第3章__蛋白质的通性、纯化和表征

1、第第3 3章章 蛋白质的通性、纯化和表征蛋白质的通性、纯化和表征本节学习重点与目标本节学习重点与目标l掌握蛋白质的两性及胶体性质l掌握蛋白质分离和纯化的原理及方法；l掌握蛋白质相对分子量及含量、纯度的测定重点重点难点难点一、一、蛋白质的酸碱性质和等电点蛋白质的酸碱性质和等电点蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。 等电点：对某一种蛋白质来说，在某一等电点：对某一种蛋白质来说，在某一pHpH，它所带的正，它所带的正电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pHpH称为蛋称为蛋白质的等电点。白质的等

2、电点。在等电点在等电点时时，蛋白质在电场中不移动，蛋白质在电场中不移动,溶解度最小，粘度溶解度最小，粘度最大。可以用溶解度法、聚焦电泳法等测定等电点。最大。可以用溶解度法、聚焦电泳法等测定等电点。二、二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质分子直径在蛋白质分子直径在1-1001-100nmnm之间，在水溶液中具有之间，在水溶液中具有胶体溶液胶体溶液的通性。的通性。1 1、稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：稳定蛋白质胶体溶液的主要因素：蛋白质表面的亲水基团形成的蛋白质表面的亲水基团形成的水化层水化层将蛋白质颗粒彼此隔将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀；开，不会

3、互相碰撞凝聚而沉淀；两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集沉淀。集沉淀。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜半透膜，因此可以应，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。一旦电荷被中和或水化层被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从一旦电荷被中和或水化层被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中析出沉淀。溶液中析出沉淀。2、沉淀蛋白质的方法沉淀蛋白质的方法盐析法盐析法:大量的中性盐（大量的中性盐（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl），），使蛋白质使蛋白质脱去脱去水化层水化层而聚集

4、沉淀；不引起变性。而聚集沉淀；不引起变性。有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：破坏水化膜，降低介电常数，丙酮、乙醇等；破坏水化膜，降低介电常数，丙酮、乙醇等；重金属盐沉淀法：重金属盐沉淀法：pHpI时，蛋白质颗粒带负电荷，与重金属离子（时，蛋白质颗粒带负电荷，与重金属离子（Hg2+.Pb2+.Cu2+等）结成不溶性沉淀；等）结成不溶性沉淀；生物碱试剂和某些酸类沉淀法：生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于小于pI时，蛋白质带正电荷，易与生物时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。

5、酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸；钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸；加热变性沉淀法。加热变性沉淀法。三、蛋白质分离纯化的一般原则三、蛋白质分离纯化的一般原则纯化的实质：增加制品的纯度或比活力纯化的实质：增加制品的纯度或比活力一般程序：前处理、粗分级分离、细分级分离、结晶。一般程序：前处理、粗分级分离、细分级分离、结晶。电泳电泳 前前处处理理粗粗分分离离细细分分离离生物组织生物组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速离心解、差速离心选择性沉淀法选择性沉淀法亲和亲和层析层析离子交离子交换层析换层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水疏水层析层析吸附吸附层析层析1、前处理（、前

6、处理（pretreatment）：）：将组织和细胞破碎将组织和细胞破碎动物组织和细胞：电动捣碎机动物组织和细胞：电动捣碎机、匀浆器、超声波处理；匀浆器、超声波处理；植物组织和细胞：石英砂植物组织和细胞：石英砂+提取液研磨或用纤维素酶处理；提取液研磨或用纤维素酶处理；细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）如果所要蛋白质集中在某一细胞组分，用差速离心法收集细胞的某一组如果所要蛋白质集中在某一细胞组分，用差速离心法收集细胞的某一组分；分；如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。如果提取膜蛋白：

7、超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。2、粗分级分离（、粗分级分离（roughfractionation)一般用选择性沉淀法。一般用选择性沉淀法。（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析）分级沉淀法（盐析）等电点沉淀法等电点沉淀法有机溶剂分级沉淀法有机溶剂分级沉淀法3、细分级分离（、细分级分离（finefractionation)层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相和层析、疏水层析（反相HPLC）电泳法：凝胶电泳、等电聚焦、双向电泳等电泳法：凝胶电泳、等电聚焦、双向电泳等4、结晶（晶体保存）、结晶（晶体保存）结

8、晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度的一个的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。容易结晶。结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节调节pH。四、四、蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小的差异（一）根据分子大小的差异透析法：将样品装透析法：将样品装在透析袋里，半在透析袋里，半透膜阻留透膜阻留prpr分子，分子，以达到除去蛋白以

9、达到除去蛋白质溶液中小分子质溶液中小分子（盐、低分子酸（盐、低分子酸等）。等）。透析和超过滤法：都是利用蛋白质不能通过半透透析和超过滤法：都是利用蛋白质不能通过半透膜的性质除去样品中的小分子非蛋白物质。膜的性质除去样品中的小分子非蛋白物质。透析法：透析法：透析透析(dialysis) 利用透析袋把大利用透析袋把大分子蛋白质与小分分子蛋白质与小分子化合物分开的方子化合物分开的方法。法。透析进行透析进行透析完成透析完成超过滤法：施以一定的压力超过滤法：施以一定的压力强迫小分子物质通过半透强迫小分子物质通过半透膜，而按半透膜的筛孔大膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子。小截留相应的蛋白质分子

10、。 凝胶色谱法凝胶色谱法分子筛色谱。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子分子筛色谱。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。最先流出层析柱。Sephadexstructure(Left:molecule;Right:model)凝胶过滤的过程凝胶过滤的过程（二）根据溶解度差异的分离法（二）根据溶解度差异的分离法蛋白质的盐溶与盐析蛋白质的盐溶与盐析盐溶：是指在适当浓度的盐溶：是指在适当浓度的中性盐溶液中，蛋白质溶解度会提高的现象，中性盐溶液中，蛋白质溶解度会提高的现象，称盐溶。称盐溶。盐析：向蛋白质溶液中加入大量中性盐（盐析：向蛋白质溶液中加入大量中性盐（高盐浓度）时，会破坏蛋白高盐

11、浓度）时，会破坏蛋白质分子表面的水化层（即破坏了蛋白质在水溶液的稳定性因素）导质分子表面的水化层（即破坏了蛋白质在水溶液的稳定性因素）导致蛋白质的溶解度降低发生沉淀析出，称盐析。致蛋白质的溶解度降低发生沉淀析出，称盐析。常用的饱和硫酸铵沉淀法分离纯化蛋白质就是利用盐析的原理，不同常用的饱和硫酸铵沉淀法分离纯化蛋白质就是利用盐析的原理，不同的蛋白质对饱和硫酸铵的要求不同，所以，可以通过饱和硫酸铵的的蛋白质对饱和硫酸铵的要求不同，所以，可以通过饱和硫酸铵的分级沉淀法分离各种蛋白质。分级沉淀法分离各种蛋白质。（三）（三） 根据电荷性质的差异根据电荷性质的差异1、电泳法、电泳法电泳：在电场的作用下，带

12、电荷的蛋白质或核酸分子将向与其电荷电泳：在电场的作用下，带电荷的蛋白质或核酸分子将向与其电荷符号相反的电极方向移动的现象称为电泳。符号相反的电极方向移动的现象称为电泳。意义：用于蛋白质的分离、纯化鉴定和分子量的测定。意义：用于蛋白质的分离、纯化鉴定和分子量的测定。2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理基本原理：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，根据被分离物质在以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，根据被分离物质在电场的作用下产生不同的移动速度而分离的方电场的作用下产生不同的移动速度而分离的方法。法。聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶由单体由单体丙烯酰胺丙烯酰胺和交联剂和交联剂甲甲叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰

13、胺在催化剂的作用下聚合而成。网在催化剂的作用下聚合而成。网状的大小决定于丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的状的大小决定于丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度及两者的比例。浓度及两者的比例。SDS(sodium dodecyl sulfate)l若在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入若在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS，SDS是一种阴离子表面活性是一种阴离子表面活性剂，剂，几乎能破坏蛋白质中所有的非共价键，从而使多亚基蛋白质解几乎能破坏蛋白质中所有的非共价键，从而使多亚基蛋白质解聚，并使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质形状对迁移率的影响；聚，并使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质形状对迁移率的影响；lSDS带有很多负电荷，与蛋

14、白质结合以后，使变性蛋白质带上大量带有很多负电荷，与蛋白质结合以后，使变性蛋白质带上大量的净负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，蛋白质分子原的净负电荷，远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷有的电荷就变得无足轻重了，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，所以在同一电泳条件下，分子量成为决定蛋白质移动速度的差别，所以在同一电泳条件下，分子量成为决定蛋白质移动速度的唯一因素。分子量越大，受到阻力越大，泳动越慢。唯一因素。分子量越大，受到阻力越大，泳动越慢。lSDS可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量可将蛋白质解

15、离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量。3、等电聚焦、等电聚焦（1）基本原理）基本原理根据蛋白质分子的等电点进行分离。利用这种技术分离蛋白质混合物根据蛋白质分子的等电点进行分离。利用这种技术分离蛋白质混合物是在具有是在具有pH梯度的介质中进行，在外加电场作用下，各种蛋白质梯度的介质中进行，在外加电场作用下，各种蛋白质将移向并聚集（停留）在等于其等电点的将移向并聚集（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个梯度处，并形成一个很窄的区带。很窄的区带。（2）优点及主要用途）优点及主要用途加样位置和体积不受严格限制，分辨率很高，可测定加样位置和体积不受严格限制，分辨率很高，可测定pI，分离速度快

16、，分离速度快，分离的蛋白质不变性。分离的蛋白质不变性。可用于蛋白质和两性分子的分离分析和蛋白质可用于蛋白质和两性分子的分离分析和蛋白质pI的测定。的测定。（3）基本操作）基本操作1、胶的制备、胶的制备(需两性电解质）需两性电解质）2、加样和电泳、加样和电泳3、染色和脱色、染色和脱色4、离子交换层析法、离子交换层析法 层析柱层析柱记记 录录 仪仪 低温层析柜低温层析柜（1 1）基本原理）基本原理 利用被分离物质的电荷与层析载利用被分离物质的电荷与层析载体电荷的相互作用达到分离纯化。体电荷的相互作用达到分离纯化。基质：纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖、基质：纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖、层析载体由

17、基质和带电基团组成层析载体由基质和带电基团组成层析载体的种类：层析载体的种类：阳离子交换剂（带负电）阳离子交换剂（带负电）如：磺丙基（强酸型）如：磺丙基（强酸型）SP-Sephadex-O-(CH2)3-SO3H阴离子交换剂（带正电）阴离子交换剂（带正电）如：二乙基氨基乙基（中强碱型）如：二乙基氨基乙基（中强碱型）纤维素离子交换剂纤维素离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂盐浓度的微小变化就会直接影响它对蛋白质电荷吸附容盐浓度的微小变化就会直接影响它对蛋白质电荷吸附容量。量。因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中的盐离子因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中的盐离子强度和强度和

18、pH来完成。来完成。 蛋白质与离子交换剂间的主要作用：静电引力蛋白质与离子交换剂间的主要作用：静电引力（2 2）基本操作）基本操作1 1、样品准备、样品准备2 2、离子交换剂和层析柱的制备、离子交换剂和层析柱的制备选择合适的离子交换剂，进行预处理，柱床体积为样品体积选择合适的离子交换剂，进行预处理，柱床体积为样品体积的的2-52-5倍。倍。3 3、上样。、上样。4 4、目的蛋白的洗脱、目的蛋白的洗脱洗脱方式有逐步提高洗脱液的盐浓度（离子强度）和逐步提洗脱方式有逐步提高洗脱液的盐浓度（离子强度）和逐步提高洗脱液的高洗脱液的pHpH。5 5、洗脱液的鉴定和回收、洗脱液的鉴定和回收蛋白质成分常用蛋白

19、质成分常用280nm280nm紫外吸收法监测紫外吸收法监测（四）（四）亲和层析亲和层析亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子特有的亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，建立起来的一种有效的纯化方法。识别能力，建立起来的一种有效的纯化方法。配基：酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结配基：酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体等。构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体等。亲和层析的原理：亲和层析的原理：亲和层析的原理亲和层析的原理（五）高效液相层析（五）高效液相层析(HPLC) HPLC纯化蛋白质的报告大多局限于实验室规纯化蛋白质的报告大多局限于实验室规

20、模模(数毫克到数十毫克数毫克到数十毫克) Waters公司的公司的HPLC已备有大规模制备的层析柱。已备有大规模制备的层析柱。 将亲和层析的高分辨力和将亲和层析的高分辨力和HPLC的快速结合的快速结合 高效液相层析法的基本概念和分离理论与经典的液高效液相层析法的基本概念和分离理论与经典的液相色谱法及气相色谱法一致。相色谱法及气相色谱法一致。 高效液相层析仪高效液相层析仪 典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分。流动相用高压泵输入。测系统三部分。流动相用高压泵输入。一般用微量注射器直接进样，也可采用六通一般用微量注射器直接进样，也可采

21、用六通阀门进样。阀门进样。HPLCHPLC中所用的检测器最多应用的是紫中所用的检测器最多应用的是紫外吸收检测外吸收检测(UV)(UV)，灵敏度可达，灵敏度可达ngng水平。此外，还水平。此外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器等。等。 高效液相层析仪的结构简图高效液相层析仪的结构简图五、蛋白质相对分子质量的测定五、蛋白质相对分子质量的测定（一）（一）凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤所用介质为凝胶珠或称为凝胶颗粒，其内部为凝胶过滤所用介质为凝胶珠或称为凝胶颗粒，其内部为多孔网状结构多孔网状结构凝胶颗粒中具有大量微孔，

22、这些微孔只允许较小的分子凝胶颗粒中具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子进入凝胶颗粒内部，而大于胶粒微孔的分子则被排阻在外进入凝胶颗粒内部，而大于胶粒微孔的分子则被排阻在外洗脱时大分子随洗脱液先流下来，洗脱液体积小；小分洗脱时大分子随洗脱液先流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大脱体积大测定蛋白质分子量一般用交联葡聚糖作为凝胶，商品名：测定蛋白质分子量一般用交联葡聚糖作为凝胶，商品名：Sephadex测得几种标准蛋白质的洗脱体积测得几种标准蛋白质的洗脱体积Ve以相对分子质量对数（以相对分子质量对数（

23、logM）对）对Ve作图，得标准曲线作图，得标准曲线再测出未知样品洗脱体积再测出未知样品洗脱体积Ve从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量（二）（二）SDSPAGE（十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳）用用SDS和巯基乙醇（能打开二硫键）处理和巯基乙醇（能打开二硫键）处理蛋白质变性（肽链伸展）并与蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成结合，形成SDS-蛋白质蛋白质复合物复合物用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的相对迁用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的相对迁移率作图。同一电泳条件下，分子小，受阻小

24、，游动快，迁移率作图。同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小。移率大。相对分子质量大者，迁移率小。测出待测样品的相对迁移率测出待测样品的相对迁移率从标准曲线上查出样品的相对分子质量从标准曲线上查出样品的相对分子质量优点：快速，样品用量少。优点：快速，样品用量少。缺点：误差大，约为缺点：误差大，约为10（误差主要来源于（误差主要来源于迁移距离的测量误差）迁移距离的测量误差）此方法只能测得单体蛋白质、寡聚蛋白质的亚此方法只能测得单体蛋白质、寡聚蛋白质的亚基的相对分子质量基的相对分子质量（三）沉降速度法测定相对分子量（三）沉降速度法测定相对分子量离心分离离心分离

25、r/min1800025000r/min4000080000r/minl沉降速度：沉降速度： 在离心时，沉降分子在单位时间在离心时，沉降分子在单位时间t t（以秒计）内下沉（以秒计）内下沉的距离的距离x x（以（以cmcm计）。以计）。以v v表示。表示。 v= dx/dtv= dx/dtl沉降系数沉降系数（sedimentationcoefficient) ： 单位离心场沉降分子的沉降速度。单位离心场沉降分子的沉降速度。 dx/dt s= v /= v /2 2x x = 2v：沉降速度（：沉降速度（dx/dt）可以从实验测得。）可以从实验测得。：离心机转子每秒钟的角速度，以弧度：离心机转子

26、每秒钟的角速度，以弧度/秒计。秒计。x：从轴心到沉降界面的径向距离（以：从轴心到沉降界面的径向距离（以cm计）。计）。l蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于110-13 到20010-13 秒的范围。l取10-13 秒作为一个单位，称为沉降系数沉降系数单位，即S。 例：例：牛血清清蛋白的沉降常数为牛血清清蛋白的沉降常数为:4.410-13用用沉降系数沉降系数单位单位则为则为:4.4S原核细胞核糖体的沉降常数为原核细胞核糖体的沉降常数为:7010-13用用沉降系数沉降系数单位单位则为则为:70S由沉降系数s，可根据斯维得贝格Svedberg方程计算蛋白质的相对分子质量：(1)rRTsMDv斯维得贝格方程斯维得贝格方程R：摩尔气体常数（：摩尔气体常数（8.314J/(Kmol)）T：热力学温度（：热力学温度（K）s：沉降系数：沉降系数v：偏微比容（：偏微比容（蛋白质溶于水时为蛋白质溶于水时为0.74cm3/g）D:蛋白质的扩散系数（蛋白质的扩散系数（