IC50计算方法

1、IC50是指“反应”被抑制一半时抑制剂的浓度，这里的反应可以是酶催化反应、 抗原抗体反应等。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等 于50%寸所对应的浓度，IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱 导能力越强，该数值越低，当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程 度。半抑制浓度（或称半抑制率），即IC50。在间接竞争ELISA标准曲线中 是一个非常重要的数据，标准曲线是一个 S型曲线。ICELISA中，不添加抑制物质的对照孔的 OD值为B0，添加了抑制 物质的孔的OD值为BB/B0%就叫做结合率，在结合率为50

2、%时所对应的抑制物质的浓度 就叫做IC50。一般IC50的数值越小，说明你的抗体的特异性能越强！最小检测限为试剂盒标准曲线的最小的浓度，小于最小浓度或大于最 大浓度，即不在曲线范围内的都不准确，大于最大 浓度可以稀释后测。IC50为50%抑制浓度即B/B0=50%时所对应的浓度，半数抑制是用来 衡量抗体灵敏度的半数抑制越低，说明抗体的灵敏度越高。通常来说，试剂盒最大和最小量程应该是该 抗体用来检测标准品的检 测限，检测限分最大和最小检测限。检测下限一般为理论值，是根据标准曲线算出来的理论上可以检测到 的最小的值;定量限为实际检测时可以定量的最低的值；而最大检测限就是实际操作中抑制率达到100%

3、时的药物浓度。检测下限（LOD）对应的OD值：OD（LOD） =B0 3SD定量限（LOQ）对应的 OD 值：OD （LOQ ）= B0 10SD酶活力单位（U, active unit）酶活力的度量单位。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位 是指在特定条件（25 C,其它为最适条件）下，在 1分钟内能转化1 微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。酶活力单位：用来表示酶活力大小的单位，通常用酶量来表示。其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位（IU，又称U）。另外一个国际酶学会议规

4、定的酶活力单位是Kat，规定为：在最适条件下，1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。Kat 和 U 的换算关系：1 Kat=6 x 107U,1U=16.67n Kat酶的比活力（specific activity ）：是指每毫克质量的蛋白质中 所含的某种酶的催化活力。是用来度量酶纯度的指标。是生产和酶学 研究中经常使用的基本数据。酶的转化数（Kcat）:在单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数。生产中并不常用抑制剂和酶的结合速度要看情况而定，主要和你的抑制剂有关，许多情况 下结合得很快，但是也有 slow binding inhibitor（我最近做的一个就是，抑制剂和酶的平衡时间很

5、长，中途加根本看不出变化，必须吧抑制剂和酶一 起 incubate 15 分钟，然后用底物引发 ）.如果只是 IC50 ，一个底物浓度就够了。但是 IC50 会随底物浓度的变化而 变化，所以你要指定一个底物的浓度， 发表 IC50 的时候要注明你底物的浓 度。这个浓度如果没有任何依据的随意指定一个，感觉上就会不专业。如 果你已经有其它人关于这个酶和其它抑制剂的资料 （并且上面详细注明了 所用的酶和底物的浓度，还有对底物的 Km） ，你当然可以省事的在其它人 的底物浓度下测你的 IC50 。不过如果你没有详细的相关资料或者不很肯定 查到的相关数据，最好是先自己做一下这个酶的动力学曲线。具体怎么做

6、 动力学找本书上就有了。简单的就是根据相关资料 （新的酶就要看自己的感 觉了）设计几个底物浓度，然后调整加的酶的浓度使得所有速度曲线在引发 后的几分钟都是线性的，而且前几分钟消耗的底物量一定不要超过底物总 浓度的 10。底物的浓度你要高高低低地试几次，然后估算出Km 的大致值（加许多底物让酶饱和， 这个时候测出的速度应该是 Vmax, Km 就是使得 速度为Vmax 半的时候的底物浓度）。然后你设计1015个底物浓度点 上及5倍Km，下及1/5Km，注意Km附近点要密集些因为正是曲线的拐 弯处。情况好的话你就会拿到那个酶的 Michaelis-Menten曲线（X轴底物浓 度丫轴速度），处理后

7、得到Km和Kcat。我觉得最后指定的测IC50的底物 浓度要么是 Km ，要么是 3xKm 或 5xKm（ 饱和 ）。当然如果你有决心的话，最好是做个关于抑制剂的全动力学以得出Ki。具体的方法 就是选58个底物浓度点，然后在每个底物浓度下测 46个抑 制剂浓度的反应速度，我一般是为保准确每个数据点重复 23次，工作量 不小，但是 Ki 不受其它因素影响，直接表征抑制剂对酶的结合能力，是适 合发表的正式数据一、原理噻唑兰，简称 MTT ，可透过细胞膜进入细胞内， 活细胞线粒体中的琥珀脱 氢酶能使外源性 MTT 还原为难溶于水的蓝紫色的 Formazan 结晶并沉积 在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜

8、（ DMSO ）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。二、试剂材料准备与实验仪器1）对数生长期细胞2）受试因素（药物）3） MTT :以PBS配制成5mg/ml,抽虑除菌，保存在 4?C4） DMSO （二甲基亚砜）5) 96 孔板6）酶联免疫检测仪7）细胞培养箱三、实验步骤（实用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1X 104/孔，细胞浓度可以调整。2）置37C、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。3）加入不同浓度的药物，如 1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般 3天。4）小心吸去上

9、清， PBS 轻轻洗涤，再次离心，弃上清。5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5mg/ml,即卩0.5%MTT ），继续培养 4 h。6）终止培养（可离心，1000 rpm, 10 min），小心吸去孔内培养液。7） 每孔加入150 ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡 10 m i n ,使结晶物充分溶解。 在酶联免疫检测仪 490 nm 处测量各孔的吸光值。8）同时设置调零孔（培养基、 MTT 、二甲基亚砜）,对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。三、结果统计学

10、处理所有数值以x士 s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<005时为相差显著, p<0.01 时为相差非常显著。可以以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。四、注意事项与常见问题1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT 、二甲基亚砜。 对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、 MTT 、二甲基亚砜， 不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整， 并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。3）贴壁细胞加 MTT 前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加

11、入0.5%MTT，量为 20ul/孔。4）如果不使用 96孔板，培养基超过 100 ml， MTT 按照 10%的比例加入。5）MTT 一般4度保存两周，注意避光保存，或配制成 5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔 纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。6）对于DMSO ,溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长7）96 孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这

12、种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱 的次数和时间。8）注意细胞悬液一定要混匀， 已避免细胞沉淀下来， 导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。9）没有去掉上清直接加 DMSO ，沉淀会很难溶解。加 DMSO 前要把液体 吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板离心机 离心 96 孔板， 2000r， 5 分钟，然后吸掉上清。加入 DMSO 后可用排枪反 复抽吸助溶，溶解后尽快检测。10）为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为 指标检测孔。11）除置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打, 加快溶解，效果亦可；

13、或放入 37度放孵箱15分钟溶解结晶。12）关于如何计算IC50方法有多种（1）改良寇式法：lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）（2）Bliss法：自己查阅书籍（3） IC50计算软件，见下面附件（4）自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似!（5）在线求IC50或EC50:http:/chiry o. phar .nagoya-c u. ac.jp/javastat/JavaStat-j htm13）计算抑制率，公式（对照-本底）-（给药-本底）/（对照-本底）*100%.MTT试验的一些细节问题（一）细胞1选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培

14、养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞 数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证 培养终止致细胞过满。这样，才能保证 MTT 结晶形成酌量与细胞数呈的线 性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范 围先初筛 。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛 。切记！否则， 可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。3. 时间点的设定。在不同时间点的测定 OD 值，输入 excel

15、 表，最后得到 不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦 了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细 胞增殖抑制表现的最明显） 。4培养时间。200ul的培养液对于10的45次方的增殖期细胞来说，很难维持 68h ，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0 期而趋于静止，影响结果，我们是在 48h 换液的。5.MTT 法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做 MTT 时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致 MTT 比色 OD 值的升高。6 .理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。7 .实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔

16、加培养基、 MTT 、二甲 基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、 MTT 、二甲基亚砜，不同 的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8.避免血清干扰。用含 15胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会 影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般 选小于 10胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培 养液。（二）实验步骤贴壁细胞：1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100ul, 铺板使待测细胞调密度至 1000-10000 孔，（边缘孔用无菌 PBS 填充）。2.5%CO2 , 37 C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底

17、板），加入浓度梯 度的药物 ,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们 常在前一天下午铺板，次日上午加药一般5-7个梯度，每孔100ul,设3-5个 复孔.建议设 5个，否则难以反应真实情况3.5%CO2 , 37 C孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT ）,继续培养4h。若药 物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含 MTT 的培养液。5.终止培养，小心吸去孔内培养液。6每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分 溶解。在酶联免疫检测仪 OD490n

18、m 处测量各孔的吸光值。7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、 MTT 、二甲基亚砜）悬浮细胞：1收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1kl06/ml，按次序将补足的1640（无血清）培养基40ul ;加Actinomycin D （有毒性）10ul用培养液稀释l?g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20）;需检测物10ul;细胞悬液50ul （即5X104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加 100?（储存液 100 1640）。2.置37 C, 5%CO2孵育16-48小时，倒置显微

19、镜下观察。3. 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT ）,继续培养4 h。（悬 浮细胞推荐使用 WST-1 ,培养 4 h 后可跳过步骤 4）,直接酶联免疫检测仪OD570nm （ 630nm 校准）测量各孔的吸光值）4. 离心（1000转x10min ）,小心吸掉上清，每孔加入 100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min ，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm （ 630nm 校准）测量各孔的吸光值。5同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。（三）MT

20、T的配制MTT 一般最好现用现配,过滤后 4oC 避光保存两周内有效,或配制成 5mg/ml 保存在 -20 度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光 袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把 MTT 粉分装在 EP 管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT 变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT 有致癌性，用的时候小心 ,有条件最好带那种透明的簿膜手套 .配成的MTT 需要无菌， MTT 对菌很敏感；往 96 孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉 .配制MTT时用用PBS溶解，也有人用生理盐水配，60

21、 C水浴助溶。PBS 配方 :Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g调 ph 7.4定容 1L（四 ）关于细胞的接种 （铺板 ）细胞过了 30 代以后就不要用了 ,因为状态不好了 ;培养板要用好的（最好进 口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时最好按照预实验摸索出的密度接种 , 因为细胞密度在 10000/ml 左右 时，所测得的 OD 值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞 过密或者过少 ，增殖都会过快

22、或者过慢 ，其增值率线性关系不佳 。故而 MTT 细胞密度多采用10000/ml , 100ul/孔。细胞密度要根据不同细胞的特点来定 .如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到 105,贴壁细胞可为 103-104.其它的声音：1. 首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔 1000 个左右就够了，我认 为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。 10000/孔是太高了，这样即使药物有 作用， MTT 方法也是表现不出的，最佳点板浓度在 4000-5000/ 孔，太少的话 S

23、D 值会很大。2. MTT 本身就是比较粗的实验，增殖率 10% 左右的波动都不算奇怪。特别 是新手， 20的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。3. 我做的是肿瘤细胞的 MTT 实验 ,这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML 的浓度来接种的 ,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度，用过4000080000/ML的浓度都做过MTT实验,结果 发现做的结果比较好点的是 6000070000/ML 的浓度组的 .用 40000/M 的 浓度的组,由于细胞少 ,药物作用的梯度还是有 ,只是没有很好的线性关系 .还 有根据细胞生长速度以及

24、药物的特性 （有时间依赖性和浓度依赖性的药物 ） 来确定培养时间是 48 小时还是 72 小时 .注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量 不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为 误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟， CV 会在 8% 左 右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。首先说说我的一点经验：1. 吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的 3到 4倍，可能比较容易混匀。10ml的离心管里面最好装34ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。2. 吸管的吸液量最好在 1m

25、l 左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体， 管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量 1ml 多的吸管，总液量在 5ml 左右为益3. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。4. 吹打次数 100 左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打 3050 次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种 2 孔反复吹打 3 次，每吹打 3 次后枪头垂悬与细胞悬液中 5 秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。）5. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间 会由于枪头的冲力在孔底聚集一

26、堆 ，一般都在孔的底部中央 ，而周边很少， 这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快 也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左 3 下，向右 3 下，在往 返回复 3 下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。 （铺板技术是 MTT 实 验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞， 最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。（五）加入 MTT个人认为 MTT 最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的 MTT 的 适当比例，具体细胞数目和真正起作用的的 MTT 之间的关系确实不好确 定，我认为 MTT 多加一些比少加好一些MTT 的量各家报道不

27、同，一般是过量的，所以 10ul 即够了。如果不使用96 孔板，培养基超过 100ul ，MTT 按照 10%的比例加入 .加入 MTT 以后振 荡一下让 MTT 与培养基混匀，不过这个应该关系不大。如加入 MTT 后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大 ,另外MTT 稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜 .且在加 MTT 前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和 MTT 加在一起，看会不会起反应。如果不起反应，就不用去除含药物的培 液，直接加 MTT 即可。（六）如何清除上清1. 加 DMSO

28、前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这 之前先用平板离心机离心 96 孔板， 2000r ， 5 分钟，然后吸掉上清 （如果是 悬浮细胞，则推荐此法，悬浮细胞要离心2500rpmX 10min.且其做MTT最好 用圆底型 96 孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉 ,建议各孔吸 弃 150-160ul 即可 ）。2 .我每次将 MTT 加入后，再孵育四个小时，然后用离心机离心1000G,5min 。但是用枪小心地吸上清，还是会将一小部分蓝色结晶吸出。所以还是建议翻转倒扣的方法吧！3. 另外，可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸） 23 次，比用 “吸”的办法 更不容易使细胞

29、脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，发现紫色 结晶几乎没有肉眼可见的掉脱，但前提是你本身细胞贴壁要比较牢，半贴 壁生长的细胞容易脱离。假如药物作用时间长的话，阴性对照组可能由于 细胞过多而使加入MTT后形成的结晶漂起来，这样就不能直接倒掉上清。4. 做 MTT 时，这一步骤一定要小心，不要采用倒的方式。因为贴壁不牢的 细胞会被倒掉，从而影响 OD 值。悬浮细胞，不要翻板，离心后也不要翻板，这个方法害死人。5. 加完 MTT 反应 34h 后，从培养箱取出 96 孔板的动作要轻柔，避免振 荡结晶 ,使其滑落 .你可以试着将 96 孔板倾斜 30 度角，然后用枪尖慢慢吸， 有的细胞可以用排枪

30、一起吸，有的则要耐心的一个个用枪头吸，枪尖的力 度和方向要保证每个孔都一致。不要让枪头接触到孔底，且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平，这样也会使结晶脱落。6. 用医用的注射器加上针头吸取液体的，吸取时要把板子斜放，沿着壁吸取就好了！这次 MTT 我用 1ml 针头仔细吸培养液 ,觉得比其它方法可靠 ,一般不会吸走紫色结晶 .避免清除上清而改进的方法由于一般可离心 96 孔板的离心机不好找。既使是贴壁细胞做 MTT 时，用 DMSO 溶解得到结果也不好，不是得不到预期结果就是可重复性差。解决方法 1:用以下文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT 方法，中国医药工业杂志， 1993，24

31、 （10）：455-457具体方法：配三联溶解液： 10%SDS ，5%异丁醇， 0.012mol/LHCL ，蒸馏水溶解。三联溶解液： SDS10g ，异丁醇 5ml ，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml 溶液操作：在培养板上加一定密度的细胞悬液， 90ul 孔；如需给药，则再于同时（悬浮细胞）或4h后（贴壁细胞）加入不同浓度的药物10ul/孔，均设三 复孔。另外，每块板上另没一个调零孔 （只加培养液，不含细胞和药物 ）。培 养2d后，加入MTT溶液20ul /孔，继续培养4h，然后加入上述三联液 100ul /孔，于37度放置过夜后，用酶标仪测各孔 A570值。优点：简

32、化操作，提高了可靠性。解决方法 2：日本同仁有一种新试剂 CCK-8 试剂， CCK-8 试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有 WST -8其化学名称为： 2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基 ）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（ 1-Methoxy PMS ）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水 溶性的黄色甲 染料（ Formazan dye ）。生成的甲 物的数量与活细胞的数 量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。 CCK-8 试 剂中已预先配入了进行细

33、胞增殖和毒性分析所需的成分，无需再用缓冲液 或培养基进行稀释 ；同时， CCK-8 试剂无需任何放射性同位素和有机溶剂。 因此，无需特别的技巧，就可使每一位使用者准确、快速地得到重现性好 的实验结果。优 点1 、简 便 只需一步即可得到结果2、省 时 毋需预制，即开即用3、安 全 毋需放射性同位素和有机溶剂4、快 速 省去了溶解除沉操作5、灵敏度高 灵敏度高于 MTT6、重现性好 步骤少；无损失；结果准确就是比较贵，如果经费充足，用这个是不错的。进行细胞增殖分析的使用方法 :1、接种细胞悬液100 于96孔板内，预先置于37 C, 5% CO 2饱和湿度培养箱内培养。2、在每个孔内加入10 口

34、1的CCK-8试剂。3、把培养板放在培养箱内培养 1-4 小时*。4、在 450nm 波长处测定吸光度，参比波长为 600nm 或 600nm 以上。解决方法 3：使用 MTS解决方法 4：加入 DMSO 在同一批实验中最好不要更换 DMSO 。加 DMSO 前把孔中液体尽量弃干 净，没有去掉上清直接加DMSO, 是沉淀会很难溶解二培养液的颜色在 检测时也能被测到 ,会对最后结果造成影响。但前提是不能把细胞也一起吸 掉，因为这样带来的误差要远远大于培养液没弃干净带来的误差,所以要在保证细胞不被吸掉的前提下，尽量把培养液吸掉。如果培养液没弃干净， 空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量

35、去除培养液的影响，DMSO的量也可为100ul或150ul.1. 加了 DMSO 后用振荡器轻轻振荡 5 1 0min, 时间控制尽量严格一点 ,放置时间长了会影响结果 ,值会偏大,且结果不可信 .2. 加入 DMSO 后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。如果实验孔不多，建议用此法，因其比振荡溶解效果好。3.或放入 37 度放孵箱 15 分钟溶解结晶 振荡是为了让甲臜溶解，这样才能更好的测量吸光度，振荡 96 孔板有专的 振荡器，目的 :扎破气泡.有气泡存在时 ,由于其对光的反射与折射作用 （酶标 仪的原理是通过测定特定波长透过样品的吸光度推测样品内特定物质的浓 度 ）,会导致结果偏移 .

36、（七）0D值的测定至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于 DMSO，溶解后呈紫（红） 色， 490nm 有最大吸收值 ,而 ATCC 公司的 MTT 试剂盒用的不是 DMSO， 它的测定波长是 570。（就如 ELISA 实验选用 OPD 作底物测定波长是 492， 选用 TMB 显色液则用 450）;而对于 SDS 和酸化异丙醇，则选用 570nm ， 并且建议以 655nm 作为参考波长。DMSO溶后10分钟内测，越放颜色越深，而SDS做为溶解液测吸收光 值，其值可在三天内保持不变 .细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外 跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话

37、，吸光度值也会低的；细胞数目 少，或者是培养的时间短， OD 值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特 别明显的话说明有可能存在污染 ,空白孔的 OD 值太高，很可能是细菌污染 。 复孔直接的 OD 值差别一般应在 0.1 0.15 ，差别太大考虑： 1 .接种细胞数 不均匀，或是接种太多，应保证每孔一致，一般是每孔1000 10000 个。可以细胞细胞计数后，加入细胞悬液，再补培养基到预定体积，并轻轻吹 打几次，使细胞均匀分布，这样比直接加入预定体积的细胞悬液要好，接 种时应加含血清培养基。2贴壁时间：18 24h，如果不够，未悬浮的细胞会被吸掉一般为了实验的准确，每个浓度可以设 5 6 个复孔

38、，可以最后统计时，可 以除去一个最高值和一个最低值，或者除去其中数据离谱的值，这些离谱 数字的出现与细胞是否污染，细胞是否在培养期间死去，是否培养液蒸发 过多，加MTT液是否准确，在37 C, 5%二氧化碳培养箱中孵育时间是否 一定（14小时）等有密切的关系，当然测定 OD 值的仪器工作状态是否 正常也非常重要！ （一般开机预热 20min） 。MTT方法的吸收度在0.20.8之间误差较小。这和分析化学中的lamb ert -beer定律有关，对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中，经常 出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看 到通过原点向浓度轴弯曲的现象（吸光度轴弯

39、曲 ）。这种情况称为偏离朗伯 -比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。在吸光光 度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的 测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不 准确等。在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一 仪器，读数的波动对透射比为一定值 ；而对吸光度读数波动则不再为定值。 吸光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也越大透射比很小或很大时， 浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不 落两端。待测溶液的透射比T在15%65%之间，或使吸光度A在0.20.8 之间，才能保证测量的

40、相对误差较小。当 0.434（或透射比 T=36.8%） 时，测 量的相对误差最小。其它的声音：1.最好用 570nm 波长的滤光片，因为 MTT 在这个波长的吸光度是峰值， 换句话说灵敏度高。用其它波长的也有，一般是 490nm ，但我的经验灵敏 度降低一半。2.我们用的 BIO-TEK 公司的 ELx800, 一般值在 2 以下都是可靠的 ,如果复孔 之间值相差太大就要考虑是否是实验过程中的误差 . 我曾经看到园子的有 些帖子报道说 OD 值大概在 0.2-1.2 范围内与活细胞数有较好的线性关系 ， 但 OD 值在 0.3-0.9 范围内可能更佳 ，若你的 OD 值不在这个范围内则你实

41、验的细胞数可能不太合适，应调整你的细胞数。（八）边缘效应96 孔板四周一圈的孔一般只做空白，不养细胞，否则这四行的数据会偏高 或偏低 ,96 孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温 度，由于温度梯度使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓 度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度， 减少开关培养箱的次数和时间。解决方法 :将孔板周围的一圈孔全部不用， 影响非常大，而且最外一圈一定要加水、 PBS 或者培养液，只要能防止蒸 发就可以.（九）关于如何计算 IC50(1) 改良寇式法 :lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最

42、大剂量I:lg(最大剂量/相临剂量)P: 阳性反应率之和Pm: 最大阳性反应率Pn: 最小阳性反应率举个例子：各组浓度 0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001 ，稀释倍数为 10，最大浓度为 0.1，抑制率为 0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06 。代入计算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025(2)Bliss 法:自己查阅书籍(3)IC50 计算软件，见下面附件自己用EXCEL做趋势线来求IC50，关于LD50的方法与此相似！（5）在线求IC50或EC50 :http:/chiryo.phar .n agoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm（十）结果统计学处理所有数值以xis表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显 著，pv0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制 细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。细胞死亡率%=OD对照组-OD 实验组/OD对照组excel表中可以做两两比较的T-tes