蜂毒素诱导人Bel―7402细胞株恶性表型转化实验探究

1、蜂毒素诱导人bel-7402细胞株恶性表型转化实验探究【摘要】目的观察蜂毒素处理人bel-7402细胞株 后对其恶性表达行为的影响。方法 浓度为2 u g/ml和 4 u g/ml两个实验组，以全反式维甲酸作为阳性对照，从细 胞增殖的抑制、cona凝集及克隆形成能力、甲胎蛋白含量、 c-myc基因表达等方面进行观察。结果2 u g/ml和4卩g/ml 蜂毒素均能抑制bel-7402细胞株的增殖；蜂毒素处理后的 细胞凝集及克隆集落形成能力降低；甲胎蛋白含量下降； c-myc基因表达显著降低。结论低剂量蜂毒素能有效诱导人 bel-7402细胞株恶性细胞生物学行为的转化。【关键词】蜂毒素；人bel-

2、7402细胞株；恶性表型； 逆转；诱导【中图分类号ir2-031【文献标识码】a【文章编号】 1004-4949 (2013) 06-39-03恶性肿瘤是危害人类健康的严重疾病之一，普遍观点认 为，肿瘤细胞是从正常细胞转化成的不受控制地无限增殖的 细胞1。正常细胞的分化是有序、有限和有选择的基因表 达，而肿瘤细胞出现分化缺失、阻断和异常，可以说，肿瘤 就是一种细胞增殖和分化异常的疾病2。通过物理、化学 或分子生物学的方法，“诱导分化”和/或“诱导逆转”逐 渐成为肿瘤研究领域的热点。蜂毒素（melittin）是蜜蜂毒 的主要成分，为26个氨基酸组成的碱性多肽，生物活性高, 对多种肿瘤细胞有杀伤作

3、用3-4 o本研究拟观察低剂量蜂 毒素处理人肝癌细胞后对细胞恶性表型的影响，初步探讨其 抑制肿瘤细胞作用可能的发生环节。1材料1.1试剂与药品：蜂毒素为本科实验室采用凝胶色谱 法纯化制备（纯度97%）；全反式维甲酸（atra）、四甲基偶 氮瞠蓝（mtt）为美国sigma公司产品；rpmi-1640培养基 为美国gibco公司产品；刀豆蛋白（cona）为上海华舜生物 公司提供；甲胎蛋白单克隆抗体酶免检测试剂盒为瑞典 canag公司产品；omyc基因一抗为santa cruz公司产品。1. 2细胞株：人肝癌bel-7402细胞株引自中国科学院 上海细胞研究所，由长海医院中医科保存，常规接种于含 l

4、ooml/l小牛血清的rpmi-1640完全培养基中，在37°c, 50 ml/l c02饱和湿度条件下培养，取生长期细胞进行实验。2方法2. 1细胞增殖抑制及生长曲线：将人bel-7402细胞以 1 x 105/ml接种于24孔板中，24 h细胞贴壁后，分别加入 浓度为2 p g/ml和4卩g/ml的蜂毒素，阳性对照为10卩mol/1 的全反式维甲酸，阴性对照组加入等体积rpmi-1640培养基, 每个组别24孔x2板，于处理后取7个时间作用点（12h、 24h、48h、72h、96h、120h、144h）及 1 天-8 天时，每个浓 度各取3孔，用血细胞计数板，光镜下计数活细胞数

5、，计算 抑制率。2.2刀豆蛋白（cona）凝集试验：取相应处理组细胞, 稀释至浓度为1 x105/ml,取无菌96孔板，按相应组别，分 别向各孔中加入单细胞悬液looul；再加入不同浓度（100、 50、20、10、5 u g/ml）的刀豆蛋白 a （cona）溶液；置 37°c 环境中，振荡器上振荡15min,倒置显微镜下观察凝集情况。2.3平皿克隆形成试验：取生长良好的bel-7402细胞, 稀释成200个/ml.接种在24孔无菌培养板中，每孔0. 9ml, 每组设3个平行对照，待细胞贴壁后，加入相应药物，阴性 对照加等体积pbs,继续培养10天后作克隆计数，每50个 细胞为一个

6、克隆并照相。克隆形成抑制率二（对照组克隆数- 实验组克隆数/对照组克隆数）x100%o2.4甲胎蛋白含量测定：取生长状态良好的bel-7402, 稀释后加于无菌200ml培养瓶中，24 h细胞贴壁后，给予 相应药物及对照处理，于第1、3、5、7日收集培养液，真 空冷冻干燥，检测时溶于等体积pbs中。按照甲胎蛋白（afp） 检测试剂盒的操作要求，以酶联免疫检测仪，检测波长在 450nm颜色吸光度，产生的颜色深度与标本中afp的量呈正 比。2. 5 c-myc基因表达：无菌6孔板内置载玻片，贴壁后 给予相应药物处理，每组取3片，培养5天后，95%乙醇固 定。在固定好的细胞爬片上依次加入1： 100

7、稀释的鼠抗人 c-myc单克隆抗，生物素标记的二抗，辣根过氧化物酶标记 的链霉卵蛋白共同孵育，dab显色剂室温显色，乙醇脱水后 封片，200倍光学显微镜下观察。2. 6统计学处理：数据用x±s表示，spss 17. 0统计软件进行分析，经过方差齐性检验后，方差齐性采用单因素 方差分析(one-way anova)、多重比较采用lsd法，计数 资料进行描述性分析。p3.4甲胎蛋白含量测定：各组afp分泌量均呈波浪形变化，培养第1天处于较低水平， 各组间差别不大(p>0. 05),提示bel-7402细胞在贴壁过程 中较少分泌afp；培养及药物处理第3天，afp含量达高峰, 第5天

8、跌落。与阴性对照相比，相同处理天数，药物作用后 afp分泌量显著减少(p0. 05)o (表2)3. 5 c-myc基因表达：阴性对照组中c-myc基因在 bel-7402细胞株中呈强阳性表达，主要分布于细胞核及核周 边的细胞质区域，染成棕褐色，呈斑片或颗粒状。经蜂毒素 处理后，细胞内c-myc基因表达减弱，阳性细胞数减少。在 me 1-4组，见到的阳性细胞很少，呈淡黄色细小颗粒，分布 于胞质紧靠核的区域，在细胞核内几乎不表达。在atra组, c-myc基因表达也减弱，呈浅棕黄色颗粒，在核内表达较阴 性对照明显下降，但稍多于mel-4组。4讨论细胞分化的发生是由于遗传物质选择性的表达差异导 致

9、了来源相同的细胞形态、功能出现了差别，诱导分化是肿 瘤综合治疗的新手段，是指在某些因素的作用下，细胞的恶 性行为降低，形态学趋向成熟，主要从增殖能力、细胞形态、 功能变化、粘附聚集及相关基因表达方面进行研究。以往我 们的实验结果表明，蜂毒素在小剂量时对肿瘤细胞的杀伤作 用减弱，抑制增殖及诱导凋亡的作用增强5。本实验中， 以2 u g/ml和4ug/ml浓度的蜂毒素处理人bel-7402细胞 后，细胞总数减少但活细胞率保持在较高水平，细胞生长曲 线上升速率变慢，进一步证实低剂量蜂毒素对细胞增殖的影 响不是通过细胞毒效应介导的。同时，实验结果也与肝癌细 胞恶性程度密切相关的细胞凝集反应、克隆形成能

10、力及分泌 甲胎蛋白含量，经蜂毒素处理后，均出现明显降低，与空白 对照组存在显著差异，部分结果优于阳性对照atraoc-myc蛋白是一种核内蛋白,是c-myc基因的表达产物, 具有转录调控作用，几乎所有增殖旺盛的细胞均有表达，其 正常功能是使细胞产生增殖的未分化状态，其异常的高表达 可能使细胞产生分化不良，这是许多恶性肿瘤细胞的共性。 本实验中，经蜂毒素处理后的人bel-7402细胞c-myc基因 表达明显降低，细胞核内表达几乎缺失，故推测影响c-myc 的表达可能是蜂毒素诱导人bel-7402细胞分化转变的作用 环节之一，确切的作用机制值得进一步探讨。当然，诱导细 胞分化或逆转是一个复杂的过程

11、，可能是多通道、多靶点的 综合事件7,蜂毒素对此过程的影响仍需深入研究，值得 我们做更多的工作，为在天然小分子物质中寻找有效的诱导 分化物提供新依据和思路。参考文献1 郑杰编著肿瘤的细胞和分子生物学m上海科学 技术出版社，2011.2 詹启敏编著.分子肿瘤学m.人民卫生出版社，2005.3 陈永强，朱振安，郝永强，戴戎，张晨.蜂毒素 诱导骨肉瘤细胞u20s凋亡与坏死的实验研究.中西医结合学 报，2004.4 张晨，李柏，黄雪强，张亚妮，苏永华，凌昌全蜂 毒素对肝癌细胞bel-7402的增殖抑制作用.浙江中医药大学 学报.2007, 31 (5)： 560-564.5 张晨，李柏，吕书勤，李勇，

12、苏永华，凌昌全.蜂毒 素对人肝癌细胞线粒体膜蛋白7a6和凋亡相关基因产物fas 及其配体fasl表达的影响.中西医结合学报，2007, 5 (5)： 559-563.6 bosch a, bertran sp, lu y, garcia a, jones am, dawson mi, farias ef. reversal by rar a agonist am580 of c-myc-induced imbalance in rar a /rar y expression during mmtv-myc tumorigenesisjbreast cancer res. 2012.7 jo m, park mh, kollipara ps, an b