单克隆抗体的制备.ppt

1、 丁乔棋 2015年8月9号 单克隆抗体的制备 Monocolonal antibody 什么是单克隆抗体？n 1、单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）： 由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单克隆抗体。 n 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单克隆抗体制备原理 -单克隆抗体杂交瘤技术基本流程 单克隆抗体的制备步骤 一：免疫原的制备 ：n 1：完全抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等分子量大于5000Da生物物质n 2：半抗原：多糖、药物、激素、肽类等

2、分子量小于5000 Da 物质n 3：半抗原需与BSA、OVA等载体交联后成完全抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体 单克隆抗体的制备步骤 n 免疫动物的选取：6-8周龄的雌性，纯系的Bal B/C。n 免疫原：细胞性抗原：（12）107/只，不加佐剂，23周重复一次 可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，36周 100200微克抗原，融合前3天，加强免疫。n 免疫程序： 免疫剂量、免疫途径、免疫次数、 间隔时间、佐剂的选择。二.动物免疫单克隆抗体的制备步骤 抗原接种 单克隆抗体的制备步骤 三：细胞融合细胞融合的基本原理是免疫原刺激小鼠产生特异性的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,在PEG

3、融合剂或是电刺激或是激光刺激来促使细胞融合形成杂交瘤细胞。蹄选得到的杂交瘤细胞继承了 B淋巴细胞产生特异性抗体以及骨髓瘤细胞无限传代的特性,并以此进行大规模的细胞培养,生产出大量的特异性良好的单克隆抗体,为快速诊断试剂的研制奠定了坚实的基础。 所需试剂：培养液：RPM1640培养液，DMEM培养液，HAT培养液，HT培养液n 细胞融合剂：PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而 有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度 与毒性有所不同 单克隆抗体的制备步骤 三.细胞融合 步骤 1：选择对数

4、生长期的细胞进行传代培养。 2：胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 3：避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞培养骨髓瘤细胞 2：固定小鼠，切开皮肤，夹起腹膜。 3：往小鼠腹腔注射适量不完全培养液:，吹打几次。 4：抽出腹腔培养液，加入一定量的不完全培养液，加入血清，使血清浓度为20%。 5：分装至96孔板，co2培养箱培养。饲养细胞的制备 1：取已免疫小鼠，眼球采血，分离血清作对照血清。 2：拉颈处死，泡于75%酒精中。 3：开腹取脾 4：在不完全DM液中碾磨脾脏至粘稠 5：收集脾细胞，离心。脾细胞的制备 1：饲养细胞为小鼠的腹腔巨噬细胞。 单克隆抗体的制备步骤 n 1： 将脾细胞和骨髓瘤细胞

5、5:1混合，加DM液，混匀n 2： 离心，弃上清，磨成糊状n 3：将离心管置于37温水，摇动；边滴加PEG1450n 4：加入DM液n 5：离心，弃上清n 6：HAT 重悬后加入96孔板，放入CO2培养箱n 7：五天后，15%血清的HAT补液n 8：八天后，彻底换15%血清DM液三.细胞融合n ELISA方法筛选阳性孔单克隆抗体的制备步骤四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选阳性孔阳性孔 四.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选间接ELISA方法筛选阳性孔n 单克隆抗体的制备步骤n 六：亚克隆n 是为了获得稳定的阳性菌株n 对检测有阳性且敏感性好的细胞要尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,

6、因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的会使产单抗的细胞丢失单克隆抗体的制备步骤n 筛选阳性细胞孔n HAT重悬阳性孔内的细胞n 取10ul做倍比稀释n 目标孔：80-100个细胞n 将目标孔细胞全部移至适量的HAT溶液中，铺板n 每次亚克隆十天后，用ELISA法做抗体检测，确定阳性孔n 按上述方法进行第二，第三次亚克隆n 第三次亚克隆结束后，将确定为阳性孔的细胞进行扩大培养六：亚克隆单克隆抗体的制备步骤n 1：在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细 胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能

7、发生的意外事故。n 2:配制方案：DMEM:血清：DMSO=7：2：1 “慢冻”：分步冷冻，30-70液氮 保存数年至数十年. “快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、复 苏.七：杂交瘤细胞的冻存与复苏细胞冷冻的意义防止污染 、 避免染色体丢失、防止非分泌细胞的过度生长、防止细胞密度过高而死亡单克隆抗体的制备步骤八：动物体内诱生法：使用的动物当然首选BALB/c小鼠 ,将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。体外培养法： a、悬浮培养法b、微载体培养法Microcarrier c、中空纤维细胞培养系统 d、微囊化细胞

8、培养系统 收集细胞培养瓶中的杂交瘤细胞以备注入小鼠腹腔诱生腹水时,一定要用无血清培养液多离心几次,将细胞培养液含有的牛血清洗净,防止牛血清进入了小鼠腹腔使小鼠死亡。小鼠的选择上一定要选择活力好、腹腔大的小鼠。当小鼠腹腔开始发胀后,每天密切关注小鼠状态,取出腹水,立即离心,去除上层的腹腔脂肪,下层有时会出现细胞,除去。离心后马上进行纯化。单克隆抗体的制备步骤n 饱和硫酸铵一DEAE离子交换柱法n 离子交换是指液相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换反应。利用这个反应先将要分离的混合物在一定pH的溶液中解离,而后流经固定相,使之与固定相上的可解离基团进行离子交换,吸附于固定相上,凡不能进行交换吸

9、附的成分,则流出层析柱外。当pH一7.4时,IgG所带电荷为零,最先流出柱子。过柱前先用饱和硫酸铵法初步提纯。蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同,血清丫球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀,而白蛋白则不易沉淀,据此可将二者分离n 辛酸一饱和硫酸铵法n _在酸性条件不(pH4.5),非lgG的蛋白成份(包括白蛋白,部分免疫球蛋白),能被辛酸等短链脂肪酸沉淀,上清中剩余的蛋白主要为IgG,再用硫酸钱沉淀上清,即可获得纯度较高的IgG。九：单克隆抗体的纯化单克隆抗体的鉴定n单克隆抗体纯度的鉴定:用SDS一PAGE电泳鉴定纯度n单克隆抗体敏感性(IC50)值的测定:间接竞争ELISA实验中,一般是通

10、过IC50值来判断抗体对CAP的敏感性,故用7个不同偶联比的HAP一OVA进行ELISA实验,测定不同偶联比的包被抗原对应的IC50值。n单克隆抗体特异性的测定(交叉反应)n做间接竞争ELIsA,计算各自的ICS。值,计算交叉反应率。如果含有与待测物相似结构或部分相同结构的物质存在交叉反应,将测定结果升高,导致假阳性,一般以交叉反应率表示,交叉反应率越小,说明抗体特异性越好。7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定 n 将单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C 小鼠IgA, IgG1,IgG2a, IgG2b、IgG3,IgM抗体，作双向琼脂扩散试验。n ELISA方法n 用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，腹水效价在105107之间的可用于实际应用。 文献学习n氯霉素单克隆抗体的制备以及胶体金快速诊断方法的初步建立n n 胶体金免疫检测的基本原理n 胶体金(colloidal gold)是在还原剂如氯金酸、梓檬酸三钠、白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞋酸等作用下29,首先聚合成为具有一定大小的金核颗粒,在颗粒外侧形成内正外负的两层带负电荷的疏水胶体溶液,再借助静电作用和蛋白结构中的正电荷结合形成一种