基础生物学实验(二)_基础生物学实验(安徽大学生物研究生复试,生命科学学院)

1、基础生物学实验基础生物学实验(二二)生态与环境技术生态与环境技术 （ 2005）实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 实验十一 实验十二 实验十三 实验十四 微生物实验部分微生物实验部分 一、实验目的：一、实验目的： 1、学习微生物涂片、染色的操作技术、掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法； 2、初步掌握无菌操作技术； 3、学习并掌握油镜的原理和使用方法。 微生物(Microorganism)是所有形体微小，单细胞或虽为细胞，但个体结构较为简单，甚至没有细胞结构的，一般无法用肉眼直接观察，须借助于光学显微镜或电子显微镜才能看清它们的外形的低等生物的统称。它

2、们广泛分布于土壤、空气、水域或动植物体以及人体以外。在自然界中，微生物种类繁多，目前已知的大约10万种以上。如没有细胞结构的病毒(包括噬菌体)，单细胞的细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体；属于真菌的酵母菌、霉菌或单细胞的藻类以及原生动物等均属微生物。研究这些微生物的生命活动及其与周围环境相互关系的科学称为微生物学(microbiology)。 1、种类繁多，分布极广。2、形体微小，表面积与体积的比值大。 3、代谢类型多，代谢强度高。 4、生长繁殖迅速。 5、微生物容易发生变异。 微生物类群庞杂，种类繁多，包括细胞型和非细胞型两类，凡具有细胞形态的微生物称为细胞型微生物。按其细胞结构又可分

3、为原核微生物和真核微生物。原核微生物包括细菌、放线菌、蓝细菌及其相近的微生物如立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体、粘细菌、鞘细菌和蛭弧菌，它们是本章介绍的重点；真核微生物包括霉菌和酵母菌。 细菌(bacteria)是微生物的一大类群，在自然界分布，种类多，与人类生产和生活关系也十分密切，是微生物学的主要研究对象由于细菌的细胞结构在原核生物中具有代表性，近年来研究较为深入。 1、球菌、球菌 球形的细菌称为球菌，单独存在时为圆形，几个细菌联在一起时其接触面稍为扁平。按其分裂方向和分裂后排列状态，可以分为：单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌。 2、杆菌、杆菌细胞呈杆状或圆柱形，各种

4、杆菌的长度与直径比例差异很大，有的粗短，有的细长，短杆菌近似球状，长杆菌近似丝状。一般来说，同一种杆菌其粗细比较稳定，而长度则经常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。有的杆菌很直，有的梢弯曲，有的两端截平如炭疽芽孢杆菌，有的略尖，有的半圆。 细菌大小随种类不同差别很大，有的与最大的病毒粒子大小相近，在光学显微镜下勉强可见，有的与藻类细胞差不多，几乎肉眼就可辨认，但多数细菌居于二者之间。尽管细菌细胞微小，采用显微镜测微尺能较容易、较准确地测量出它们的大小。球菌的大小以其直径表示，杆菌和螺旋菌以其长度与宽度表示，不过螺旋菌的长度是菌体两端点间的距离，而不是真正的长度，它的真正长度应按其螺旋的直径

5、和圈数来计算。 微米micrometer,缩写m，1微米=10-3毫米(mm)是测量细菌大小的常用单位。最小的细菌只有0.2微米，最大的可达80微米，但一般不超过几微米。球菌直径多为0.5-1微米；杆菌直径与球菌相似，长度约为直径的一倍或几倍。杆菌还可细分为小型杆菌(0.2-0.40.7-1.5微米)、中型杆菌(0.5-12-3微米)和大型杆菌(1-1.253-8微米)；螺旋菌为0.3-11-50微米。 二、原理：二、原理： (一)油镜：利用显微镜观察菌体时，总希望能看见最细小的部分，即分辨率要高。显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力，主要是由接物镜来决定的，它与物镜的数值孔

6、径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，显微镜的分辨力越大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出，所以，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了，显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的： 能辨别两点之间最小距离=/2NA 式中 =光波波长 NA=数值孔径 我们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55m，假如数值孔径为0.65高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为0.42m。而在0.42m以下的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不

7、出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的最小距离=0.55/21.25=0.22m。 因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍镜（NA=0.65）和放大率为24*的目镜，虽然总放大率为960*，但其分辨的最小距离只有0.42m，假如采用放大率为100*的油镜（NA=1.25）和放大率为9*的目镜，虽然总的放大率为900*，但却能分辨出0.22m间的距离。 微生物学研究用的显微镜的物镜有低倍镜10（16mm）、高倍镜（4mm）和油镜100（1.8mm）。油镜常标有红圈或黑圈，也有以“Ol(oilimmersion)”字样表示。

8、使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是一层油质，称为油浸系。这种有常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1.25，与玻璃相同，当光线通过玻片后，可直接通过香柏油进入物镜发生折射，如果玻片与物镜之间的介质为空气，称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线虽然减少，这样就减低了视野的照明度。 利用油镜不但能增加照明度，更重要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大率能由其数值孔径决定的，所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用公式表示。NA=n.sin。式中NA=数值孔径、n=介质折射率

9、、=最大入射角的半数，即镜口角的一半数。 所以，光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，的理论限度为900，sin900=1,故以空气介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，数值孔径也增大。如当光线入射角为1200，其半数的正弦为sin600=0.87。 以空气为介质时 NA=10.87=0.87； 以水为介质时 NA=1.330.87=1.15; 以香柏油为介质时 NA=1.520.87=1.32。 （二）、单染色：（二）、单染色： 由于细菌微小，无色透明，未经染色往往不易被识别，因此只有借助于染色法可使细菌着色，与背

10、景形成鲜明对比，便容易在显微镜下观察。 细菌的单染色的原理一般认为是微生物与各种不同性质的染料具有亲和力而被着色。由于细菌的等电点较低，pH25之间，故在近于中性的环境中，细菌多带阴电，易于阳性的碱性染料结合而着色，因此细菌染色我们一般都用碱性苯胺染料如美蓝、碱性复红、结晶紫、沙黄、孔雀绿等。 单染色是一种染料使所有细胞都染上相同的颜色，此法简便，适用于菌体一般形态的观察，但不能鉴别细菌，它是染色的基础，可以观察细菌的大小。 （三）、革兰氏染色：（三）、革兰氏染色： 革兰氏染色法是细菌学中一种重要的鉴别性染色方法，是1884年有丹麦医生Gram创立的，延用至今的经典染色法，经过革兰氏染色法后可

11、以把全部细菌分为G+和G-两大类，鉴定细菌时首先要使用革兰氏染色法。关于它机制众说不一，以前有很多解释，当前认为与细胞壁的结构和组成有很大关系。革兰氏染色阳性细菌肽聚糖层厚，含量多，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色，复染后不着色，不留结晶紫的颜色；而革兰氏染色阴性细菌肽聚糖层很薄，含量少，脂肪含量高，经乙醇处理后部分细胞壁脂类可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径变大或通透性增加，不能阻止溶剂透入，酒精将结晶紫与碘的复合物洗脱，细菌被脱色，经复染后染成红色，所有本实验的成败关键是酒精脱色，脱色不够将革兰氏染色阴性转变为革兰氏染色阳性，脱色过度将

12、革兰氏染色阳性变成革兰氏染色阴性。其次涂片要均匀、薄；再者菌龄也可影响染色性，菌龄老，陈旧的细菌培养物，往往G+转变成G-，一般做革兰氏染色用18小时左右的细菌培养物，不要超过24小时，以免影响染色性。 细 胞 壁 G+ G-厚度与强度厚、致密、坚韧薄、疏松肽聚糖数量、含量多层、含量高、占细胞干重4090%单层、含量低、占细胞干重510%脂类含量少、占细胞干重14%多 、 占 细 胞 干 重1122%磷壁酸（垣酸） + 外壁酸（脂多糖、磷酸、脂蛋白） +三、材料：三、材料： 四、操作步骤：四、操作步骤： 图1 单染色操作步骤五、结果：五、结果： 无菌操作技术：无菌操作技术是微生物学实验中重要的

13、方面。所谓无菌操作技术，是防止微生物进入人体或其他物体造成污染的操作技术。例如，医院在进行外科手术时，器械、手术室的灭菌就是防止微生物进入伤口造成感染。 微生物微小，无孔不入，在自然界的各个角落到处都有，空气、人的体表、口腔、食道等都有微生物存在，所以在实验时应严格进行无菌操作技术，防止杂菌污染。微生物实验的成败与无菌操作有密切的关系。 七、作业：七、作业：八、预习：八、预习：实验二实验二一、实验目的：一、实验目的： 二、原理：二、原理： 三、材料：三、材料： 四、方法及步骤：四、方法及步骤： 芽孢的特点是不能繁殖，休眠体，含水少、含脂高、不透明，对外界环境有很强的抵抗能力，有的芽孢在一定条件

14、下可保持活力数年甚至数十年之久，芽孢尤其能耐高温，像枯草杆菌的芽孢，在沸水中可存活1小时，破伤风芽孢杆菌可存活3小时，而肉毒梭状芽孢杆菌的芽孢可忍受6小时，即使在1800C干燥箱中仍可存活10分钟，这主要是2.6吡啶二羧酸与钙的复合物占芽孢干重515%的原理。 芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环节，它还是检验培养基灭菌彻底不彻底的依据。 芽孢染色的原理是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。细菌的芽孢壁比营养细胞的细胞壁厚，致密、透性低，着色和脱色都

15、比营养细胞困难。因此，一般采用一种碱性染料（孔雀绿）并在微火上加热或延长染色时间。我们采用加热的方法，使菌体和芽孢同时都染上色后，再用水冲洗脱去菌体的染料，此时仍保留芽孢的颜色，并用对照染料来染菌体，这样就将芽孢和菌体分别染成两种不同的颜色。其步骤如下： 取枯草杆菌制成涂片、干燥、固定； 用试管夹夹住玻片的一端，在涂片上滴加孔雀绿3 4滴； 加热5分钟使冒蒸汽，切勿煮干； 冷却、水洗（细水）； 蕃红溶液复染2 3分钟，水洗； 干燥、镜检； 结果：芽孢呈绿色，菌体呈红色。 2、荚膜染色法：、荚膜染色法： 有些细菌生活在一定营养条件下，可向细胞壁表面分泌一层松散透明、疏松、柔软、粘度极大，粘液状或

16、胶质状的物质即为荚膜。 荚膜的化学成分，主要是多糖、多肽、蛋白质、脂以及由它们组成的复合物脂多糖、脂蛋白等。 荚膜虽不是细胞的主要结构，但它是细胞外碳源和能源性贮藏物质，并能保护细胞免受干燥的影响，同时能增加默某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬细胞的吞噬。 产荚膜细菌 ，常常给生产带来麻烦，食品工业中的粘性面包，粘性牛奶，都是由于染了此类细菌引起的，对制糖工业威胁更大，由于产荚膜细菌的大量繁殖，增加了糖液粘度，影响了过滤速度，使生产蒙受损失。但在一定条件下，有害的东西可变为有益的物质，如肠膜明串珠菌，在人为控制下，让其利用蔗糖合成大量产荚膜物质葡聚糖。葡聚糖是生产右旋糖酐的原料，而右旋糖酐

17、是带代血浆的主要成分，具有维持血液渗透压和增加血溶量的作用，临床上还用于抗休克、消肿和解毒，所以在医学上十分重要。荚膜比菌体要大。 其染色原理是荚膜包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，它是由多糖类衍生物、糖原或多肽所聚积而成，此层对染料结合力很弱，因此不易染色，故一般采用负染色的方法，使细菌和背景着色，背景与菌体之间形成一透明区即荚膜，便于观察，由于荚膜很薄，容易变形，在制片是一般不用加热固定。其步骤如下： 取钾细菌一环，做成涂片，自然干燥（不能加热干燥）；碳素墨水（用平整载玻片顺菌液刮过）；风干；甲醇固定；水洗；蕃红溶液12分钟；自然干燥、镜检；结果：背景黑色、荚膜无色、菌体红色。 五、绘图

18、：六、预习： 实验三实验三一、实验的目的一、实验的目的 二、原理二、原理 营养菌丝：又叫初级菌丝体或一级菌丝体，匍匐生长于培养基内，主要生理功能是吸收营养物，故亦称基内菌丝。营养菌丝一般无隔膜，直径0.20.8，但长度相差很大，短的小于100，长的可达600以上，有的无色素，有的产生黄、橙、红、紫、兰、绿、褐、黑等不同色素，若是水溶性的色素，还可透入培养基内，将培养基染上相应的颜色，如果是非水溶性（脂溶性）色素，则使菌落呈现相应的颜色，因此，色素是鉴定菌种的重要依据。 气生菌丝：又称二级菌丝体。营养菌丝体发育到一定时期，长出培养基外并伸向空间的菌丝为气生菌丝。 孢子丝：当气生菌丝体发育到一定程

19、度，其上分化出可形成孢子的菌丝即孢子丝，又名产孢丝或繁殖丝。放线菌最突出的特性之一是产生大量的、种类繁多的抗生素，根据估计，全世界共发现4000多种抗生素，其中绝大部分是由放线菌产生的。 2 2、霉菌：、霉菌： 霉菌是一些“丝状真菌”的统称，不是分类学上的名词。凡是在基质上长成毛状、棉絮状或蜘蛛网状的丝状真菌统称霉菌。 霉菌形态比细菌、放线菌复杂，个体比较大，具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。因此，在观察是要注意菌丝的直径大小，菌丝体有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性繁殖或有性繁殖时形成的孢子是哪一种，孢子是怎样着生的。 由于霉菌的菌丝较粗大，而且孢子容易飞散，如将菌体置于水中容易变形，故观察时

20、状不用水浸法制片，而将菌体置于乳酸石炭酸棉兰染液中，使细胞不易干燥，并有杀菌作用。 三、材料三、材料 四、方法及步骤四、方法及步骤 图 扦片法 2、霉菌：、霉菌：在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉兰用镊子取少许霉菌（三种）于染色液中挑开菌丝盖上盖玻片镜检。 六、作业六、作业 七、预习七、预习 实验四实验四 一、实验目的一、实验目的 二、原理二、原理 计数板是一块特制的厚载玻片，玻片上有四个槽构成三个平台，中间的平台又由一短的横槽隔成两半，其上各刻有一个小方格网。每个方格网共分9个大方格，只有中央的大方格供计数用称为计数室，其边长为1mm，共刻有400小方格，当加盖玻片于突起部分上面时，计数室即形成

21、一个体积为0.1立方毫米（面积为1平方毫米，深度为0.1毫米）。计数板的规格有两种，一种是25中方格16小格=400小格，另一种是16中方格25小格=400小格，但其总体积均为0.1立方毫米（见图）。 将要数的样品（酵母菌）做成悬液，加一滴在计数板上，盖上盖玻片，就可以根据显微镜下观察到的每小格内平均的酵母菌细胞数，计算出每ml培养液中酵母菌的总数。其计算公式如下：、1625的计数板 酵母细胞数1ml=100小格内菌数/100400103稀释倍数2516的计数板 酵母细胞数1ml=80小格内菌数/80400103稀释倍数五方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数B，1ml=1立方厘米=1000立方毫米

22、。 总菌数=A/525101000B。 2、显微镜测微技术：、显微镜测微技术： 微生物的大小通常用测微计来测量，测微计分别有接目镜测微尺和镜台测微尺两部分。接目镜测微尺是一块圆形玻片，在中央有一带刻度的尺，等份成50或100小格，而每一格的大小是相对的，在同一接目镜下，它是随不同放大率的物镜而改变其相对比例；镜台测微尺为一块载玻片，上面胶有一圆形玻片，其中央部分有精确的刻度尺，刻度尺的长度是已知的，长度为1mm等份为100小格，每小格间的距离为0.01mm，即10微米。因为镜台测微尺是放置在载物台上，所以它每格的长度就是测量时的实际长度。在使用时，必须先用镜台测微尺来校正目镜测微尺，以求出在某

23、一放大率下，目镜测微尺每小格所代表的实际长度，然后将镜台测微尺换上标本，在相同放大率下测出标本上微生物占目镜测微尺几格，就可算出微生物的大小。 三、器材三、器材 四、方法及步骤四、方法及步骤 取已稀释到100倍（或50倍）的酵母菌悬液一管，用滴管滴一滴于盖玻片边缘，使菌液自行渗入（不能有气泡产生），多余的菌液用吸水纸吸干，置于显微镜下计数。 计数时，按计数板的对角线方法，数右上右下，左上左下，通常以记五个中格的菌值来代表计数室中的含菌量，即各角上的中格及中央的一个中格的酵母数（即80小格），每个样品计数需要重复两次，若数据相差太大，则要重复计数。 计数完毕后，将计数器在水龙头下冲洗，绝不能用硬

24、物洗刷，以防损坏计数室，洗完后自行凉干或用吹风机吹干，镜检观察每小格内是否有残留的菌体和其他沉积物，若不干净则必须重复洗涤至干净为止。 2 2、测微技术：、测微技术： 接目镜测微尺的校正： 接目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央刻有刻度尺，等份成50或100小格，每小格的长度必须经镜台测微尺校正后求得（见图）。 镜台测微尺为一块载玻片，在上面胶有一块圆玻片，其中央有精确的刻度尺，长度为1mm等分为100小格，每小格为10 接目镜测微尺装入接目镜内隔板（光栏）上，刻度向下，并把镜台测微尺置于载物台上。 先用低倍镜校对，调节至能清晰地看到镜台测微尺为止 移动镜台测微尺和旋转目镜测微尺，使两者的刻度

25、平行，并使目镜测微尺的“O”与镜台测微尺的一条线重合，然后找出两个尺的另一条线重合线之间两种测微尺上的格数 按照下列公式即可求出在低倍镜下目镜测微尺每格的长度：目镜测微尺每格长度（微米）=两条重合线间镜台测微尺格数10 两条重合线间目镜测微尺格数如：目测为30小格等于台测为20小格，已知台测每格为10微米，则20小格的宽度为2020=200微米，那么相应的在目镜测微尺上每格长度为（2020）30=6.6（微米）。 用同样方法校正并求出在高倍镜上目镜测微尺每格的长度。 （2）菌体大小的测定： 接目镜测微尺校正好后，将镜台测微尺从载物台上取下来，换上待测标本。 在高倍镜下，以目镜测微尺来测量标本的

26、长和宽各占几格，即可算出该标本的大小。 （1）将目镜测微尺校正结果填人下表接物镜接物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺每格代表的长度/m低倍镜高倍镜油镜 （2）将各菌测定结果填入下表 目镜测微尺宽长 微生物名称每格代表的长度/m目镜测微尺格数宽度/m目镜测微尺格数长度/m菌体大小范围/m酿酒酵母 果将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。 AB二室菌数/mL 各中格中菌数 12345 平均值 第一室 第二室 实验五实验五 培养基的制备与灭菌培养基的制备与灭菌 二、原理二、原理 1、培养基：、培养基：培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工的方

27、法配制而成的一种基质。它是微生物的生活环境，各种微生物对养分和培养基的物理、化学条件要求不一样，为了分离、培养、鉴定、保存和研究不同种类的微生物，就应当根据它们的需要，配制合适的培养基。微生物在培养基上生长、发育，必须在一定的最适酸碱度范围才能表现出它们最好的生命活动。不同的微生物对对酸碱度的要求不同，因此，我们在配制培养基时，必须调节培养基的pH值。 培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物理性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基 天然培养基：天然培养基：主要成分是复杂的天然有机物质，如马铃薯、玉米粉、豆饼粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，

28、这些复杂天然有机物质的成分不完全了解，每次所用的原料，其中各成分的数量也不恒定的天然有机物质配制成的培养基，如：牛肉膏蛋白胨、马铃薯、麦芽汁培养基。适用于生产上大规模培养微生物。 合成培养基：合成培养基：合成培养基是用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而成的培养基，也称化学成分明确的培养基（chemically defined medium），高氏一号培养基、查氏培养基等。一般适用于在实验室范围内研究微生物的形态、营养代谢、分类鉴定、生物测定、菌种选育和遗传分析等工作。 半合成培养基：半合成培养基：在以天然有机物作为微生物营养来源的同时，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基叫半合成培养

29、基。大多数微生物都能在此种培养基上生长，应用广泛，如，马铃薯葡萄糖培养基，很多霉菌都生长良好。 固体培养基：固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基，常用凝固剂有琼脂、明胶、硅胶，硅胶用于配制自养微生物的固体培养基；对于其他多数微生物来讲，琼脂最为合适，一般加入1.52.5%即可凝固成固体，如牛肉膏蛋白胨培养基等。此培养基可供微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等。 半固体培养基：半固体培养基：在液体培养基中加入少量凝固剂即配成为半固体培养基，如，加入0.20.7%琼脂作为凝固剂。用来观察细菌运动特征、鉴定菌种、菌种保藏和噬菌体的效价滴定等。 液体培养基：液体培养基：不加任何凝固剂

30、配好后成为液体状态的培养基。如，糖发酵液体培养基、蛋白胨水培养基等。常用于大规模的工业发酵生产、遗传学研究、生理代谢等基本理论的研究工作。 根据培养基的特殊用途可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基： 基础培养基：基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物质，常用的基础培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，也是作为某些特殊培养基的基础成分。 加富培养基：加富培养基：是在基础培养基中加入血、血清、动物组织提取液或植物组织提取液，主要用于对培养某些微生物要求比较苛刻的营养。 选择培养基：选择培养基：是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学条件的抗性而设计的培养基。一种是

31、根据某些微生物对碳、氮源等营养的特殊要求所设计的选择性培养基，就可以分离到能分解某些物质的微生物。如以纤维素作唯一碳源的选择性培养基，可以分离到分解纤维素微生物；无氮培养基可以分离到固氮微生物。另一种是根据某些微生物对一些物理、化学因素的抗性而设计的培养基，最常用的是在培养基中加入某些化学物质，以抑制不需要的微生物的生长繁殖。如在分离放线菌时，在培养基中添加10%的酚数滴可抑制细菌和霉菌的生长，又如分离霉菌的马丁氏（Martun）培养基。 鉴别培养基：鉴别培养基：是在基础培养基中加入某种化合物或化学试剂，某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与某种化合物或化学试剂能发生某种明显

32、的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与其他种微生物区别开来，如糖发酵培养基、伊红美蓝培养基 2、灭菌：、灭菌： 消毒与灭菌两者有不同的概念。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，而不能杀死全部芽孢，因此，消毒只是一种常用的卫生措施；灭菌则是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子，因此，灭菌后的物品是无菌的。灭菌的方法很多，有加热、过滤、照射和化学药品等。 加热法：加热法：又分干热灭菌和湿热灭菌两种。 a干热灭菌：干热灭菌：有火焰烧灼和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具（如镊子）等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上短暂烧灼灭菌。通常所说的干热灭菌是在

33、电热干燥箱内灭菌，此法适用于玻璃器皿（如吸管和培养皿）等的灭菌，在热空气1601700C下保温2小时进行灭菌。 b湿热灭菌：湿热灭菌：高压蒸汽灭菌发 此法时将物品放在高压蒸汽灭菌锅内1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分钟进行灭菌，时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以到达彻底灭菌为准。这种灭菌适用于培养基等的灭菌。间歇灭菌法 有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用于干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热1000C，30分钟，连续3天，第一天加

34、热后，其中的营养体被杀死，将培养物去出放室温下1824小时，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热1000C，30分钟，发育的营养体有被杀死，但可能仍有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间1015分钟，人用注射器和手术器械在有条件的地方，一般均采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法灭菌。 表 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵白蛋白含量/%30分钟内凝固所需的温度505625748018809061450160170灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系全部空气排2/3空气排l/2空气排l/3空气排空气全不排压力数MPaKg

35、/cm2Ib/in2出时的温度/出时的温度/出时的温度/出时的温度/出时的温度/0.030.070.100.140.170.210.350.701.051.401.752.1051015202530108.8115.6121_3126.2130.0l34.610010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121表 干热湿热穿透力及灭菌效果比较温度/时间/h灭菌透过布层的温度/ 20层10层100层 干热130-140湿热105.343861017210170.5101不完全完全 三、材料：三、材料： 1、药品、药

36、品：Nacl 蛋白胨 牛肉膏 可溶性淀粉 K2HPO4 Hcl NaOH 琼脂 葡萄糖 蔗糖 NaSO4 黄豆芽 马铃薯等。 2、器材：、器材：台秤 三角瓶 试管 漏斗 电炉 搪瓷杯（铝锅） 试管架 玻棒 滴管 称量纸 pH试纸 棉花 纱布 牛皮纸 棉线 灭菌锅 干燥箱等。 四、方法及步骤：四、方法及步骤： 1、一般培养基的配制：、一般培养基的配制： 称量：称量：按照培养基配方，称取各种成分； 熔化：熔化：在容器中先加入所需蒸馏水水量的一部分，依次将各成分加入，使全部溶解，最后补足水量。若用蛋白胨、牛肉膏等物质配制培养基时，需加热溶解，并补足因蒸发而减少的水分。配制固体培养基时，先将上述配好的

37、液体培养基加热到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热到琼脂完全溶化，在加热溶解过程中要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢。 矫正矫正pH值：值：初配制好的培养基，往往不能符合所需求的pH值，故必须矫正，用精密pH试纸，以1NHCl或1NnaOH调节至所需要的pH值。 过滤：过滤：用滤纸、棉花或双层纱布过滤。 分状：分状：根据不同的需要，可将制成的培养基分装于三角瓶或试管内，分装时取玻璃漏斗一只，装在漏斗架上，漏斗下连接橡皮管与一根玻璃管相接，橡皮管上夹一只弹簧夹，将培养基到入漏斗内，用左手拿空试管的中部，并将漏斗下玻璃管插入试管内，以右手拇指和食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃

38、管上端，使培养基流入管内（见图）。注意不要使培养基沾污上段管壁及管口，保持棉塞的干净。分装量根据试管大小和实际需要而定。制备试管斜面培养基时，每支的分装量约为管高1/5左右为度，液体培养基分装试管的量以管高的1/4左右为宜，三角瓶的分装量，不宜超过三角瓶的一半。 棉塞的制作与灭菌：棉塞的制作与灭菌：棉塞要做的形状、大小、松紧完全合适，紧贴管壁不留缝隙，正常的棉塞，头稍大些，约有2/5在外，3/5在试管内（见图1），塞好棉塞后，用牛皮纸包扎，置高压蒸汽灭菌锅中灭菌。 斜面培养基的制作：斜面培养基的制作：固体培养基经灭菌后，如果要做成斜面，则在取出试管后略为冷却，而后放置桌上，管口端放在木条上或其

39、他支持物上，使其倾斜，倾斜度以培养基正好形成斜面为准（见图2）。 无菌试验：无菌试验：培养基经灭菌后，必须先放进370C恒温箱内，经24小时后，若无微生物生长才能使用。 2、灭菌：、灭菌： 灭菌是微生物生产和实验的基本技术，其方法很多，因灭菌对象及设备条件不同而适当选用。下面分别介绍几种常用的灭菌方法。 干热灭菌：干热灭菌：这种灭菌法是利用热空气使物体升温，而导致物体上所带的微生物由于干热脱水而死亡。常用于空玻璃器皿、金属用具等的灭菌，对于带胶皮的物品、液体及固体培养基等不能使用此法灭菌。 使用步骤： 将要灭菌的器皿（培养皿、吸管等）包扎好，放入恒温干燥箱内。 接通电源，打开开关；旋动恒温调节

40、器至1600C，当达到此温度时，借助恒温调节器的自动控制，保持恒温两小时。两小时后，关掉电源，当温度降至与室温差不多时，打开箱门，去出灭菌物品，并将调节器旋转到“0”。 （2）高压蒸汽灭菌 此种灭菌方法的原理是在一密闭容器中，煮沸时形成的蒸汽不能扩散到容器外面去，而堆积在密闭的容器内，使蒸汽压力升高；随着水的煮沸，温度也就相应增高。利用过热的蒸汽来使细菌及其耐热芽孢蛋白质凝固变性，以致失去生命力，从而达到彻底灭菌的效果。 高压蒸汽灭菌是最有效的灭菌方法。一般在1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分钟进行灭菌，就可杀死一切微生物细胞及其芽孢或孢子。进行高压蒸汽灭菌的

41、仪器叫高压蒸汽灭菌锅。灭菌对象是培养基、玻璃器皿和各种不因高温处理而变质的物品材料。但对一些不耐高温、高压的溶液或培养基不宜用此种方法。 锅内加入适量的水，使水面与三脚搁架相平为宜。 打开灭菌锅盖，把要灭菌的材料装入锅内，注意不要放得太挤，防碍蒸汽流通，影响灭菌效果。 盖好灭菌锅锅盖，按对角线形式均匀拧紧锅盖上的螺栓，螺栓松紧一致，切勿漏气。 打开排汽开关，以排除锅内的冷空气。 打开电源，排除冷空气。水沸腾后，灭菌锅内就逐渐充满蒸汽，并将冷空气排出，待冷空气完全排尽后，关闭排汽开关。让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时。控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1.05k

42、g/cm2（15磅/英寸2），121.30C保持1530分钟。 灭菌所需时间到后，关闭热源。 让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至“0”时，打开排汽开关。 打开灭菌锅盖，去出已灭菌的物品及培养基。 将取出的灭菌培养基放入370C恒温箱中培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可使用。 （3） 间隙灭菌 有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用于干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热1000C，30分钟，连续3天，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物去出放室温下1824小时，使其中的芽孢发育成

43、营养体，第二天再加热1000C，30分钟，发育的营养体有被杀死，但可能仍有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。 (4)紫外线灭菌 紫外线是一种强杀菌剂，其波长在20003000之间都具有杀菌作用，其中以25002800者杀菌力最强。它的杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成o，再使O2氧化成臭氧(O3)或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）,O3和H2O2均有杀菌作用。它的杀菌作用随剂量的增加而增加，不同微生物对紫外线的敏感性是不同的。一般细菌经紫外线照射510分钟，即可死亡。接种室和接种箱常紫外线灯光作空气灭菌。由于紫

44、外线穿透力不强，故一般只适用于物体表面和环境的灭菌。为了加强紫外线的灭菌效果，在开灯以前，可以在接种室内喷雾苯酚溶液。室内的桌面和坐凳可用0.1%新洁尔灭溶液擦洗，然后再开紫外线灯光照射2050%分钟（视接种室大小而定），以杀死空气中各种微生物细胞及芽孢为原则，必要时，可做无菌检查。 五、为下一次实验准备：五、为下一次实验准备： 六、作业：六、作业： 七、预习：七、预习： 实验六实验六 微生物的纯种分离培养微生物的纯种分离培养 二、实验原理 在自然界里，微生物的种类繁多，数量很大，几乎都是杂居在一起的，为了适应工、农、医发展的需要，常常从自然界中分离，以获得新的种。土壤是微生物的大本营，在土壤

45、物质转化中具有多种重要作用，它与土壤肥力和植物营养有密切关系，同时又是工业和医药用菌的资源。纯种分离是从含有很多种微生物的自然材料中，通过稀释分离、划线分离、单细胞分离等方法，使它由单个的个体在固体培养基上繁殖形成单个菌落，由于此菌落是由一个个体繁殖而来的，故可获得了纯种。这种获得单个菌株纯培养的方法称为微生物的分离和纯化。 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有1.简易单细胞挑取法它需要特制的显微操纵器或其他显微技术，因而其使用受到限制。简易单孢子分离法是一种不需显微单孢操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。它采用很细的毛

46、细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。 2.平板分离法该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两方面：（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布

47、平板或平板划线等技术完成。 三、实验用品(一)材料 土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基、豆芽汁培养基。(二)器材 无菌培养皿、无菌吸管、无菌水、酒精灯、接种环、接种针、火柴等。 四、实验操作（一）好氧性微生物的分离1.连续稀释分离法（1）稀释土样 称1g土样，在火焰旁加到有99mL无菌水和少许玻璃珠的三角烧瓶内，将瓶子依左右方向振荡数十次，使土样与水充分混合，将菌分散，土样中的菌被稀释了100倍，土壤悬液的稀释度为10-2。用无菌吸管吸取土壤悬液lmL，加到一个盛有9mL无菌水的试管内，稀释1000倍制成稀释度为10-3。的土壤悬液，将此吸管在试管内反复吹洗3次，然后取

48、出，通过火焰，再插入纸套内，以备再用。轻轻摇动试管，使菌液均匀。再用刚才用过的吸管，插入试管内，反复吹洗3次，然后取出lmL菌液，加到另一支9mL无菌水中，制成稀释度为10-4的土壤悬液（图2-1）。用微量加样器亦需反复吸吹3次，用毕弃去塑料吸嘴。 同法按每级稀释10倍的次序得到lO-5、10-6的土壤稀释液，稀释完后，用最后一支吸管（或塑料吸嘴），由最小的稀释液（10-6）开始吸取0.2mL加到编号为10-6的培养皿，再依次分别从10-5、10-4试管中各吸取0.2mL稀释液，加到相应编号的培养皿内，每次吸取时，吸管都要在稀释液中反复吹洗几次。 图2-1 从土壤分离微生物操作过程 制备土壤稀释液称取士样10g，放人盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml(无菌操作见图2-2)加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、