差别PCR技术检测结直肠癌c

1、差别pcr技术检测结直肠癌c:曹虹然孙乔刘德赢白雪峰岳秀兰【摘要】 目的：探讨结直肠癌c-erbb-2癌基因扩增的临床意义。 方法：应用差别pcr技术检测52例结直肠癌患者在c-erbb-2癌基 因的扩增情况。结果:48.1% (25/52)的结直肠癌发现有c-erbb-2 癌基因的扩增；有淋巴结转移及dukes分期c+d期患者c-erbb-2基 因扩增率(72.0%及68.0%)分别高于无淋巴结转移及dukes分期 a+b期患者(25.9%及29.6%) ； c-erbb-2基因扩增与肿瘤组织学分 化和组织病理类型显著相关；伴有腺瘤性息肉的结直肠癌患者c- erbb-2基因扩增率高于不伴有腺

2、瘤性息肉的结直肠癌患者(100.0% 对43.5%, p<0.05) o结论：差别pcr技术检测c-erbb-2癌基因 的扩增是一种快速简便、灵敏可靠的方法；c-erbb-2癌基因的扩增 在一定程度上反映结直肠癌的分化状态和生物学行为，对结直肠癌 的预后和转移潜力是一种良好的判断指标，并可指导临床治疗。【关键词】结直肠癌；c-erbb-2；羞别pcr；癌基因扩增abstract objective:to explore the clinical significance of c-erbb2 oncogene ampilification in colorectal cancer

3、 (crc) methods: c-erbb 2 oncogene ampilification ined by differential polymerase chain reaction (dpcr) in 52 cases of colorectal cance匚 results: c-erbb-2 oncogene ampilification pilification incidence of c-erbb-2 in patients ph node metastasis and in dukes'stage c+d (72% and 68%) ph node metasta

4、sis and in dukes'stage a+b (25.9% and 29.5%),respectively(both,p<0.01). amplification of c-erbb-2 gene plification in the patients of colorectal cancer atous polyp atous polyp(100% vs 43.5%, p<0.05).conclusion: dpcr is a quick, simple, sensitive and reliable method to detect c-erbb

5、-2 oncogene amplification. to some extent, the amplification of c-erbb2 oncogene represents the differentiation and biological behavior of colorectal cancer, thus can be taken as an independent prognostic marker for predicting the prognosis and metastatic potantial of colorectal cancer can be used t

6、o guide the clinical treatment of the disease.key erase chain reaction; oncogene amplification结直肠癌在北美、西欧、澳大利亚、新西兰等经济发达地区和国 家十分常见，一般为第24位常见癌症。随着我国经济快速 发 展，生活方式发生改变，结直肠癌的发病率和死亡率在我国经济发 展较快的城市和地区迅速上升。结直肠癌相关基因的深入研究和基 因检测技术的发展对于筛查结直肠癌高危人群，判断结直肠癌的生 物学行为、预后及指导治疗具有重要意义1。c-erbb-2癌基因的扩 增和过度表达见于人类多种肿瘤，与细胞恶变、肿瘤分

7、化、肿瘤转 移和生存期相关，具有预后价值2。因此，c-erbb-2作为判断预后 的分子标记及作为基因治疗的靶基因受到普遍关注。对于c-erbb-2 癌基因在结直肠癌中的扩增频率及其临床意义，国内外研究较少， 并存在争议3。本文采用快速、简便、无放射性污染的差别pcr(differential pcr,dpcr)技术检测52例结直肠癌中c-erbb-2癌基 因的扩增情况，探讨c-erbb-2基因扩增的临床意义。1材料与方法1.1材料52例结直肠癌新鲜组织标木，其中结肠癌19例，直肠癌 33例，取自在辽宁省肿瘤 医院 及包头市肿瘤医院住院手术的患 者，均经病理确诊为结直肠癌，其中男27例，女25例

8、，年龄28 78岁，平均年龄56.3岁。取其中20例自身正常肠粘膜(距肿瘤边缘大 于5cm处)作对照。标本立即剔除血块及脂肪组织，置于液氮保存备 用。1.2 dna提取 采用上海生工生物工程公司生产的sk341临床样品 基因组dna小量抽提试剂盒提取组织中dna,具体操作步骤如下：(1) 530mg组织样品用手术刀切成小块，在液氮中碾碎。(2) 将粉末收集到l5ml离心管中，用200 ul te悬浮。(3)在按样 品制备方法制备的200 u l样品中，加入400 u l digestion solution, 混匀;加入3 u l proteinase k,混匀，55°c保温3小时。

9、(4)加入 200 ul无水乙醇，混匀，然后用1 mltip头将样品全部转移到套放 于2ml收集管内的uniq.10柱。(5)用台式离心机，8 000转/ 分，室温离心1分钟。(6)取下uniqj0柱，弃去离心管中的废 液。将柱子放回收集管中，加入500 ul mgc12 3 hl , 2mm dntp 4ul, taq dna 聚合酶 2u, c-erbb-2 及3 -actin 上下游引物 终浓度各为033u m, dna样本0 .lug。双蒸水补足反应体积(采 用的sk491 dna多聚酶链式反应试剂盒由上海生工生物工程公司 生产)。其中以3 -actin作为内参对照，在同一反应体系进行

10、c- erbb-2和b-actin基因的扩增。反应条件为预变性：95°c, 2分钟； 变性：94°c, 1分钟；退火：55°c, 1分钟；延伸：72°c, 50秒， 共35个循环。末轮循环72°c延伸5分钟。取pcr反应产物15 ul 在含05ug/ml漠化乙锭的3%琼脂糖凝胶中电泳，电压为100v, 电势梯度8v/cm,约25分钟。紫外灯下观察，摄片。1.6统计分析 统计学处理采用卡方检验，应用spss 10.0统计软件 分析实验数据。2结果2.1 c-erbb-2癌基因在结直肠癌中的扩增 以20例结直肠癌患者自 身正常癌旁组织粘膜为对照，校

11、正后，c-erbb-2 / p -actin电泳带光密 度比值为1.01 ±0.20,单侧99%正常值范围上限为1.46,凡c-erbb-2 基因校正相对拷贝值>1.46即为扩增。见图1。c1c4为结直肠癌标本，n1n4为癌旁正常对照，m为dna标 志(marker)。其中c1和c3存在c-erbb-2基因扩增，c2和c4未 扩增。图1结直肠癌组织中c-erbb-2基因差别pcr检测结果分析2.2 c-erbb-2基因扩增与结直肠癌临床病理的关系52例结直肠癌 中，25例存在c-erbb-2癌基因的扩增，占48.1% (25/52)。c-erbb- 2癌基因扩增与duk

12、es分期、淋巴结转移、肿瘤组织学分化和组织 病理类型相关，并且常见于伴有腺瘤性息肉的结直肠癌，而与年 龄、性别、肿瘤占肠周比例、大体分型和浸润深度无关，见表1。3讨论c-erbb-2癌基因(又称neu/her-2基因)是shih等首次通过 nih/3t3细胞转染试验，在乙基亚硝腺诱导的大鼠神经胶质纤维瘤 中分离鉴定出了一种转化基因，称为neu基因。padhy等进一步证 实neu基因与编码表皮生长因子受体(egfr)基因一样与病毒癌基 因v-erbb具有同源序列，因此将egfr基因命名表1 c-erbb-2基因 扩增与结直肠癌临床病理的关系为c-erbb-1而将neu癌基因命名为 c-erbb-

13、2o c-erbb-2基因定位于第17号染色体的qll.2-12上，编码 185kd具有酪氨酸激酶活性的跨膜磷酸糖蛋白。其蛋白氨基酸结构 与egfr有惊人的相似性，似乎表明c-erbb-2受体的生物学行为类 似于egfr,在控制细胞分裂和分化中起重要作用。小鼠肿瘤形成 时，c-erbb-2基因主要通过其蛋白跨膜部分的点突变而被激活，而 在人类c-erbb-2原癌基因的活化主要表现为基因扩增或其扩增产物 的过度表达5。研究表明c-erbb-2基因及其编码的蛋白在许多肿瘤细胞中，如乳腺 癌、胃癌、肺癌、膀胱癌以及卵巢和宫颈癌均可岀现高度扩增和表 达6,并与肿瘤的复发、进展、转移及预后因素相关。c-

14、erbb-2基 因在结直肠癌中的扩增及其临床意义国内外研究的较少，并存在争 议，值得进一步研究。西班牙学者golijoan colonic adenocarcinomasj .acta gastroenterol latinoam,2001, 31(2):71-76. 骆成玉，李世拥，祝学光，等大肠癌中c-erbb-2基因扩增的研 % j 中国肛肠病杂志，2000, 20 (10) : 5-7.4苏丽娅，岳秀兰，曹虹然，等差别pcr技术检测乳腺癌c-erbb- 2癌基因扩增的研究j包头更学院学报，2006, 22 (2) : 119-121.5 lemoine nr,staddon s,dic

15、kson c,et al.absence of activating transmembrane mutations in the c-erbb-2 proto-oncoprotein in human breast cancer j .oncogene.2002, 5(2):237-239. 王建勋，岳秀兰，曹虹然，等应用差别pcr技术研究胃癌中c erbb-2原癌基因的扩增与胃癌的关系j实用肿瘤学杂志，2005j9(5) : 14-177 charpin c, garcia s, bourier c,et al.c-erbb2 oncoprotein detected by automated quantitativ