蒲公英酸奶对小鼠体液免疫的影响

1、    蒲公英酸奶对小鼠体液免疫的影响    孙立阳 霍文达 王兆兰 张灵智 孙晴【摘要】 目的：通過比较蒲公英酸奶、蒲公英黄酮酸奶和蒲公英黄酮汁对小鼠体液免疫指标的测定，探索蒲公英酸奶对小鼠体液免疫的影响。方法：首先以超声法从蒲公英中提取黄酮，并制备蒲公英黄酮酸奶。选取体重相近小鼠，随机分为四组，每组10只，常规饲养。各组分别每天早、晚各灌胃一次（0.5 ml/只）：一组生理盐水（空白对照组）、二组蒲公英酸奶（蒲公英酸奶组）、三组蒲公英黄酮酸奶（蒲公英黄酮酸奶组）、四组蒲公英黄酮汁（蒲公英黄酮汁组），连续灌胃4周。第5周取小鼠进行胸腺、脾脏免疫器官指数

2、测定、溶菌酶试验和小鼠抗体生成细胞水平测定其体液免疫功能。结果：与空白对照组相比，其他三组免疫器官指数均升高（p<0.05），溶菌作用均显著增强（p<0.01），溶血素含量、溶血空斑数均显著增多（p0.05）;与蒲公英黄酮汁组比较，蒲公英酸奶组的溶菌作用显著增强（p<0.05），溶血素含量、溶血空斑数均显著增多（p<0.05）。结论：蒲公英酸奶可明显提高小鼠体液免疫功能，且与蒲公英黄酮酸奶效果相当，该结果为蒲公英产品的开发提供了数据支撑。【关键词】 蒲公英酸奶 体液免疫 溶菌酶 溶血素effects of dandelion yogurt on humoral immu

3、ne in mice/sun liyang， huo wenda， wang zhaolan， zhang lingzhi， sun qing. /medical innovation of china， 2021， 18（14）： 0-014abstract objective： by comparing the effects of dandelion yogurt， dandelion flavone yogurt and dandelion flavone juice on humoral immunity in mice， to explore the effect of dande

4、lion yoghurt on humoral immunity in mice. method： firstly， flavonoids were extracted from dandelion by ultrasonic method， and dandelion flavonoid yogurt was prepared. mice with similar body weights were selected and randomly divided into four groups， 10 mice in each group， and they were reared routi

5、nely. each groups were given intragastric administration once in the morning and evening （0.5 ml/head）： the first group of physiological saline （blank control group）， the second group of dandelion yogurt （dandelion yogurt group）， the third group of dandelion flavone yogurt （dandelion flavone yogurt

6、group）， the fourth group of dandelion flavonoid juice （dandelion flavonoid juice group） were given intragastrically for 4 weeks. in the 5th week， mice were taken for thymus and spleen immune organ index determination， lysozyme test， and mouse antibody-producing cell level to determine their humoral

7、immune function. result： compared with the blank control group， the immune organ index of the other three groups were increased （p0.05）; compared with the dandelion flavone juice group， the bacteriolytic effect of the dandelion yogurt group was significantly enhanced （pkey words dandelion yogurt hum

8、oral immune lysozyme hemolysinfirst-authors address： school of pharmacy， linyi university， linyi 276000， chinadoi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.14.003蒲公英因其很高的營养及医疗价值，被国家卫生部收入药食同源目录，其应用开发情况也一直备受关注1-4。许多研究证实蒲公英提取物中的黄酮类化合物能参与哺乳动物体内的一系列酶系统，这些酶系统中包含一系列的反应，如血小板凝聚、消炎、抗氧化、清除自由基、防治糖尿病并发症等作用，具有增强机体免疫力的功效5-8。孙

9、珊珊等9报道：“蒲公英总黄酮能提高小鼠体液免疫功能”。酸奶可以激活全身的免疫系统功能，抑制肿瘤。与普通牛奶相比，其中的蛋白质更易吸收，发酵后产生的乳酸还能抑制有害微生物的繁殖，促进胃肠蠕动和消化液的分泌，提高多种矿物质的吸收率，从而提高人体免疫力。蒲公英酸奶是蒲公英和纯牛奶经乳酸菌发酵而成的微生态制剂，风味清新独特，是一种集营养、保健、爽口于一体的新型乳制品，具有较高的推广价值10-13。因此，本课题在以往研究基础上优化蒲公英酸奶的制作工艺流程，进一步探究其对小鼠体液免疫功能的调节作用，希望可以得出蒲公英酸奶能更好提高小鼠的体液免疫功能。而且，在全球特医产品快速崛起的大潮下为中药材资源的开发和

10、深加工开辟了一条新的途径，且为开发、深入研究蒲公英奶制品及其功能提供了参考。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 选择同批次的km小鼠，体重（20±5）g，雌雄兼用;新西兰家兔2只，体重（2.0±0.5）kg;豚鼠4只，体重（200±20）g。以上动物均采购于山东省农业科学院畜牧兽医研究所。小鼠基础饲料、兔饲料均购自南京盛民科研动物养殖场。1.1.2 药品与试剂 蒲公英采自临大校园（采集时间2019年3月3日-6月1日，每10天采集1次），洗净，50 烘干，粉碎过40目筛备用。芦丁对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：y05 m6s1）、乳酸菌（北京川

11、秀科技有限公司，产品标准号：q/tzcxg 0001）、伊利纯牛奶（购自超市）、金黄色葡萄球菌（微生物实验室提供）。1.1.3 仪器 kq-300de型数控超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司）、re-52a型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、uv-4802型紫外可见分光光度计尤尼科（上海）仪器有限公司、dr-3000系列酶标分析仪（无锡华卫德朗仪器有限公司）。1.2 方法1.2.1 蒲公英黄酮的提取和含量测定 称量蒲公英粉末240 g，加入70%乙醇150 ml浸泡30 min后，在60 80 khz的频率下超声提取3次，20 min/次，冷却后抽滤合并提取液，旋转蒸发回收溶剂，得提取浸膏。

12、1.2.1.1 标准溶液的制备 精密称取在120 减压干燥至恒重的芦丁标准品100 mg于100 ml容量瓶中，量取甲醇10 ml使之溶解，加蒸馏水定容至刻度线，精密吸取1 ml置10 ml容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，得芦丁标准溶液（0.10 mg/ml）。1.2.1.2 标准曲线绘制 精密吸取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分别置10 ml容量瓶中，按文献4方法显色。加蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15 min，于510 nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图1。回归方程：y=0.947 4x+0.001 6，r=0.997

13、9，在0.0050.05范围内线性关系良好。1.2.1.3 供试品溶液的制备 将混合超声提取液于80 旋转蒸发30 min得黄酮浸膏24 ml，放冷。取已得到的浸膏0.02 ml于50 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，得供试品溶液。1.2.1.4 供试品含量测定 取五份供试品溶液1 ml于10 ml容量瓶中，按1.2.1.2方法显色加蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15 min，于510 nm处测定吸光度。代入回归方程，得结果。1.2.2 实验分组及小鼠饲养 取40只小鼠，随机分成实验组和对照组，每组10只。实验组分蒲公英酸奶组、蒲公英黄酮酸奶组、蒲公英黄酮汁组三组，空白对照组为生理盐水。早

14、晚各组分别灌胃0.5 ml各组试剂。1次/d，持续30 d。常规饲料、自来水饲养。（1）空白对照组：生理盐水。（2）蒲公英酸奶组：称量药材粉末100 g，加水煮沸，浓缩成10 ml蒲公英汁，过滤放凉，备用。蒲公英汁10 ml牛奶240 ml1接种菌种装杯发酵（43 ，68 h）成熟（68 ，24 h） 检验蒲公英酸奶，备用灌胃。（3）蒲公英黄酮酸奶组：蒲公英黄酮膏10 ml牛奶240 ml1接种菌种装杯发酵（43 ，68 h）成熟（68 ，24 h）检验蒲公英黄酮酸奶，备用灌胃。（4）蒲公英黄酮汁组：取10 ml黄酮浸膏，加240 ml水稀释，得黄酮汁，备用灌胃。1.2.3 免疫器官指数测定

15、小鼠饲喂4周后摘眼球采血，分离血清，收集备用。然后脱臼处死小鼠解剖，取脾脏和胸腺，观察病理变化，称重计算脏器指数，脏器指数（mg/g）=脏器重量（mg）/体重（g）。1.2.4 溶菌酶的溶菌作用 首先制备含金黄色葡萄球菌的琼脂平板，用无菌打孔器在平板上打孔，用移液枪吸取新鲜收集的血清加入琼脂孔内，每孔加满，同时加鸡蛋清作阳性对照组，生理盐水做阴性对照组;置37 下1824 h观察结果14。观察各孔周围溶菌情况，用游标卡尺测量溶菌环直径。1.2.5 溶血素测定法测定小鼠体液免疫功能1.2.5.1 兔血红细胞悬液的制备 家兔心脏采血10 ml，4 000 r/min离心5 min，弃上清液;加与沉

16、淀等量的生理盐水，4 000 r/min离心5 min，弃上清液;4 000 r/min离心10 min，弃上清液，清洗2次得兔血红细胞。用生理盐水15稀释，得兔血红细胞悬液，调整兔血红细胞数为2×109个/ml，测定小鼠体液免疫功能时用作抗原。1.2.5.2 补体的制备 取豚鼠心脏血10 ml，4 000 r/min离心10 min，取上清，用生理盐水稀释，置于4 冰箱中备用，调整补体数为1.00×107个/ml，测定小鼠体液免疫功能时用作补体。1.2.5.3 小鼠血清分离 对饲喂后的每只小鼠腹腔注射0.2 ml兔血红细胞悬液，继续喂养4 d。于第5天眼球取血，处理样品，

17、2 000 r/min离心10 min，取上层血清，用生理盐水稀释500倍。1.2.5.4 小鼠血清溶血素含量測定 取1 ml已稀释好的血清置于试管中，加入兔血红细胞悬液0.5 ml，将试管置于冰浴中冷却，向试管中加入补体1 ml，再将其移至37 恒温水浴中，保温10 min，随即放置于冰浴中。2 000 r/min离心10 min，取上清液，酶标仪测其吸收度。经兔红细胞免疫后的小鼠，可产生兔红细胞抗体即溶血素，血清溶血素含量以半数溶血值（hc50）表示。计算公式如下式即抗体含量：hc50=（样品吸收度值/兔红细胞溶液半数溶血时的吸收度值）×稀释倍数。1.2.6 小鼠血清溶血空斑试验

18、 以2×109个/ml兔红细胞免疫小鼠，4 d后取出免疫和对照小鼠的脾。称重后用hanks洗涤并置含冷hanks的培养皿中，用针头冲洗脾脏直至变为白色，然后将细胞液收集于刻度离心管中（将试管置冰浴中）。用hanks悬浮细胞，调细胞浓度到2×106/ml脾细胞悬液，备用。在表层琼脂中加入牛胎血清、右旋糖酐、20%兔红细胞和脾细胞悬液各0.1 ml，然后倾注入铺有底层基的载玻片上，凝固后于37 孵育1 h。然后加1 ml补体，再次孵育30 min。用显微镜观察溶血空斑，并计数。1.3 观察指标 小鼠免疫器官胸腺、脾脏指数、溶菌酶的溶菌作用、溶血素含量、溶血空斑数。1.4 统计学

19、处理 采用spss 25.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以p<0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 蒲公英黄酮提取及含量测定 利用超声提取蒲公英黄酮。用紫外分光光度计对提取液吸光度测定，带入回归方程计算结果，见表1。2.2 小鼠免疫器官指数测定 蒲公英酸奶组、蒲公英黄酮酸奶组、蒲公英黄酮汁组脏器指数均显著高于空白对照组（胸腺：t=3.621 0、3.104 0、2.835 0，p=0.002 0、0.006 1、0.011 0;脾脏：t=3.449 0、2.895 0、2.886 0，p=0.

20、002 9、0.009 7、0.009 8）;但蒲公英酸奶组与蒲公英黄酮酸奶组脏器指数比较，差异均无统计学意义（胸腺：t=0.372 7，p=0.713 7;脾脏：t=0.359 8，p=0.713 7）;蒲公英酸奶组脏器指数与蒲公英黄酮汁组相比，差异均无统计学意义（胸腺：t=0.629 8，p=0.536 7;脾脏：t=0.416 0，p=0.682 3）。见表2和图2。2.3 小鼠体液溶菌酶的溶菌作用 四组小鼠溶菌酶溶菌作用的溶菌环：空白对照组为（1.50±0.32）cm、蒲公英酸奶组为（2.30±0.31）cm、蒲公英黄酮酸奶组（2.20±0.22）cm、蒲

21、公英黄酮汁组为（2.00±0.10）cm、阳性对照组为（2.40±0.30）cm、阴性对照组无溶菌环出现，蒲公英酸奶组的溶菌环最大。蒲公英酸奶组、蒲公英黄酮酸奶组、蒲公英黄酮汁组的溶菌作用与空白对照组比较，差异均有统计学意义（t=5.683 0、5.647 0、4.368 0，p=0.000 1、0.000 1、0.000 4）;蒲公英黄酮酸奶组与蒲公英酸奶组溶菌作用比较，差异无统计学意义（t=0.849 0，p=0.407 1）;蒲公英酸奶组溶菌作用显著高于蒲公英黄酮汁组（t=2.773 0，p=0.012 5）。见图3。2.4 小鼠抗体生成细胞水平测定2.4.1 小鼠溶

22、血素含量的测定 四组小鼠溶血素：空白对照组为（284.18±27.40），蒲公英酸奶组为（359.01±34.50），蒲公英黄酮酸奶组为（349.78±33.77），蒲公英黄酮汁组为（324.18±34.55），蒲公英酸奶组的溶血素含量最高。蒲公英酸奶组、蒲公英黄酮酸奶组、蒲公英黄酮汁组溶血素含量与空白对照组比较，差异均有统计学意义（t=5.372 0、4.770 0、2.868 0，p=0.000 1、0.000 2、0.009 6）;但蒲公英黄酮酸奶组与蒲公英酸奶组比较，差异无统计学意义（t=0.605 0，p=0.552 8）;蒲公英酸奶组溶血素含

23、量显著高于蒲公英黄酮汁组（t=2.256 0，p=0.036 7）。见图4。2.4.2 小鼠溶血空斑数测定 四组小鼠溶血空斑数量：空白对照组为（80.71±5.37）个/106脾细胞，蒲公英酸奶组为（204.88±8.47）个/106脾细胞，蒲公英黄酮酸奶组为（203.34±5.87）个/106脾细胞，蒲公英黄酮汁组为（198.64±3.47）个/106脾细胞，蒲公英酸奶组的溶血空斑个数最多。蒲公英酸奶组、蒲公英黄酮酸奶组、蒲公英黄酮汁组的溶菌作用与空白对照组比较，差异均有统计学意义（t=39.260 0、48.748 0、58.322 0，p=0.00

24、0 1、0.000 1、0.000 1）。蒲公英黄酮酸奶组与蒲公英酸奶组溶菌作用比较，差异无统计学意义（t=0.473 0，p=0.642 2）;蒲公英酸奶组显著高于蒲公英黄酮汁组（t=2.155 0，p=0.044 9）。见图5。3 讨论本研究结果显示：无论是蒲公英、黄酮还是复合发酵的微生态制剂对小鼠的体液免疫功能均有提高作用，复合型酸奶作用更显著，但从蒲公英中提取黄酮做酸奶和直接水浸蒲公英酸奶在提高小鼠体液免疫功能上差异不显著。孙珊珊等9报道蒲公英根、叶、花总黄酮均有增强小鼠体液免疫功能的作用，其中花的作用最强。笔者也做了蒲公英不同部位黄酮提取，与文献9报道结果基本吻合，但花的数量是有限的

25、，限制了黄酮的大量需求，所以结合后期实验结果不难看出不用单独提取黄酮，直接用蒲公英浓缩汁做酸奶效果相当，这样既省时省力、节约成本，又不失蒲公英的其他营养成分，该结果为蒲公英产品的开发提供了科学依据。机体免疫由特异性免疫和非特异性免疫组成。胸腺和脾脏为体内主要的免疫器官，与体液免疫和细胞免疫均有密切关系，而t、b淋巴细胞是反映机体特异性免疫功能最重要的标志。而由b淋巴细胞介导的体液免疫功能主要由存在于血液、分泌液与组织液等大量体液中的抗体、补体、溶菌酶、细胞因子来完成15-16。本实验通过免疫器官指数、血清溶菌酶抑菌圈测定和以溶血空斑计数、溶血素法hc50观测蒲公英、黄酮、乳酸菌、蒲公英酸奶对小

26、鼠体液免疫功能的影响，且是以兔红细胞代替绵阳红细胞17。由于时间和经费的限制对小鼠体液免疫功能的检测项目还不够全面，缺少对免疫细胞因子的测定，实验动物在饲养过程中偶尔有死亡造成样本的不足，所以在实验操作方法和研究范围上还需深入细致全面的探究。蒲公英是集药用、食用、化工用途等多种功用于一体的天然植物，目前对其相关产品的开发空间还相对较大，对其新产品定位、质量控制均有很大的提升空间。为使这一丰富的资源得到充分利用，有必要从技术创新上实现对其产品的深入研发。蒲公英种类繁多，鉴于自然资源的丰富性，对其他品种利用和开发工作也有待展开，以期这一味药食同源的传统药材能为人类健康做更好的服务。参考文献1国家药典委员会.中国药典：一部m.北京：中国医药科技出版社，2015：352.2谢沈阳，杨晓源，丁章贵，等.蒲公英的化学成分及其药理作用j.天然产物研究与开发，2012，24（b12）：141-145.3王秋亚.蒲公英有效成分的提取及应用研究进展j.江苏农业科学，2016，44（8）：21-24.4张令文，许红芳，孙科祥，等.蒲公英总黄酮的提取