第二章 发酵产酶

1、第二章第二章 酶的生产酶的生产第一节 微生物酶的开发一、应用微生物开发酶的优点：一、应用微生物开发酶的优点： (1)微生物生长微生物生长快快、周期短。生产能力、周期短。生产能力 大，大，能满足市场需求。能满足市场需求。 (2)微生物种类微生物种类多多，不同的环境下的微生物，不同的环境下的微生物以特殊的代谢方式分解利用不同的底物。为以特殊的代谢方式分解利用不同的底物。为酶品种的多样性提供了物质基础。酶品种的多样性提供了物质基础。(3)通过基因工程使动植物细胞中的酶都能用通过基因工程使动植物细胞中的酶都能用微生物细胞获得。因此，有计划地筛选菌种，微生物细胞获得。因此，有计划地筛选菌种，可以生产几乎

2、任何一种酶。可以生产几乎任何一种酶。二、微生物酶开发的一般程序(一一) 样品的采集样品的采集 采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量。量。(二二) 菌种的分离菌种的分离 培养基的确定、培养条件的确定。培养基的确定、培养条件的确定。(三三) 菌种的初筛菌种的初筛 (1)用简单的定性反应进行初筛；用简单的定性反应进行初筛； (2) 最初分离阶段给予特殊的培养基或培养条最初分离阶段给予特殊的培养基或培养条 件，让目的菌株大量繁殖。件，让目的菌株大量繁殖。(四四) 菌种的复筛菌种的复筛 初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是筛初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的

3、是筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。 酶活的测定方法的建立对其很重要。酶活的测定方法的建立对其很重要。(五五) 对复筛获得菌株的要求对复筛获得菌株的要求 (1)不是致病菌；不是致病菌； (2)菌株不易变易和退化；菌株不易变易和退化； (3)不易感染噬菌体；不易感染噬菌体； (4)微生物产酶量高；微生物产酶量高； (5)酶的性质符合应用需要，最好是胞外酶；酶的性质符合应用需要，最好是胞外酶； (6) 便于分离和提取，得率高；便于分离和提取，得率高； (7)微生物培养营养要求低。微生物培养营养要求低。(六六) 最佳产酶条件的初步确定最佳产酶条件的初步确定

4、 (1)培养方式的确定；培养方式的确定； (2)最佳培养条件组合；最佳培养条件组合； (3) 产酶特性产酶特性(胞内酶、胞外酶胞内酶、胞外酶)； (4)微生物酶收集的时间顺序；微生物酶收集的时间顺序； (七七) 微生物产酶性能的进一步提高微生物产酶性能的进一步提高 (1)获得高产菌种的突变体；获得高产菌种的突变体； (2)利用代谢工程和代谢调节机理来提高酶产量；利用代谢工程和代谢调节机理来提高酶产量； (3)运用基因工程技术将原有菌株中目的基因转运用基因工程技术将原有菌株中目的基因转移到对生产环境更适应的菌株内，使其高效表移到对生产环境更适应的菌株内，使其高效表达；达； (八八) 微生物酶的提

5、取方法微生物酶的提取方法 (1)酶的粗提；酶的粗提； (2)酶的精制。酶的精制。 (九九) 微生物产酶菌种的保藏微生物产酶菌种的保藏 (1)斜面；斜面； (2)沙土管；沙土管； (3)冷冻。冷冻。 代谢流分析与控制 代谢工程是当今国际生化工程界的新兴交叉学科，它将计算机技术、自动控制、基因操作技术与发酵工程结合起来，研究生产过程中细胞代谢流的分布，利用代谢控制理论和网络刚性理论寻找限制代谢流率的代谢瓶颈和代谢网络中制约转化率提高的酶反应，为定向菌种选育和发酵控制提供思路。Glucose=G6PF6PGAPG3PPEPPyrAcCoADHAPRibu5PRib5PXyl5P1,6FDPSed7P

6、E4PaKGIsocitSucCoASucMalOaaGluGlnNADPHCO2CO2NH4+ATPCO2CO2GluGln=细胞膜CO2PEPPyr细胞膜ValLacAla谷氨酸与谷氨酰胺产生代谢网络图谷氨酸脱氢酶既可利用NADH作为其辅酶，也可利用NADPH作为其辅酶。形成谷氨酸形成谷氨酸谷氨酸谷氨酰-5-磷酸谷氨酰胺ATPADPNH4+Pi + H+E:谷氨酰胺合成酶形成谷氨酰胺形成谷氨酰胺谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸代代谢网络图谢网络图由由 -酮戌二酸合成脯氨酸酮戌二酸合成脯氨酸谷氨酸激酶谷氨酸脱氢酶谷氨酰-半醛自动环化自动环化二氢吡二氢吡咯咯-5-羧酸还原酶羧酸

7、还原酶由由 -酮戌二酸合成精氨酸酮戌二酸合成精氨酸瓜氨酸氨甲酰磷酸转乙酰基酶N-乙酰谷氨酸乙酰谷氨酸激酶N-乙酰-谷氨酰磷酸还原N-乙酰谷氨酸半醛转氨酶N-乙酰鸟氨酸转乙酰基酶鸟氨酸转氨基甲酰酶精氨酸琥珀酸裂解酶生物酶技术专题生物酶技术专题( 2014最新版最新版) 固体培养法 好氧培养 摇瓶培养 液体培养法获得单细胞 发酵罐（纯培养） 厌氧培养（厌氧罐技术、滚管 技术、厌氧手套箱技术）一、微生物的培养方法第二节 微生物的培养一个微生物细胞一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用如果同化作用的速度超过了异化作

8、用个体的生长个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体内各个个体的进一步生长群体的生长群体的生长个体生长个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。群体生长群体生长群体中个体数目的增加。可以用重量、群体中个体数目的增加。可以用重量

9、、体积、密度或浓度来衡量。体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况） 个体生长个体生长个体繁殖个体繁殖 群体生长群体生长 群体生长群体生长 = = 个体生长个体生长 + + 个体繁殖个体繁殖纯培养纯培养(pure culture)微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代养繁殖而得到的后代,称纯培养。称纯培养。二、微生物的同步生长及同步培养方法n同步培养法同步培养法：使培养基中所有微生物细胞：使培养基中所有微生物细胞处于相同的

10、生长阶段的培养方法。处于相同的生长阶段的培养方法。n同步生长同步生长：培养物中所有的微生物细胞都：培养物中所有的微生物细胞都处于同一生长阶段，并能同时分裂的生长处于同一生长阶段，并能同时分裂的生长方式。方式。化学诱导物理诱导诱导法诱导法过滤法区带密度梯度离心法膜洗脱法筛选法筛选法同步培养法同步培养法获得同步生长的方法：获得同步生长的方法主要有两类：获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：环境条件诱导法：抗生素、变换温度、光线、培养基等。造成抗生素、变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。与正常细胞周期不同的周期变化。机械筛选法：机械筛选法：选择性过滤、梯度离心或膜洗脱

11、法。选择性过滤、梯度离心或膜洗脱法。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。 硝酸纤维素膜 法原理：原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于具不同电荷的硝酸纤一些细菌细胞会紧紧粘附于具不同电荷的硝酸纤维微孔滤膜上。维微孔滤膜上。步骤：步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上； 反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞； 除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。胞，即为同步培养。 这种细胞在培养过程中，一般经这种细胞在培养过

12、程中，一般经2 3个分裂周期就会丧失其同步性。个分裂周期就会丧失其同步性。 三、微生物生长繁殖的测定方法（一）测生长量 测体积（离心） 1.直接法 离心法（单细胞微生物） 称干重 过滤法（丝状微生物） 比浊法（分光光度计）2.间接法 含氮量 生理指标法 含碳量 DNA含量测定（二）计繁殖数 血球计数法 直接计数法 涂片计数法 涂布平板法 间接计数法 倒平板法四、微生物的群体生长一）无分支单细胞微生物的群体生长一）无分支单细胞微生物的群体生长G = t/n 1.特征：指数生长。特征：指数生长。2.典型生长曲线 （Growth curve） 延延滞滞期期对对数数期期稳定期稳定期衰亡期衰亡期时期的划

13、分：按照生长速率常数时期的划分：按照生长速率常数R（growth race constant）的不同的不同又称：停滞期、调整期、适应期又称：停滞期、调整期、适应期1.现象：现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。活菌数没增加，曲线平行于横轴。2.特点：特点：生长速率常数生长速率常数R= 0细胞形态变大或增长细胞形态变大或增长细胞内细胞内RNA特别是特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强含量增高，原生质嗜碱性增强合成代谢活跃（核糖体、酶类、合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱合成加快），易产生诱导酶导酶对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化对外界不良条件敏感，（如氯

14、化钠浓度、温度、抗生素等化学药物）学药物）3.原因：原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物延滞期（lag phase）认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义：在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期，措施有：在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期，措施有：接种龄：采用对数生长期的接种龄：采用对数生长期的健壮菌种健壮菌种；增加接种量；一般来说，增加接种量；一般来说， 接种量增大可缩短甚至消接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的的接种量接种量）；）； 调整培养基的成分，应适当丰富，且调整培养基的

15、成分，应适当丰富，且发酵培养基成发酵培养基成分分尽量与种子培养基的成分接近。尽量与种子培养基的成分接近。 对数期（logarithmic phase，指数期） 在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数目以几在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数目以几 何级数增长的时期。何级数增长的时期。其对数与时间呈直线关系。其对数与时间呈直线关系。 指数期的特点：指数期的特点： 生长速率常数生长速率常数R最大，即最大，即代时最短代时最短; 细胞进行细胞进行平衡生长平衡生长，菌体大小、形态、生理特征菌体大小、形态、生理特征 等比较一致等比较一致; 酶系活跃，代谢最旺盛酶系活跃，代谢最旺盛; 细胞对理化因素较敏感

16、。细胞对理化因素较敏感。指数期中的的三个重要参数n繁殖代数繁殖代数（n） 指数生长方式：指数生长方式： 1、 2、4、8 2n 设接种时细胞数为设接种时细胞数为x1, 时间为时间为t1, 到时间到时间t2后，繁殖后，繁殖n代，细胞数为代，细胞数为x2，它们之间的相互关系为：它们之间的相互关系为： x2 = x12n以以对数表示：对数表示： x2 = x1 + n2 n = = 3.322( x2 - x1 ) x2 - x12x2x1t2t1培养时间培养时间Lg 细胞数细胞数/mlt2 - t13.322(lgx2-lgx1)生长速率常数生长速率常数R=t2 - t13.322(lgx2-lg

17、x1)代时代时G= 繁殖代数繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1)代时代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为时为13h，然而有些快速生长的微生物的代时还不到，然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天； 另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。时是恒定的，

18、因此它是微生物菌种的一个重要特征。影响指数期微生物代时长短的因素（1）菌种：不同菌种其代时差别极大。）菌种：不同菌种其代时差别极大。 （2）营养成分：同一种微生物，在营养丰富的培养基上）营养成分：同一种微生物，在营养丰富的培养基上 生长时，其代时较短，反之则长。生长时，其代时较短，反之则长。 （3）营养物浓度：既影响微生物的生长速率，又影响它）营养物浓度：既影响微生物的生长速率，又影响它 的生长总量。的生长总量。 （浓度（浓度0.12.0mg/mL影响生长速影响生长速 率，浓度率，浓度2.08.0mg/mL时影响最终产量）时影响最终产量） （4）培养温度：温度对微生物的生长速率明显的影响。）培

19、养温度：温度对微生物的生长速率明显的影响。 营养物浓度与对数期生长速率和产量：影响微影响微生物的生长速率和生物的生长速率和总生长量。总生长量。：凡是处于较低浓度凡是处于较低浓度范围内，可影响生范围内，可影响生长速率和菌体产量长速率和菌体产量的营养物就称生长的营养物就称生长限制因子。限制因子。8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收只最大收获量受影响获量受影响生长速度和最大生长速度和最大收获量受影响收获量受影响时间时间细胞数或菌体量细胞数或菌体量应用意义：应用意义：指数期的微生物具有整个群体的生理特性

20、一致、细指数期的微生物具有整个群体的生理特性一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点，是：胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点，是：（1 1）用作代谢、生理等研究的良好材料；）用作代谢、生理等研究的良好材料；（2 2）是增殖噬菌体的最适宿主；）是增殖噬菌体的最适宿主；（3 3）是发酵工业中用种子的最佳材料。）是发酵工业中用种子的最佳材料。（4 4）进行染色、形态观察等进行染色、形态观察等的良好材料的良好材料。稳定期（stationary phase，恒定期、最高生长期）特点：特点：（1）R=0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等

21、的动态平衡之中。相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。培养培养物中的细胞数目达到最高值。物中的细胞数目达到最高值。（2）菌体产量达到了最高点；）菌体产量达到了最高点；（3）菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系）菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关系（可用生长产量常数（可用生长产量常数Y生长得率来表示：表示微生物对生长得率来表示：表示微生物对基质利用效率的高低基质利用效率的高低 。Y=菌体干重菌体干重/ 消耗营养物质的浓度消耗营养物质的浓度 根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量意义：消耗每意义：消耗每g或或mol营养物质所

22、产生的菌体干重（营养物质所产生的菌体干重（g）。）。（4）细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；）细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；（5）芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢；）芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢；（6）通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各）通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢物（稳定期产物）。种次生代谢物（稳定期产物）。Y=x x0C0 C=x x0C0稳定期到来的原因（1）营养物尤其是生长是限制因子耗尽；）营养物尤其是生长是限制因子耗尽；（2）营养物的比例失调；）营养物的比例失调；（3）酸、醇、毒素或）酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢

23、产物的累积；等有害代谢产物的累积；（4）pH、氧化还原势等物理化学条件越来越不适宜；等、氧化还原势等物理化学条件越来越不适宜；等等等.生产实践的重要指导意义（1 1）对以生产菌体或菌体生长相平行的代谢产物的最佳）对以生产菌体或菌体生长相平行的代谢产物的最佳收获期；收获期；（2 2）是对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定的）是对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定的最佳测定时期；最佳测定时期；（3 3）通过对稳定期到来原因的研究，促进了连续培养原）通过对稳定期到来原因的研究，促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建。理的提出和工艺、技术的创建。衰亡期（decline phase）1、特点

24、：、特点：（1）细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现的活菌数目急剧下降，出现“负生长负生长” （ R0 ） ；（2）细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形；细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形；（3）因菌体本身产生的因菌体本身产生的水解水解酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。（4）有的微生物合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢）有的微生物合成或释放对人类有益

25、的抗生素等次生代谢（5）芽孢杆菌在此期释放芽孢；等等。）芽孢杆菌在此期释放芽孢；等等。 衰亡期比其他各时期时间衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。长，它的长短也与菌种和环境条件有关。2、产生原因：、产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡不立即繁殖不立即繁殖繁殖速度繁殖速度最快最快出生率等于死出生率等于死亡率亡率, ,活菌数活菌数最大最大, ,代谢产代谢产物大量积累物大量积累死亡超过死亡超过繁殖繁殖适应新环境适应新环境条件适宜条件适宜生存条生存条件件开

26、始恶开始恶化化生存条件生存条件极度恶化极度恶化代谢活跃代谢活跃, ,体体积增长较快积增长较快个体形态和个体形态和 生理特性稳定生理特性稳定有些种有些种类类出现芽出现芽孢孢出现畸变出现畸变与菌种和培与菌种和培养条件有关养条件有关生产用菌种生产用菌种科研材料科研材料改善和控改善和控制条件制条件, ,延延长稳定期长稳定期细胞裂解细胞裂解释放产物释放产物微生物群体生长的规律n生长曲线代表在新的适应环境中生长、分裂直至生长曲线代表在新的适应环境中生长、分裂直至衰老、死亡全过程的动态变化规律。分为迟缓期、衰老、死亡全过程的动态变化规律。分为迟缓期、对数期、稳定期和死亡期四个主要的时期。对数期、稳定期和死亡

27、期四个主要的时期。n生长曲线的不同时期反映的是群体而不是单个细生长曲线的不同时期反映的是群体而不是单个细胞的生长规律胞的生长规律。n认识和掌握微生物的生长曲线有重要的实践意义。认识和掌握微生物的生长曲线有重要的实践意义。如设法缩短迟缓期、延长对数期以及在稳定期收如设法缩短迟缓期、延长对数期以及在稳定期收集菌体。集菌体。二）丝状微生物的群体生长丝状微生物的纯培养采用孢丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中振子接种，在液体培养基中振荡培养或深层通气加搅拌培荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。形成产孢结构。以菌丝干重作为衡量生长的以菌丝干重作

28、为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。生长曲线。培养时间与菌丝体干重的立培养时间与菌丝体干重的立方根成直线关系。方根成直线关系。可分为三个阶段：可分为三个阶段：1、停滞期（生长延滞期）、停滞期（生长延滞期）2、迅速生长期（快速生长期）、迅速生长期（快速生长期）3、衰亡期（生长衰退期）、衰亡期（生长衰退期）1、生长停滞期、生长停滞期: 造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。2、迅速生长期、

29、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生线关系，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。3、衰退期、衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些菌

30、丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。丝状微生物的群体生长五、微生物的连续培养（continuous culture）分批培养分批培养（batch culture） ：将微生物置于一定容积的定量：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。后一次性收获。连续培养连续培养（continuous culture） ：在微生物培养的过程中，：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的不断地供给新鲜的营养物质，

31、同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养连续培养理论基础理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。连续培养技术。当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以

32、溢流方式面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。单批培养单批培养 恒浊法恒浊法恒化法恒化法 单批培养单批培养连续培养连续培养时间时间连续流入连续流入新鲜培养液新鲜培养液lg细胞数（个细胞数（个/ml）连续培养连续培养 （一）连续培养原理连续连续培养培养器器按控制方式分按控制方式分按培养器的级数分按培养器的级数分按细胞状态分按细胞状态分按用途分按用途分内控制（控制菌体密度）：恒浊器内控制（控制

33、菌体密度）：恒浊器外控制（控制培养液流速、以控制外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器生长速率）：恒化器单级连续培养器单级连续培养器多级连续培养器多级连续培养器一般连续培养器一般连续培养器固定化细胞连续培养器固定化细胞连续培养器实验室科研用：连续培养器实验室科研用：连续培养器发酵生产用：连续发酵罐发酵生产用：连续发酵罐（二）连续培养器（三）连续培养技术1、恒化连续培养恒化连续培养概念概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持微生物：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持微生物始终在低于其最高生长速率的条件下达到连续培养。始终在低于其最高生长速率的条件下达到连续培养。原理：原理：通过控制某一

34、种营养物浓度通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生（如碳、氮源、生长因子等）长因子等） ，使其始终成为生长限制因子，而达到控，使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。高生长速率条件下进行生长繁殖。特点：特点：维持营养成分的维持营养成分的亚适量亚适量，控制微生物生长速率。，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。最高菌体产量。应用范围：应用范围：实验室科学研究实验室科学研究恒化器（Chemost

35、at 或bactogen）概念：概念：根据培养器内微生物的根据培养器内微生物的生长密度，借光电控制系统来生长密度，借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体控制培养液流速，以取得菌体高密度、生长速度恒定的微生高密度、生长速度恒定的微生物细胞。物细胞。原理原理：通过调节新鲜培养基流：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度入的速度和培养物流出的速度来来维持菌液浓度不变维持菌液浓度不变,即浊度不即浊度不变变。当浊度高时，使新鲜培养。当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。减慢培养基的流速。特点：特点：基质过量，微生物始终基质过量，微生物始终

36、以最高速率进行生长，以最高速率进行生长，并可在并可在允许范围内控制不同的菌体密允许范围内控制不同的菌体密度度；但工艺复杂，烦琐。；但工艺复杂，烦琐。2、恒浊培养使用范围：使用范围：用于生产大量菌用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。乙醇等。装置装置控制对象控制对象培养基培养基培养基流培养基流速速生长速生长速率率产物产物应用范应用范围围恒浊器恒浊器菌体密度菌体密度（内控制）（内控制）无限制生无限制生长因子长因子不恒定不恒定最高最高大量菌体或大量菌体或与菌体形成与菌体形成相平行的产相平行的产物物生产为生产为主主恒化器恒

37、化器培养基流速培养基流速（外控制）（外控制）有限制生有限制生长因子长因子恒定恒定低于最低于最高高不同生长速不同生长速率的菌体率的菌体实验室实验室为主为主恒浊器与恒化器的比较（四）连续发酵（continuous fermentation）将连续培养用于发酵，即为连续发酵。相对于单批发酵而言。将连续培养用于发酵，即为连续发酵。相对于单批发酵而言。SCPSCP的生产、乙醇、乳酸、丙酮和丁醇的发酵、石油脱蜡、污水处理等的生产、乙醇、乳酸、丙酮和丁醇的发酵、石油脱蜡、污水处理等应用。应用。优点：优点： 高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作；高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等

38、单元操作； 自控：便于利用各种仪表进行自动控制；自控：便于利用各种仪表进行自动控制； 产品质量稳定；产品质量稳定； 节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。衡合理。缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。培养。连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月 1 1年年。第三节 酶发酵动力学发酵动力学：研究微生物生长、产物合成、底物消耗发酵动力学：研究微生物生长、产物合成、底物消耗之间之间动

39、态定量关系，定量描述动态定量关系，定量描述微生物微生物生长和产物生长和产物形成形成过程。过程。主要研究：主要研究：1 1、发酵动力学参数特征、发酵动力学参数特征：微生物生长速率、发酵产：微生物生长速率、发酵产物合成速率、底物消耗速率及转换率、效率等；物合成速率、底物消耗速率及转换率、效率等；2 2、影响发酵动力学参数的各种理化因子、影响发酵动力学参数的各种理化因子；3 3、发酵动力学的数学模型、发酵动力学的数学模型 研究发酵过程中细胞生长速度研究发酵过程中细胞生长速度, ,产物生成速度及产物生成速度及环境因素对这些速度的影响环境因素对这些速度的影响. .酶发酵动力学研究意义酶发酵动力学研究意义

40、: :了解酶生物合成模式、规律了解酶生物合成模式、规律发酵工艺条件优化控制，确定发酵工艺条件优化控制，确定最优发酵参数最优发酵参数，如：基质浓度、温度、如：基质浓度、温度、PHPH、溶氧等、溶氧等提高酶产量，效率和转化率提高酶产量，效率和转化率. .一、酶生物合成的模式细胞生长一般经细胞生长一般经4 4个阶段个阶段, ,如图如图: :细胞生长曲线细胞生长曲线根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分酶的生物合成分3种模式种模式n生长偶联型： 同步合成型 中期合成型n部分生长偶联型：延期合成型n非生长偶联型：滞后合成型酶生物合成的四种类型酶生物合成

41、的四种类型比较酶产生与细胞比较酶产生与细胞生长的关系生长的关系, ,可把可把酶生物合成模式分酶生物合成模式分成成4 4种类型种类型: :酶生物合成的四种类型（1 1）同步合成型：）同步合成型： 酶的合成与细胞的生长同步进行酶的合成与细胞的生长同步进行（2 2）延续合成型：）延续合成型： 酶的合成伴随着细胞的生长而开始，生长进入平衡期酶的合成伴随着细胞的生长而开始，生长进入平衡期后，酶又延续合成一段时间后，酶又延续合成一段时间（3 3）中期合成型）中期合成型 酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，进入平衡期酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，进入平衡期后，酶的合成随之停止。后，酶的合成随之停止。

42、(4) (4) 滞后合成型滞后合成型 当细胞进入平衡期后，才开始并大量积累酶当细胞进入平衡期后，才开始并大量积累酶（1 1）酶的生物合成）酶的生物合成可以诱可以诱 导，不受分解代谢物导，不受分解代谢物 阻遏和反应产物阻遏阻遏和反应产物阻遏；（2 2）当除去诱导物或细胞）当除去诱导物或细胞进入平衡期后，酶的合成立进入平衡期后，酶的合成立即停止；即停止；（3 3）酶所对应的）酶所对应的mRNAmRNA很不很不稳定。稳定。同步合成型的特点同步合成型的特点在单宁（Tannins ）或没食子酸的诱导（1 1）酶的合成可以诱导，不受分解代谢物或产物的阻遏；）酶的合成可以诱导，不受分解代谢物或产物的阻遏；（

43、2 2）酶所对应的）酶所对应的mRNAmRNA相当稳定，在生长平衡期后仍可继续较长相当稳定，在生长平衡期后仍可继续较长时间用于酶的合成。时间用于酶的合成。延续合成型的特点延续合成型的特点中期合成的特点中期合成的特点（1 1）酶的合成受）酶的合成受到反馈阻遏或分解到反馈阻遏或分解代谢物代谢物阻遏阻遏；（2 2）所对应的）所对应的mRNAmRNA不稳定。不稳定。（1 1）在对数生长期不）在对数生长期不合成酶（可能是受到合成酶（可能是受到分解代谢物阻遏的影分解代谢物阻遏的影响）；响）；（2 2）所对应的）所对应的mRNAmRNA稳稳定性高。定性高。滞后期合成型的特点滞后期合成型的特点（1 1）mRN

44、AmRNA的稳定性；的稳定性；（2 2）培养基中阻遏物存在与否。）培养基中阻遏物存在与否。总结：影响酶生物合成的模式的主要因素是：总结：影响酶生物合成的模式的主要因素是：（1 1）mRNAmRNA稳定性高，细胞停止生长后继续合成其所对应的酶；稳定性高，细胞停止生长后继续合成其所对应的酶；（2 2）mRNAmRNA稳定性差，酶的合成随着细胞停止生长而终止；稳定性差，酶的合成随着细胞停止生长而终止；（3 3）受某些物质阻遏，细胞生长一段时间或在平衡期后（解）受某些物质阻遏，细胞生长一段时间或在平衡期后（解除阻遏），开始合成酶。除阻遏），开始合成酶。（4 4）不受某些物质阻遏，酶的合成随着细胞生长而

45、同步增长。）不受某些物质阻遏，酶的合成随着细胞生长而同步增长。规规 律：律：（1 1）选择最理想的酶合成模式）选择最理想的酶合成模式延续合成型；延续合成型；（2 2）改造非理想模式）改造非理想模式 A A、同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提同步合成型：适当降低发酵温度，尽量提 高相应的高相应的mRNAmRNA的稳定性；的稳定性； B B、滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢 物阻遏，使酶合成提早开始；物阻遏，使酶合成提早开始； C C、中期合成型：努力提高中期合成型：努力提高mRNAmRNA稳定性，解稳定性，解 除代谢物阻遏物。除代谢物阻遏物。选择与改造选

46、择与改造二、细胞生长动力学主要研究细胞生长速度及其受外界环境影响的规律。主要研究细胞生长速度及其受外界环境影响的规律。19501950年年, ,法国的法国的MonodMonod首先提出表述微生物生长的动力首先提出表述微生物生长的动力学方程学方程, ,细胞生长速率与细胞浓度成正比细胞生长速率与细胞浓度成正比. .Rx =dX/dt= X: 比生长速率比生长速率只存在一种限制性基质时只存在一种限制性基质时: :MonodMonod方程是基本的细胞生长动力学方程方程是基本的细胞生长动力学方程; ;从不同情况出发对其进行修饰从不同情况出发对其进行修饰. .nm为最大比生长速率, 即不因基质浓度变化而改

47、变的最大值;nKs为饱和常数，即在数量上相当于=0.5m时的S值。nKs值愈小，说明在低基质浓度范围中，S对愈为敏感,而保持m的临界S值愈低 dx/dt=(-D)X D：稀释率稀释率连续全混流反应器发酵过程中连续全混流反应器发酵过程中, ,稳态时游离细胞连稳态时游离细胞连续发酵的生长动力学方程续发酵的生长动力学方程: :D=0,分批发酵分批发酵;D细胞浓度下降细胞浓度下降,S升高升高, 回升回升; Dm X趋于零趋于零;MonodMonod方程与米氏方程相似方程与米氏方程相似, ,参数参数u um m与与KsKs也也可由双倒数作图法求出可由双倒数作图法求出. .双倒数作图法双倒数作图法三、产酶

48、动力学宏观产酶动力学宏观产酶动力学（非结构动力学）（非结构动力学）: :从整个发酵系统着眼从整个发酵系统着眼, ,研究群体细胞的产酶速率及其影响因素研究群体细胞的产酶速率及其影响因素 ；微观产酶动力学微观产酶动力学（结构动力学）（结构动力学）: :从细胞内部着眼从细胞内部着眼, ,研究细胞中酶合成速率其影响因素研究细胞中酶合成速率其影响因素 ；1、分类、分类研究细胞产酶速率及各因素对其的影响研究细胞产酶速率及各因素对其的影响. .X细胞浓度；细胞浓度；u细胞比生长速率；细胞比生长速率； 生长偶联的比产酶系数；生长偶联的比产酶系数； 非生长偶联的比产酶速率。非生长偶联的比产酶速率。2、宏观产酶动

49、力学方程通式、宏观产酶动力学方程通式dE/dt=(+)x（1 1）同步合成型：生长偶联型）同步合成型：生长偶联型 =0=0，dE/dtdE/dt= =X X（2 2）中期合成型：）中期合成型： 特殊生长偶联型特殊生长偶联型 =0=0，dE/dtdE/dt= = X X 有阻遏存在时，有阻遏存在时， =0 =0，无酶产生，无酶产生 dE/dtdE/dt= = 0 0 阻遏解除后才开始合成酶阻遏解除后才开始合成酶. .细胞产酶模式不同，产酶速率与细胞生长动力学关系也不同。细胞产酶模式不同，产酶速率与细胞生长动力学关系也不同。讨论讨论: :（3 3）滞后合成型：非生长偶联型，）滞后合成型：非生长偶联

50、型， =0 , =0 , dE/dtdE/dt= =XX（4 4）延续合成型：部分生长偶联型，）延续合成型：部分生长偶联型， 00， 00 dE/dtdE/dt= = X+XX+X有关模型参数一般通过线性化处理及尝试有关模型参数一般通过线性化处理及尝试误差法求出误差法求出. .dE/dt=(+)xRA、Ri：有、无活性的阻遏蛋白；有、无活性的阻遏蛋白；Si、Sr：诱导物和阻遏物；诱导物和阻遏物；cc：环腺苷酸接受蛋白环腺苷酸接受蛋白CRP与环腺苷酸与环腺苷酸CAMP的复合物；的复合物；RSi：RA与与Si的结合物，不与操纵基因结合；的结合物，不与操纵基因结合；RSr：Ri与与Sr的结合物，可与

51、操纵基因结合，而使的结合物，可与操纵基因结合，而使 mRNA无法合成无法合成 。N：RNA的分解产物。的分解产物。附附:3、微观产酶动力学、微观产酶动力学（1）细胞内酶生物合成的一般模型）细胞内酶生物合成的一般模型（cf.P54)M：细胞中细胞中mRNA浓度（浓度（mol/L）E：细胞中酶浓度（细胞中酶浓度（U/L） ：细胞比生长速率（细胞比生长速率（h-1） 对非生长偶联型对非生长偶联型,u=0 （2）酶的生物合成速率）酶的生物合成速率dE/dt=K10M E假设细胞中假设细胞中K1和和DNA浓度为常数浓度为常数.mRNA浓度浓度: dM/dt=k7CC-k11N- Mcc浓度浓度: dCC

52、/dt=k4CRPcAMP-k-4CC- CCCRP浓度浓度: dCRP/dt=k1DNA-k4CRPcAMP+k-4CC- CRPn(注：注：M、CC、CRP与细胞生长有关）与细胞生长有关）（3）受分解代谢物阻遏的酶生物合成模型）受分解代谢物阻遏的酶生物合成模型假设假设K2和和DNA浓度为常数浓度为常数,ndM/dt=k8RSi-k11M- MndRSi/dt=k5RASi-k-5RSi- RSindRA/dt=k2DNA-k5RASi+k-5RSi- RA（4）诱导系酶合成模型）诱导系酶合成模型（CRP与与CAMP复合物的浓度足量或过量）复合物的浓度足量或过量）K3和和DNA浓度设定为常数

53、：浓度设定为常数：ndM/dt=k9Ri-k11M- MndRi/dt=k3DNA-k6RiSr+k-6RSr- RindRSr/dt=k6RiSr-k-6RSr- RSr（5）阻遏系酶合成模型）阻遏系酶合成模型动力学模型参数的估算是一项重要动力学模型参数的估算是一项重要又复杂的问题又复杂的问题;参数值是通过大量实验数据分析估参数值是通过大量实验数据分析估算出来的算出来的;数据呈随机性数据呈随机性,有时借助数学方法和有时借助数学方法和计算机计算机.实际发酵过程非常复杂实际发酵过程非常复杂,以上模型进行以上模型进行修正和发展才可修正和发展才可;第四节 固定化细胞发酵产酶又称固定化活细胞、固定化增

54、殖细胞又称固定化活细胞、固定化增殖细胞, ,用各种方法固用各种方法固定在载体上又能进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。定在载体上又能进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。是是7070年代后期年代后期(1978)(1978)发展起来的技术发展起来的技术; ;在发酵生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等胞外酶方面在发酵生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等胞外酶方面取得了成功。取得了成功。 固定化细胞：固定化细胞：一、固定化细胞发酵产酶的特点；一、固定化细胞发酵产酶的特点；二、固定化细胞生长和产酶动力学；二、固定化细胞生长和产酶动力学；三、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制。三、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制。本节主要内容

55、：本节主要内容：一、固定化细胞发酵产酶的特点1 1、提高产酶率：、提高产酶率：细胞密度增大细胞密度增大 生化反应加速生化反应加速 产酶率产酶率提高提高固定化细胞发酵产酶的特点2 2、可在高稀释度下连续发酵：不影响固定化细胞、可在高稀释度下连续发酵：不影响固定化细胞; ;3 3、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失；、基因工程菌的质粒稳定，不易丢失；4 4、发酵稳定性好：细胞受载体保护，、发酵稳定性好：细胞受载体保护，pHpH和和T T适应性宽；适应性宽；5 5、缩短发酵周期，提高设备利用率；、缩短发酵周期，提高设备利用率；6 6、产品容易分离纯化；、产品容易分离纯化；7 7、适于胞外酶等胞外产物的生

56、产。、适于胞外酶等胞外产物的生产。二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制与游离细胞发酵大同小异，需特别注意的几个问题：与游离细胞发酵大同小异，需特别注意的几个问题：1 1、固定化细胞的预培养、固定化细胞的预培养 先预培养，使固定在载体上的细胞生长繁殖，长好后，再用于发酵先预培养，使固定在载体上的细胞生长繁殖，长好后，再用于发酵产酶，其培养基和工艺条件可以相同或不同。产酶，其培养基和工艺条件可以相同或不同。2 2、溶解氧的供给、溶解氧的供给 由于受到载体的影响，使氧的供给成为主要的限制性因素。由于受到载体的影响，使氧的供给成为主要的限制性因素。解决办法：解决办法：（1 1）加大通气量（强烈搅拌会破坏固定化细胞）；）加大通气量（强烈搅拌会破坏固定化细胞）；（2 2）改变固定化载体，如少用琼脂等对氧扩散不利的载体；）改变固定化载体，如少用琼脂等对氧扩散不利的载体；（3 3）过氧化氢酶与细胞共固定化，培养基加入适量的）过氧化氢酶与细胞共固定化，培养基加入适量的H H2 2O O2 2；（4 4）降低培养基的浓度，以降低培养基