垂盆草醇提物对人肝癌细胞HepG2的抑制作用及其机制初探

1、垂盆草醇提物对人肝癌细胞hepg2的抑制作用及其机制初探【关键词】 垂盆草；肝癌；抗增殖；细胞周期；抗血管生成 垂盆草（sedum sarmentosum bunge）又称卧茎景天，系景天科多年生 草本植物，分布于全国大部分地区。垂盆草主要含有垂盆草昔类、 黄酮类、三话类、當醇、生物碱及糖类。此药性凉，味甘、淡，新 鲜或干燥全草入药，主要用于 治疗 湿热黄疽、小便不利、痈肿疮 疡，并且具有抑制炎性渗出，减少肝细胞损伤，降低血清丙基酸氨 基转移酶水平，治疗急、慢性肝炎等功效1。近年来，国内外大量 研究表明，慢性病毒性肝炎与肝癌（hepatocellular carcinoma）发生 有着密切的联

2、系23, 一些传统中草药中的黄酮、生物碱及多糖等成分在抗肿瘤、延长患者生命等方面有着独特的生物活性，不仅 能够抑制肿瘤细胞增殖，还能有效抑制血管内皮生长因了（vascular endothelial groa 公司），rpmi 1640 培养基（invitrogen 公司）,小牛血 清（杭州四季青生物工程材料有限公司），biozol rna提取剂（bioflux 公司），m mlv 酶、taq dna 聚合酶（promega 公司），vegf、cmyc 和 b actin 引物由 invitrogen biotechnology co., ltd（上海） 合成，兔抗人vegf、c myc抗体、

3、生物素化羊抗兔igg、sabc 试剂盒、dab检验试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），其余试 剂均为国产分析纯。co2培养箱mco 15ac（sanyo公司），真空 冷冻干燥机（matin christ公司），酶标仪（biotek公司），ptc200 pcr 仪（biorad 公司），gel doc eq 图像分析仪（biorad公司），facs calibur 流式细胞仪（becton dickson 公司）。1.2方法1.2.1垂盆草醇提物的制备 垂盆草干草500 g,于95%的乙醇5 000 ml中浸泡5 d,纱布过滤，收集药液。重复2次，合并药液，离 心取上清，所得上清液经减压蒸发挥

4、去溶剂，再用石油醍经索氏提 取法去除脂类，挥去石油醸，再用甲醇溶解，减压蒸干得醇提物。1.2.2细胞培养人肝癌细胞hepg2于含10%小牛血清、青霉 素 100 u ml-k 链霉素 150 ug ml-1 的 rpmi 1640 培养液，在 37 °c、5%co2培养箱中培养。1.2.3细胞增殖能力的检测 将肿瘤细胞培养至对数生长期，计 数，调整细胞浓度lx105ml-l,接种于96孔板，80 孔1, 3 h贴壁后加入终质量浓度分别为25、50、100、200 ug ml-1的 ccso对照组，每组设6个平行孔，将培养板置5%co2、37 °c培 养箱中培养24、48、7

5、2h后mtt法检测。1.2.4流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期细胞调成浓度为 2x105 ml-1, 300卩1 孔1接种于24孔培养板中，细胞贴壁后加 入质量浓度分别为50、100、200 ug ml-1的ccso的同体积培养 液，设4个复孔。分别收集对照组和醇提物各剂量作用48 h后的 hepg2细胞1 x106个，70 %乙醇4 °c固定过夜，pbs清洗，加入 含 2 %triton x100、50 p g ml-1 rnase a 的 pi 溶液，4 °c 避光 染色30 min,上机检测2x104个细胞，用di分析软件分析结果。1.2.5 rt pcr检测肝癌

6、细胞的vegf和c myc的mrna 水平用biozol试剂分别提取各组hepg2细胞的总rna,得到白 色沉淀，加入1%°depc水30卩1至rna完全溶解并测定rna的浓 度和纯度。取各组总rna各2 ug分别进行逆转录合成cdna。 pcr反应体系总体积为25 u1,其中含cdna 1 ul, 10xbuffer 2.5 ul> mgc12(25 mmol l-1 )2 uk dntp(10 mmol l-1)0.4 uk 引 物 0.8 卩1、taq dna 聚合酶(1 u - l-l)l ul vegf、c myc 和 内参b actin基因引物序列分别参照有关文献1

7、012。94 °c预变性 5 min;然后 94 °c 30 s 变性、58 °c 40 s 退火、72 °c 30 s 延伸，共30个循环;最后72 °c延伸7 mino 1.5 %琼脂糖凝胶电泳， 凝胶成像分析仪分析结果。1.2.6免疫细胞化学法检测vegf、c myc蛋白表达将 hepg2细胞贴壁于预先置于6孔板的盖玻片上，加入不同质量浓度 (25、50、100、200 pg - ml-l)ccso 的培养液作为对照，37 °c、 5%co2培养48 h后取出玻片，pbs清洗标本2次，80%丙酮醇 4 °c固定15 m

8、in,染色步骤按sabc试剂盒说明书操作，pbs代替 一抗作阴性对照。染色结果以细胞浆或核出现棕黄色高岀背景的细 胞为阳性细胞，每组随机选取10个高倍视野，计算 每组的阳性细 胞率(阳性细胞数占视野内总细胞数的百分比)。1.3统计学处理采用spss 10.0软件进行统计学分析，实验数据以x-±s表示，f 检验方差齐性后t检验进行组间比较,p<005为差异具有统计学意 义。2结果2.1 cc 期细胞的数量分别为(1546±2.7)%、(14.20土 1.41)%, 与对照组g0/g1 期为(60.37 ± 2.7)% > g2/m 期(20.45

9、 ± 2.32)%相 比，差异具有统计学意义(100 ng - ml-1, p<0.05;200 u g ml- 1, p<0.01 o n= 4)o2.3 ccyc mrna表达的影响采用rt pcr法检测vegf、c myc的mrna表达，经扩 增的产物vegf、c myc和b actin的相对分子质量分别为 212、200和389 bp(图2a),与内参b actin相比,各组相对光密 度比值见图2b, 100、200 ug ml-iccyc mrna表达较对照组明 显降低，均具有统计学意义(100 u g ml-1 , p<0.05;

10、200 » g ml-l p<0.001)o2.4 ccyc蛋白表达的影响细胞浆或核有棕黄色或棕褐色颗粒着色为阳性特征。未加药对 照组细胞中表达较强，vegf和c myc阳性细胞率分别为(35.78 ±3.90)%和(43.21 ±8.37)%。在质量浓度 100、200 u g ml-1 的 ccyc阳性细胞率分别为(28.67±5.65)%和(2799±334)%,与对照组 相比，均具有统计学意义(p<0.001)o见图3o a.对照组;b.50 u g mll 组;c.100 ug - ml-1 组;d.200

11、 mg - ml-13讨论近年来，从祖国传统医药宝库中发掘新的抗癌药物已经成为肿 瘤治疗的研究热点之一，并且这些新的抗癌药物在临床中的应用也 取得了可喜的进展。垂盆草作为一种重要的药用植物资源，在民间 被用于治疗咽喉肿痛、水火烫伤、蛇虫咬伤等已有多年的历史， 此外，据文献报道垂盆草还具有免疫抑制作用13、雌激素样作用 14、血管紧张素转化酶抑制作用15等，然而，它最重要的一个功 效就是能够降低血清丙氨酸氨基转移酶水平，抑制炎性渗出，减少 肝细胞的损伤，所以在临床上被广泛用于治疗各型慢性病毒性肝炎 16o众所周知，慢性病毒性肝炎是肝癌发生的重要危险因素17, 鉴于慢性病毒性肝炎与肝癌的密切关系以

12、及垂盆草在治疗慢性病毒 性肝炎中的疗效，本实验采用垂盆草醇提物对肝癌细胞hepg2进行 干预，结果显示cc期，使其停留在静止期，抑制hepg2的生长。 ae.ccyc的表达图3免疫细胞化学检测hepg2细胞vegf和c myc蛋白的 表达x200fig 3 immunocytochemical detection of vegf and c myc in hepg2 cells (x 200)c myc作为一种广泛存在的转录调节因了参与了许多基因表 达的调控，与细胞的增殖、生长、分化、凋亡、新陈代谢以及肿瘤 的形成有密切的关系18。该基因位于染色体8q24上，一方面通过 染色体易位与免疫球蛋白

13、轻链序列融合而被激活，另一方面通过 dna扩增导致功能失常，其编码的蛋口质能与核内的dna特异结 合行使转录调节功能。c myc在细胞静止期不表达，而在有丝分 裂原作用下迅速表达，促使细胞增殖、浸润，最终使细胞增殖异常 而癌变。过度表达的c myc原癌基因在肿瘤细胞周期调控中扮演 着重要的角色19o它能导致cdk抑制因子(kip1)从原本无活性的 cyclin e cdk2 kip1复合体中解离出来，使此复合物被磷酸化 而获得活性，促进细胞从g0/g1期向s期进行20o本实验研究了 hepg2细胞c myc mrna转录水平及蛋白翻译水平的改变，结果 显示经ccyc的表达明显下降，说明ccyc

14、的表达，而细胞周期调控 蛋白被认为是c myc重要的下游效应器，所以我们推测ccyc表 达密切相关。此外，血管生成在肝癌的生长、浸润以及转移过程中发挥着重 要的作用，新生的血管不仅能提供给肿瘤生长所需的营养成分，而 且提供了肿瘤细胞扩散的途径21,其中vegf是一高度特异的血 管内皮细胞有丝分裂素，它通过旁分泌方式作用于血管内皮细胞， 促进内皮细胞增殖和迁移，诱导新生血管的生成。已有研究发现， 实体瘤的发生、发展 分为无血管期和血管期，无血管期的肿瘤直 径不超过2 mm22,瘤体的营养由血液中氧气和营养物质通过弥散 作用供给，此期的肿瘤无诱导血管生成的能力，不会发生转移。进 入血管期后，肿瘤细

15、胞分泌大量vegf等血管生长因子，诱导新生 血管生成，导致瘤细胞迅速增殖，发生浸润和转移。本实验通过检 测经不同浓度ccyc的蛋白表达有关系。另外，垂盆草醇提物能有 效抑制hepg2细胞分泌vegf,具有一定的抗血管生成作用。本实 验结果为垂盆草应用范围的拓展提供了一定的实验依据。【参考文献】1国家药典委员会.中国药典m5版北京:化学 工业岀版 社,2005:149.2perz j,armstrong g,farrington l,et al.the contributions of hepatitis b virus and hepatitis c virus infections to c

16、irrhosis and primary liver cancer atrix degrading proteases j. j cellular biochemistry,2003,89(3):529 538.5shukla s,maclennan g t,flask c a,et al.blockade of b catenin signaling by plant flavonoid apigenin suppresses prostate carcinogenesis in tramp micej.cancer research,2007,67( 14):6925 6935.6jzhu

17、ang yc,ki 67,mmp 2 and vegf expression on prognosis of hepatocellular carcinoma patients undergoing tumor resectionj.®安:世界图书出版公司,1996:138.10 hermes m,ossattar j,et al.influence of an altered methy lation potential on mrna methylation and gene expression in hepg2cellsjl.exp cell res,2004,294(2):

18、325334.11 guo el 18,a polyb group protein,regulates cell proliferationand senescence via transcriptional repression of bmi 1 and c myc oncoproteinsj.mol biol cell,2007,18(2):536546.12 zhangr,et al.estrogenic effects of sedum sarmentosumbunge inovarie ectomized rats j. j nutr sci vitaminol,2004,50: 100105.15joh h,kang d gk.clinical presentation and natural course of hepatocellular carcinomaj.eur