER2状态图3 通过双色银染原位杂交分析乳腺癌细胞，使用HER2(黑色)和CEP17(红色)探针，结果显示17

14、号染色体异质性（CEP17计数增加）伴有HER2扩增（a），CEP17计数增加伴有HER2扩增（b），HER2和CEP17共扩增（c），都伴有强的HER2过表达（IHC 3+）。通过FISH检测使用HER2(红色)和CEP17(绿色)探针验证HER2单一扩增（d）。图4 简图演示细胞核(a)二倍体，HER2未扩增；(b)二倍体，HER2扩增；(c)多倍体，HER2未扩增；(d)HER2/CEP17共扩增表2 乳腺癌中CEP17计数提高（多倍体性）的概率研究样本界定概率（%）Bose等可疑或弱阳性（n=52）或阴性（n=22）IHC结果的乳腺癌CEP17拷贝数334Cuadros等乳腺癌（n=4

15、62）平均CEP17338Downs-Kelly等连续的乳腺癌（n=727）各细胞平均CEP1738Hofman等IHC 3+或HER2:CEP172.0乳腺转移癌（n=95）平均CEP173/细胞27Kokate等非可疑FISH比例的浸润性乳腺癌（n=390）平均CEP17>37Krishnamurti等浸润性乳腺癌（n=365）平均CEP173/细胞23Merola等IHC 2+乳腺癌（n=343）CEP17拷贝数>346Petroni等浸润性乳腺导管癌（n=647）平均CEP17327Salido等连续的乳腺癌IHC 0-3+(n=50)或IHC 2+/3+(n=125)各细

16、胞平均CEP17313Takehisa等原发性乳腺癌患者手术前穿刺样本（n=40）20%以上细胞核CEP17>343Torrisi等乳腺癌，IHC 0-2 +(n=415)或IHC 3+(N=42)CEP17拷贝数317Tsukamoto等浸润性导管癌（n=113）20%以上细胞核CEP17>337Tubbs等原发性乳腺癌（n=742）80%细胞中CEP1733Vanden Benpt等原发性乳腺浸润性癌，IHC 2 +/3 +（n=171）或 IHC 0/1+（n=55）各细胞平均CEP17346Varshney等浸润性乳腺癌（n=687）平均CEP17拷贝数310Zaczk等-

17、阶段乳腺癌（n=149）30%以上细胞核CEP17>340Zhu等浸润性乳腺癌（n=481）各细胞平均CEP17328缩略词：CEP17，17号染色体探针计数；IHC，免疫组织化学；FISH，荧光原位杂交。乳腺癌中17号染色体多倍体性的概率根据相关研究者可以确定，在浸润性乳腺癌中都存在高CEP17计数现象，即多倍体性。按每个细胞含有3的CEP17拷贝数为界限时，报道的多倍体性的概率在3%到46%之间（表2）。有如此之大的波动，可能是由肿瘤特性不同以及采用的CEP17阈值不同导致的。17号染色体多倍体性及临床病理学特性除HER2，17号染色体外，包含其他几个致癌基因（比如BRCA1，TOP

18、2A，TP53），多倍体性的可能性提高，影响临床病理学和预后变量，是由于生长调节基因/蛋白的表达的改变造成的。与二倍体相比较，一些研究将高CEP17计数（多倍体性）与不利的病理学特征联系在一起。在未经选择的一系列乳腺癌中，17号染色体多倍性/非整倍性关系到增殖能力的增加，并增加诺丁汉预后指数（NPI）评分，尽管关于淋巴结、组织学分级以及荷尔蒙受体状态的数据不一致。相应的，一个限于IHC 2+/3+ 肿瘤（n=147）的前瞻性分析发现，高CEP17计数（多倍体性）（界定CEP173）与淋巴结阳性有重要的联系，而与组织学分级和荷尔蒙受体状态无关。尽管报告中多倍体性，IHC 2+/3+肿瘤有发生更大

19、复发的趋势，但这些研究发现多倍体性对生存的影响不显著。有证据表明，当未出现特定的HER2扩增时，高CEP17计数（多倍体性）可导致更多的浸润型肿瘤。在一个与正常HER2:CEP17比例乳腺癌的对比研究中，高CEP17计数（多倍体性）（CEP173；n=44）与非多倍体性肿瘤（n=36）相比，具有较高的细胞核与组织分级、较活跃的有丝分裂活性、较低的NPI评分、以及雌激素受体阴性。确实，那些HER2未扩增的多倍体性肿瘤的病理学特征具有倾向于HER2特定扩增的趋势（n=35）。相应的，Vanden Bempt等发现多倍体性（CEP173）和非多倍体性原发性乳腺癌（都无HER2扩增）的组织学分级、组织

20、大小、NPI、淋巴结转移状态、或荷尔蒙受体阳性等临床病理学变量都无明显差别。与另一研究结果相同，多倍体性HER2未扩增肿瘤比HER2扩增肿瘤具有更好的病理学特性。尽管多倍体性,HER2未扩增肿瘤比HER2扩增肿瘤具有更好的无病存活率（DFS）(P=0.031)，但是当不存在HER2扩增时，多倍体性肿瘤患者与非多倍体性患者相比，生存率趋向于降低（p=0.056）。尽管各研究结果之间存在许多不一致，这些数据提供了一种趋势，即高CEP17计数（多倍体性）与不利的临床病理学变量和较差的预后有关，虽然这种相关性比HER2扩增要小。17号染色体多倍体性和HER2过表达基因扩增被认为是HER2过表达的主要遗

21、传机制，但是17号染色体多倍体性导致的基因数量增加也有助于增加蛋白质水平。有一些研究显示高CEP17计数（多倍体性）可增加无HER2扩增肿瘤的IHC评分。比如，Hyun等报道在高CEP17计数（多倍体性）（CEP>2.25）的肿瘤中IHC 2+/3+比IHC 0/1+的结果发生率更高（40.8%比12.3%，p<0.001）。在HER2未扩增的肿瘤中，高CEP17计数（多倍体性）通常与可疑的IHC结果（IHC 2+）有关。在Vanden Bempt及其合作者的研究，62例多倍体性HER2未扩增肿瘤中有46例检测到IHC 2+（74.2%），无一个为IHC 3+。但是，其他研究发现高

22、CEP17计数（多倍体性），尤其是CEP计数非常高（CEP4）时，存在IHC 3+染色。研究发现，150个多倍体性HER2未扩增肿瘤中有17例IHC阳性染色（3+）（9.8%），而247个正常的HER2未扩增肿瘤中只有6例为IHC阳性染色（1.5%）。其他研究者认为，高CEP17计数（多倍体性）对HER2的过表达没有影响。在一个含有584例正常HER2:CEP17比值乳腺癌的研究中，发现正常的CEP17计数肿瘤与增高的CEP17计数肿瘤相比（每个细胞计数2.25与>2.25相比）对HER2蛋白的表达（IHC 0/1+/2+和3+）没有明显的差异。在另外一个含有56例HER2未扩增的乳腺癌

23、的研究中，发现IHC结果主要为0或1+（70%），其中一些为2+（27%），只有少部分评分为3+（4%）。总体而言，综合各数据发现高CEP17计数（多倍体性）对HER2的过表达起到一定作用，尤其是IHC 2+肿瘤。有趣的是，很少有证据证明17号染色体多倍体性能够增加HER2 mRNA的量，这个事实提示HER2蛋白增加可通过翻译后机制来解释。假设HER2表达的调节可能在不同的肿瘤中存在差异，可能由HER2扩增、HER2/CEP17（或其他）分段共扩增或者正在的多倍体性引起。在一系列关于17号染色体多倍体性与HER2过表达相关性的相互矛盾的报道中可以看出，在基因组织结构中，这些差异的生物学影响可能

24、也不尽相同。这个结论比获得更多HER2基因座、mRNA表达谱以及蛋白水平的信息更重要，更超越了FISH所提供的有限信息。17号染色体多倍体性与抗HER2治疗反馈高CEP17计数（多倍体性）与HER2表达的潜在关系引出一个问题，即增加17号染色体的拷贝数是否会影响曲妥珠单抗的反应应答。这对患者很重要，因为肿瘤多倍体性IHC 3+但是FISH比例为阴性的患者，可能因IHC假阳性而被认定为不适合使用曲妥珠单抗治疗。为了解决这个问题，Hofmann等对105例HER2 +(IHC 3+或FISH扩增)乳腺转移癌患者使用一线的曲妥珠单抗单一疗法反应应答的第二阶段研究数据进行了回顾性研究。在26例患者中观

25、察到高CEP17计数（多倍体性）（27%），总有6例对曲妥珠单抗的反应应答。所有6例应答都具有IHC 3+评分，而只有4例应答HER2:CEP172。剩余的2例应答FISH比率阴性（<2.0），且HER2拷贝数增加是由于染色体多倍体性。这支持了有些患者因多倍体性而不是基因扩增导致的HER2过表达也可以对曲妥珠单抗产生应答，并且提示IHC 3+的肿瘤不需FISH即可确定为HER2阳性。进一步关于多倍体性肿瘤曲妥珠单抗敏感性的数据来之CALGB 150002研究，CALGB 150002是9840实验的相关实验，是一种随机的局部性检测，HER2阴性的乳腺转移癌接受含有或不含有曲妥珠单抗的紫杉

26、醇治疗。192例HER2:CEP17比例正常的肿瘤用于中央测试，其中38例（20%）发现高CEP17计数（多倍体性）（CEP172.2）。绝大多数的这些多倍体性肿瘤（34/37, 92%）中，检测到HER2过表达为阴性/可疑（IHC 0/1+/2+）。与HER2阴性病例相比，HER2未扩增的多倍体性肿瘤患者使用紫杉醇加曲妥珠单抗治疗比单独使用紫杉醇治疗的总反应应答率跟高（63%比26%，p=0.048）。这些数据提示曲妥珠单抗可能对多倍体性HER2未扩增肿瘤有效，即使IHC无明显的阳性结果。相反的，一个阶段的EGF30001实验分析显示，对HER2未扩增的多倍体性乳腺转移癌患者，使用一线的拉帕

27、替尼加紫杉醇治疗与单一的紫杉醇治疗相比没有明显的益处。高CEP17计数（多倍体性）的影响在阶段的赫赛汀辅助治疗（HERA）实验回顾性分析中进行了评价，这个实验随机选择HER2 +的早期乳腺癌患者给予完整的局部治疗和至少4个周期的(新的)辅助化疗，然后进行1或2年的曲妥珠单抗治疗或接受单独观察。2030例具有FISH阳性比例的患者中，883例（43%）高CEP17计数（多倍体性）（30%的细胞核中含有3个CEP17信号）。重要的是，在这些HER2 +的群体中（IHC 3+ 或HER2:CEP172.0），曲妥珠单抗使高CEP17计数（多倍体性）或非多倍体性肿瘤患者的DFS获益一致。这些结果提示，

28、HER2 +的早期乳腺癌患者辅助曲妥珠单抗治疗的功效未受高CEP17计数的影响。只有41例患者诊断为HER2 +而FISH比例<2.0；这个数字太小，而无法确定辅以曲妥珠单抗治疗是否有效。高CEP17计数（多倍体性）可能同时预示着肿瘤能对其他疗法产生应答。比如，通过基因扩增或17号染色体多倍体性，增加拓扑异构酶基因的拷贝数，与蒽环类癌症辅助药物治疗的敏感性有关。真正的多配体性还是CEP17扩增？标准ISH分析普遍认为，CEP17信号的数量相当于17号染色体的拷贝数。但是，使用多探针FISH或多重连接探针扩增（MLPA）同时评价几个17号染色体上的基因，结果显示，包括着丝粒的中心扩增时CE

29、P17信号大量增加的主要原因。171例明显多倍体性（CEP17>2.6）的乳腺癌中，只有24例（14%）显示在同一染色体上CEP17，HER2，SMS，RARA，和TP53的拷贝数增加量相同。相同的，17号染色体的17个MLPA分析发现，在111例乳腺癌中无一例为真正的多倍体性肿瘤，尽管通过CISH检测有19%显示CEP17增加。分子核型分析研究已确定了在乳腺癌中真正的17号染色体多倍体性很少。比如，Marchiò等使用基因体杂交芯片比较法（aCGH）对18例具有明显17号染色体多倍体性（CEP3）乳腺癌肿瘤的17号染色体情况进行了详细分析。只有一例显示染色体的长短臂同时增加，

30、而长短臂同时增加是真正多倍体体性的必备条件。而其余病例显示为含着丝粒的17号染色体增加（n=11），不含着丝粒的17号染色体增加（n=1），或者中心着丝粒扩增（n=5）。相同的，在一个97例乳腺癌样本的aCGH分析中，发现没有一例为真正的多倍体性，尽管其中有两例CEP17拷贝数增加。单核苷酸多态性染色体核型也同样显示真正的17号染色体多倍体性并不常见。这些研究共同说明CEP17拷贝数的增加并不能代替17号染色体多倍体性，并且先前认为的多倍体性情况事实上大多数只是染色体中心区域的增加。作者们的一致建议通过ISH观察到的CEP17信号的数量相当于17号染色体的拷贝数是一个错误的假设，这就可以解释多

31、倍体性的相关论文之间存在众多的不一致。含有不正常CEP17拷贝数的肿瘤可能是一类染色体增加或缺失的异质性肿瘤，其临床病理学特性可能依赖于特定遗传变异的出现。在研究设计过程中，我们推荐更多的使用成熟的技术（比如aCGH）来更加精确的定义肿瘤细胞中17号染色体的状态，以及帮助纠正乳腺癌患者中那些遗传变异的生物学意义。同时，那些研究结果已经影响了临床实践中HER2检测结果的解释（图1）。重要的是，单独使用HER2:CEP17比例可能误导为CEP17增加或缺失，从而分别导致对HER2扩增过低或过高的评价。因此，我们推荐将原始的ISH数据（细胞计数、绝对的HER2和CEP17信号）加入到报告中以辅助解释

32、。高CEP17计数的病例中，使用平均HER2拷贝数（6个拷贝）来判定HER2的状态是合理的。这个方法得到了在HERA实验中IHC染色强度和平均拷贝数的高度一致性，以及最近的一个1200以上乳腺癌病例研究中IHC和单一探针SISH结果高度一致性（98.3%）的支持。后面一项研究中，通过对单一探针与双探针ISH的对比分析，发现单一探针SISH的结果比双探针SISH与IHC结果更相关。尽管Bartlett等2008年推荐使用HER2:CEP17比例来评价高CEP17样本，这个研究中的大量数据显示真正的多倍体性是极少的。使用患者HERA实验筛查数据，我们估计平均拷贝数和HER2:CEP17比例的同时使

33、用将确定额外29个患者（所有FISH检测者的0.5%）进行曲妥珠单抗治疗的资格（J Rüschoff等，个人通讯）。Vanden Bempt等和Dal Lago等使用的相同方法将分别产生额外2.2%和1.5%的HER2 +患者。我们也注意到，在复杂病例中准确的IHC可以提供有用的支持信息。对于那些诊断图片仍然不清晰的患者，使用额外的ISH探针检测那些可被替代的参考基因可能可以帮助确定那些可疑的HER2状态，比如RARA和SMS。最终我们预期分子核型分析技术将对复杂病例中HER2状态的确定起到越来越重要的作用。存在不一致、可疑结果，或近中心染色体异体性的20个样本研究中，aCGH可以精

34、确的确定所有样本的HER2状态。值得注意的是，其中有16个17号染色体出现复杂重排的病例，然而其中一个病例为HER2低水平扩增的真正多倍体性肿瘤，以及第二个肿瘤为单倍体。总之，我们认为最好通过IHC评分、平均HER2拷贝数以及HER2:CEP17比例来确定HER2的状态。IHC评分为3+的样本应认定为HER2阳性（考虑选用易控制的方法进行评价），而无需考虑ISH结果和高CEP17计数（多倍体性）。当HER2的平均拷贝数6，IHC评分为2+时，肿瘤应评定为HER2阳性，而无需考虑HER2:CEP17比例。这样的策略将有助于确保那些能从曲妥珠单抗治疗中获益的患者，不错过这个潜在的保命机会。遗传异质

35、性肿瘤相关的基因突变常常表现为在肿瘤细胞中的不均匀分布。广义的说，HER2遗传异质性描述为众多具有清晰HER2扩增体征的肿瘤细胞亚群共同存在与同一个体中（图5和6）。这个术语包含了在同一肿瘤的相同或不同区域，细胞间的HER2状态不同的肿瘤异质性；以及原发性肿瘤和及其转移性肿瘤间的肿瘤异质性。两种主要的肿瘤异质性分布描述为：被包围的成簇模式的高扩增细胞，有时具有清晰的组织学结构和分级；马赛克模式，细胞亚群相互混合，尽管有人认为马赛克模式是ISH过程中造成的。遗传异质性在两个方面与临床相关。第一，异质性可以导致在同一种肿瘤中的两个不同区域之间HER2状态的不一致，这种不一致主要出现在活检组织和外科

36、手术样之间、原发性肿瘤和转移性肿瘤之间、不同实验室的检测结果之间，以及IHC和ISH之间。第二，HER2扩增肿瘤细胞亚群存在于其他未扩增肿瘤细胞之间，这已经成为讨论的话题，尤其是其对预后的意义以及是否能获益于曲妥珠单抗的治疗。遗传异质性的界定尽管遗传异质性在不同的HER2扩增区域上有不同的界定，一个评价不均一HER2扩增的标准方法由美国病理学会专家组发表于2009年。这个指南以含有>5%但<50%HER2:CEP17>2.2（或平均HER2拷贝数>6）的浸润性肿瘤细胞来界定遗传异质性。在异质性的病例中，专家同样推荐HER2扩增的浸润性肿瘤细胞比例与所有细胞分析中的平均值

37、一同报告，簇状时单独分析。这个指南具有一个清晰的目标，即让遗传异质性的界定标准化，以促进未来的临床相关研究，尽管并非基于结果型数据。尽管如此，有些人质疑这个指南在常规的组织病理学报告中意义不大。其他则认为，扩增细胞的上限应增加到95%，以使HER2扩增的肿瘤细胞在混合细胞中图5 通过不同的方法进行肿瘤的遗传异质性分析。(a)遗传异质性乳腺癌的IHC分析显示HER2阳性细胞呈簇状（棕色）。(b)同时FISH/IHC染色，显示异质性肿瘤细胞中HER2蛋白过表达（绿色细胞膜染色）和HER2基因扩增（红色信号）。(c)使用双抗原、双色原位杂交进行肿瘤遗传异质性分析（HER2，黑色；17号染色体探针，红

38、色）。HER2未扩增 HER2扩增遗传均一性 遗传均一性HER2扩增的遗传异质性 HER2扩增的遗传异质性（分散的扩增细胞） （扩增细胞簇）图6 简图说明乳腺癌样本(a)HER2未扩增，遗传同质性肿瘤；(b)HER2扩增，遗传同质性肿瘤；(c)扩增和未扩增肿瘤相互嵌合的遗传异质性肿瘤；(d)异质性肿瘤中成簇的扩增肿瘤被未扩增肿瘤包围。染色多边形代表HER2:CEP17正常（2.2）的细胞核；红色多边形代表HER2:CEP17升高（>2.2）的细胞核。占优势（50-95%细胞），并同时加入到定义中。有些研究者认为，扩增细胞的比例并非是一个判定肿瘤异质性的有效的度量。美国病理学会指南同时介绍

39、了一种评价ISH和IHC明显差异的方法：肿瘤细胞同质的要求ISH阳性结果扩增细胞50%，HER2阳性定义为IHC要求在>10%的细胞中具有满足条件的染色（FDA阈值）或>30%的细胞中有满足条件的染色（ASCO/CAP阈值）。在异质性肿瘤的相同肿瘤细胞群中同时发现HER2蛋白过表达和HER2基因扩增（图5），这个差异能够体现IHC和ISH结果之间的不一致性。意大利人类遗传学会（SIGU）对遗传异质性进行了界定，他们介绍通过细胞遗传学模式（低、高或无扩增）识别不同的细胞亚群，并报告各亚群的FISH比例。英国的指南界定遗传异质性：观测清晰区域扩增和未扩增肿瘤细胞的HER2:CEP17比

40、例。最近，Bartlett及其合作者认为对扩增肿瘤细胞按简单、复杂或远端扩增进行异质性分级，并提供这些病例的建议报告。遗传特异性的概率尽管美国病理学会界定的早期应用，发现在原发性乳腺癌中存在低概率（40/752,5%）的遗传异质性，但更多的近期研究发现三分之一或跟多的乳腺癌显示HER2扩增具有异质性（11-40%；表3）。值得注意的是，研究发现通过HER2:CEP17比例界定（23%）遗传异质性的概率远比通过HER2拷贝数界定（7%）要高，通过美国病理学会标准有效性提高HER2:CEP17表3 在发表的研究中按美国病理学会标准界定HER2遗传异质性时异质性的概率研究样本参数概率（%）Tubbs

41、等连续的原发性乳腺癌（n=742）HER2:CEP17比例5Öhlshlegel等连续的浸润性乳腺癌（n=218）HER2:CEP17比例15Allison等连续的临床乳腺癌（n=1329）HER2:CEP17比例HER2拷贝数237Chang等连续的乳腺癌（n=2522）HER2:CEP17比例26Bartlett等英国日常操作或临床实验的乳腺癌分析（n=6461）HER2:CEP17比例34Murthy等浸润性导管癌，IHC 2+（n=60）HER2:CEP17比例40Seol等浸润性乳腺原位癌（n=96）HER2:CEP17比例11缩略词：CEP17，17号染色体探针计数；HE

42、R2，人类表皮生长因子受体2；IHC，免疫组织化学。和HER2拷贝数的联系。其他研究发现，在HER2异常的患者（扩增和/或异质性，45%）与单单HER2扩增的患者（15%）相比，遗传异质性的概率提高了3倍。也有研究对肿瘤异质性的HER2蛋白过表达水平进行了考察（图5a和b）。在拉帕替尼和/或曲妥珠单抗辅助治疗优化（ALTTO）研究中，8490例患者中，有1091例患者的1-50%肿瘤细胞存在IHC 3+染色（G Viale，个人通讯）。同样的，在N9831研究中有3.7%的患者的10-30%肿瘤细胞中存在IHC 3+染色。遗传异质性对HER2状态确定的影响通过区域分析发现肿瘤遗传变异性可能导致

43、HER2状态的不一致，因此HER2检测时可能导致抽样误差。Brunelli等预计在13%的低级别HER2扩增肿瘤中显示区域性遗传变异，这可以影响其曲妥珠单抗治疗的合格性。同时，一个最近的研究显示，291例不相邻的乳腺癌中，最终的FISH状态取决于区域的选择、切片得分以及用于分析的细胞数量。作者还注意到，小范围的区域扩增可能因单一、随机的切片而无法检测到。在另一个含有20例遗传异质性原发性肿瘤和腋下淋巴转移肿瘤的研究中，70%丢失了少量HER2扩增肿瘤细胞。其他研究，在淋巴转移肿瘤中，扩增的肿瘤细胞只保留少部分（15%）或只保留了主要部分（15%）。总之，这些研究强调了标准评分方法确保ISH检测

44、准确度的必要性。目前，事实上完整切片或随机选择的特定区域或选择的危险区域的病理学评分存在广泛的差异。而且，市场上的ISH试剂盒对HER2阳性界定的阈值多样，有的通过检测特定数量细胞核（如，20或更多细胞核的FISH，双色CISH、SISH、BDISH、DDISH），有的通过检测一定比例的细胞（比如，>50%的细胞核进行单色CISH）。遗传异质性的预后及预测相关性美国病例学会专家组研究的目的是探索异质性界定的临床相关性。在对345个穿刺活检和手术切除样本的研究中，Öhlshlegel等发现遗传异质性与高CEP17计数（17号染色体多倍体性）（CEP17>2.25）、HER2

45、基因不成簇（每个细胞核含>16个拷贝）、高的组织学分级以及遗传不稳定性具有极大的相关性。但是，异质性在组织学、免疫组化和DNA检测变量等方面是不可预测的。遗传异质性对预后的影响在一个大规模临床试验结果和日常操作结果的研究（n=6461）中被评价。在这个研究中，发现含30%以上HER2:CEP17>2.2的细胞的患者与无扩增细胞的患者的5年无病生存率（DFS）没有显著差别，这表明低比例的扩增细胞不会存在差的预后。但是含有30-100%扩增细胞时，DFS降低。对含有30-50%扩增细胞的病例进行探索性分析，发现只有存在明确扩增细胞时患者预后才会变差，虽然DFS差异无统计学意义。另一个近

46、期研究（n=96）显示，差的DFS只与遗传异质性相关，而与同质的HER2扩增肿瘤无关。这些研究得到一个初步的结论，即HER2的细胞亚群扩增预后较差。从治疗的观点出发，主要问题是遗传异质性肿瘤是否会对曲妥珠单抗的治疗产生应答。尽管大多数病例通过HER2:CEP17比例或平均HER2拷贝数确定不适于曲妥珠单抗的治疗，遗传异质性肿瘤中含有具有重要意义的部分HER2扩增细胞，因此可能对HER2靶标治疗敏感。确实，可以在HER2阴性肿瘤中可以观察到曲妥珠单抗应答这个现象。在这方面，期待低HER2乳腺癌的辅助曲妥珠治疗NSABP B-47实验的结果。作者们的一致建议HER2评价的最新指南的一个局限性是定义

47、HER2阳性的IHC和ISH分析方法不同。IHC定义HER2阳性是根据阳性染色细胞的比例，而ISH定义HER2阳性是根据HER2平均拷贝数或HER2:CEP17比例。尽管美国病理学会定义遗传异质性时考虑到了ISH阳性细胞的比例，但也提到在样本中IHC和ISH方法检测HER2异常细胞比例的阈值也存在差异。因此，异质性病例中，在确保与FDA阈值（IHC 10%HER2阳性）一致的前提下，我们建议含有>10%HER2扩增细胞的肿瘤（在不同的视野下计数20-60个细胞）应判定为HER2阳性。我们推荐将扩增细胞的比例加入到临床病例诊断报告中。肿瘤中含有成簇、扩增的细胞亚群时应确定为HER2扩增（亚

48、群独立计数），而肿瘤中扩增细胞分散时，应根据总体的平均评分进行判定（图2）。遗传异质性的概率及其在HER2状态确定时采样误差较大，迫切需要规范ISH评分方法。我们强调扫描整个切片的重要性，以确保少量的扩增细胞不丢失。理想状态下，应选择两个以上典型视野，每个区域选择最少20个细胞进行评分，但在含有少量肿瘤的活检组织中可能无法实现。如果已确定存在异质性，则有必要对额外的细胞和/或视野进行评价；如果存在分散的HER2扩增细胞，则至少应对60个细胞进行计数。特殊情况下，对额外的肿瘤块和淋巴转移肿瘤（如果存在）进行检测，以避免丢失HER2明显扩增的区域。我们同时注意明视野ISH技术（CISH、SISH、

49、BDISH和DDISH）检测值对遗传异质性的评价，这些分析能够在光学显微镜下对整个切片进行评价。增加FISH检测可以减少染色体中心扩增细胞由于信号质量和增加了DAPI染色而被忽视的风险。另外，切片可在4小时内进行染色（J Rüschoff，准备阶段）。IHC也可以为ISH评价确定靶细胞，新开发的基因-蛋白联合检测分析可能成为一个有用的工具。最终，我们强调HER2扩增的遗传异质性肿瘤是否对曲妥珠单抗治疗应答的必要性。对曲妥珠单抗临床实验过得归档组织样本可能可以帮助解决这个问题，并确定判定是否有资格的标准可以推广到HER2+以外的遗传异质性肿瘤患者。如今，没有迹象表明曲妥珠单抗可用于含有

50、1-10%扩增细胞的患者。对于这些患者，我们推荐重新对不同肿瘤组织或淋巴转移癌进行检测。如果概率仍为1-10%，则该病例应判定为阴性，并且扩增细胞的比例应加入到病例报告中，这些患者很大程度上将得益于随后的远端转移癌复查。结论显然，评价HER2状态时，17号染色体多倍体性和HER2的遗传异质性是现在主要的诊断难题。本综述根据文献回顾和作者的临床经验，提出了一些建议，以帮助对复杂病例（总结于图1和2，以及表4）的HER2状态检测。我们希望这些组织可以在下一个HER2检测指南中被进一步的明确，以助HER2阳性乳腺癌患者的治疗。 表4 作者们的一致意见17号染色体多倍体性遗传异质性l 通过ISH观察到

51、CEP17拷贝数增加，并不意味着17号染色体存在多倍体性。l 如果已证明着丝粒存在异常，HER2拷贝数（平均6个拷贝）比HER2:CEP17更适合于界定HER2的状态。l 存在以下一个以上情况时，应判定为HER2+：IHC 3+；HER2:CEP172；HER2平均拷贝数6。O IHC 3+肿瘤应判定为HER2阳性（考虑使用以控制的评估方法），而无需考虑FISH结果或17号染色体多倍体性。O 当HER2平均拷贝数6，IHC评分为2+时，肿瘤应评定为HER2阳性，而无需考虑HER2:CEP17比例。l 在复杂肿瘤中，使用额外的17号染色体ISH探针（如SMS、RARA），或分子核型分析验证IHC

52、检测，以确定HER2的状态。l 未来的研究中，应利用aCGH或其他全基因组技术，进一步评估17号染色体异常（包括多倍体性）的临床意义l 为了保证IHC评价HER2状态时与FDA（阈值为10%）的一致，>10%HER2扩增细胞的肿瘤应判定为HER2阳性。l 为了避免遗传异质性区域的丢失，选择分析区域之前应对整个切片进行扫描。l 分析足够的代表视野（每个区域随机选择20个细胞），如果证明存在异质性，需对额外的视野和/或细胞进行评分。特殊情况下，对额外的肿瘤块和淋巴转移肿瘤（如果存在）进行检测，以避免丢失HER2明显扩增的区域。l 明视野ISH技术（CISH、SISH、BDISH和DDISH）

53、能够使整个切片在光学显微镜下进行评价，因此可能促进对异质性病例的评价。IHC也可以为ISH评价确定靶细胞。l 如果肿瘤出现成簇的扩增细胞，则这个肿瘤应界定为扩增，并且扩增细胞应进行独立评分。如果扩增细胞分散，以至少60个细胞的HER2:CEP17平均评分来界定病例是否扩增。l 含有1-10%HER2扩增细胞的患者，应重新对其他的肿瘤块或淋巴转移肿瘤进行ISH检测。如果概率仍为1-10%，则该病例应判定为阴性，并且扩增细胞的比例应加入到病例报告中，这些患者很大程度上将得益于随后的远端转移癌复查。l 未来的研究应对那些未被当前标准判定为HER2阳性而HER2扩增的肿瘤是否对曲妥珠单抗的治疗存在应答

54、进行评价。缩略词：aCGH，基因体杂交芯片比较法；BDISH，明视野双原位杂交；CEP17，染色体探针17；CISH，显色原位杂交；DDISH，双抗原、双色原位杂交；HER2，人类上皮生长因子受体2；IHC，免疫组织化学；ISH，原位杂交；FISH，荧光原位杂交，SISH，银染原位杂交。致谢支持此文的第三方写作援助来自加拿大罗氏有限公司。公开/利益冲突所有作者都加入了咨询委员会，并收到罗氏公司的酬金。MV也收到了罗氏公司的科研经费和演讲费。GV是Dako公司的一个顾问。FP MD是GSK的一个顾问参考文献1 Popescu NC, King CR, Kraus MH. Localization

55、 of the human erbB-2 gene on normal and rearranged chromosomes 17 to bands q1221.32. Genomics 1989; 4: 362366.2 Wolff AC, Hammond ME, Schwartz JN, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J Clin Oncol 2007; 25: 118145.3 Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987; 235: 177182.4 Press MF, Bernstein L, Tho