总杞菊地黄丸定性鉴别和含量测定研究

1、杞菊地黄丸中各药材的定性鉴别及含量测定1、 处方 枸杞子40g 菊花40g 熟地黄160g 酒萸肉 80g 牡丹皮60g 山药80g 茯苓60g 泽泻60g2、 制法 以上八位味，取酒萸肉、牡丹皮、山药粉碎成细粉;泽泻、茯苓加水煎煮两次，第一次3小时，第二次2小时，滤过，滤液合并浓缩至相对密度为1.301.35（6080）的稠膏；熟地黄切片，加水煎煮三次，第一次3小时，第二次2小时，第三次1小时，滤过，滤液合并浓缩至相对浓度为1.301.35（6080）的稠膏；枸杞子以45%乙醇作溶剂，剩余的酒萸肉和牡丹皮及菊花已70%乙醇作溶剂，浸渍24小时后分别进行渗漉，收集渗漉液，合并上述渗漉液，回收乙

2、醇浓缩至相对浓度为1.301.35（6080）的稠膏；与上述细粉与稠膏混匀，制成浓缩丸，干燥，打光，即得。3、 性状 本品为棕色至棕黑色的浓缩丸，微甜而酸。四、各药材的定性鉴别及含量测定1、枸杞子定性鉴别研究实验仪器：冷凝管3个，圆底烧瓶3个，离心管6个，硅胶G薄层板，分液漏斗1个实验试剂：乙酸乙酯，甲醇，甜菜碱对照品，甲苯薄层板：硅胶G薄层板展开剂：甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15:2:1)的上层溶液供试品溶液的制备方法： 取本品15g，研碎，加水100ml，加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯50ml振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液 。

3、对照药材溶液的制备： 取枸杞子对照药材0.5g，加水50ml，加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯30ml振摇提取3次乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解 ，作为对照药材溶液。对照品溶液制备： 取甜菜碱对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液。阴性对照溶液的制备： 取阴性样品（缺枸杞子药材的样品），按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。操作方法： 照薄层色谱法（通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10微升，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15:2:1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm)下检视。供试品色谱中，在与

4、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。2、山药定性鉴别研究实验仪器：冷凝管1个，圆底烧瓶1个，分液漏斗1个，蒸发皿1个，硅胶G薄层板2个，离心管2个实验试剂：95%乙醇，乙酸乙酯，二氯甲烷，甲醇，浓氨试液，氯仿，10%磷钼酸乙醇溶液，香兰素硫酸溶液薄层板：硅胶G薄层板展开剂：乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（9：1：0.5）；氯仿:甲醇:水（64:50:10）显色剂：10%磷钼酸乙醇溶液；香兰素硫酸溶液供试品溶液的制备： 取本品8粒研碎，加二氯甲烷30ml，加热回流2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷1ml使溶解，作为对照药材溶液。对照药材溶液的制备：取山药对照药材5g，加二氯甲烷30ml

5、，加热回流2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷1ml使溶解，作为对照药材溶液。操作方法（薄层色谱法）吸取上述2种溶液各4l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（9：1：0.5）或氯仿:甲醇:水（64:50:10）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以显色剂：10%磷钼酸乙醇溶液或香兰素硫酸溶液，在105加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。3、 茯苓定性鉴别研究实验仪器：冷凝管1个，圆底烧瓶1个，分液漏斗1个，硅胶G薄层板2个实验试剂：甲醇，乙醇，乙酸乙酯，乙醚，10%硫酸乙醇溶液，2%香草醛酸溶液-乙醇（4: 1)，三氯甲烷，茯苓多

6、糖对照品。薄层板：硅胶G板展开剂：三氯甲烷-甲醇（3 : 1)或正丁醇-冰乙酸-水（4:1:5上层）或甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:5:0.5）显色剂：10%硫酸乙醇溶液或2%香草醛酸溶液-乙醇（4: 1)混合溶液供试品溶液的制备： 取本品杞菊地黄丸（浓缩丸）15g，研碎，加水100mL，加热回流30分钟，放冷，离心，取上清夜，用乙酸乙酯50mL振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。对照品溶液的制备： 取茯苓多糖加甲醇溶液1ml制成对照品溶液。阴性对照品溶液的制备： 取阴性样品（缺茯苓药材的样品），按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。对照药材溶

7、液的制备； 取茯苓对照药材1g，加乙醚50ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，制成对照药材溶液。操作方法： 照薄层色谱法（通则0502)试验，吸取上述供试品溶液,对照药材溶液,阴性对照液，分别点于同一块硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇（3 : 1)或正丁醇-冰乙酸-水（4:1:5上层）或甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:5:0.5）或为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液或2%香草醛酸溶液-乙醇（4: 1)混合溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，在紫外光(365nm)下检视。4、泽泻定性鉴别研究实验仪器: 冷凝管3个、圆底烧瓶3个、硅胶G薄层板2个、离

8、心管2个实验试剂: 乙酸乙酯、乙醇、乙醚、丙酮，环己烷，石油醚，5%硅钨酸乙醇溶液，薄层板: 硅胶G薄层板展开剂: 环己烷-乙酸乙酯(1 : 1)或石油醚-乙酸乙酯（3:1）或三氯甲烷-丙酮（3:1）显色剂: 5%硅钨酸乙醇溶液供试品溶液的制备: 方法1 取本品杞菊地黄丸（浓缩丸）15g,加水100ml,加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯50ml振摇提取，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。 方法2 取本品杞菊地黄丸（浓缩丸）6g，研碎，加乙醚40ml,加热回流1小时3次，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮1ml使溶解，作为供试品溶液。方法3 取本品杞

9、菊地黄丸(浓缩丸)3g,研细，加乙醇40ml,加热回流30分钟3次，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。对照药材溶液制备: 方法1 取泽泻对照药材0.5g,加水50ml,加热回流30分钟3次，放冷，离心，取上清液，用乙酸乙酯30ml振摇提取3次，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。方法2 取泽泻对照药材1g,加乙醚40ml,加热回流1小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮1ml使溶解，作为对照药材溶液。方法3 取泽泻对照药材1g,加60%乙醇40ml,加热回流30分钟，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。阴性对

10、照溶液的制备： 按处方比例称取除泽泻外的其他药材同法制成阴性对照品溶液。操作方法: 照薄层色谱法（通则0502)试验，分别吸取上述供试品溶液,对照药材溶液,对照品溶液和阴性对照液各5 L、3 L、3 L、5L点于同一块硅胶G板上，以环己烷-乙酸乙酯(1 : 1)或石油醚-乙酸乙酯（3:1）或三氯甲烷-丙酮（3:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷5%硅钨酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰。5、 熟地黄定性鉴别研究实验仪器：容量瓶，玻璃漏斗1个，分液漏斗1个，硅胶G薄层板2个实验试剂:水饱和正丁醇，甲醇，毛蕊花糖苷对照品,0.1% 2 ,2 -二苯基-1-苦胼基无水乙醇溶液薄层板：硅胶G薄层板

11、展开剂：乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16 : 0. 5 : 2)显色剂：0.1% 2 ,2 -二苯基-1-苦胼基无水乙醇溶液供试品溶液的制备： 取本品（以下“本品”均指：杞菊地黄丸，2010版药典中规定每8丸相当于饮片3g）8粒，研碎，加80%甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过,滤液蒸干，残渣加水5ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4 次 ，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。对照药材溶液的制备： 取熟地黄药材粉末lg ,同法制成对照药材溶液。对照品溶液制备： 取毛蕊花糖苷对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液。阴性对照溶液的制备： 取阴性样品（缺熟地黄药材

12、的样品），按照供试品溶液制备的条件制备样品，得阴性对照溶液。操作方法： 照薄层色谱法(通则 0502)试验 ，吸取供试品溶液51,对照品溶液2pl，分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(16:0.5:2)为展开剂，展开，取出，晾干，用0.1%的2,2 -二苯基-1-苦胼基无水乙醇溶液浸渍,晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点。6、 牡丹皮定性鉴别研究实验仪器：冷凝管3个，圆底烧瓶3个，硅胶G薄层板2个，玻璃漏斗1个实验试剂：乙醚，丙酮，环己烷，三氯甲烷，丹皮酚对照品,盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液薄层板：硅胶G薄层板两个展开剂：环己烷-乙酸乙酯（3:1)

13、；环己烷-三氯甲烷-无水乙醇（7:3:1）显色剂：盐酸酸性5%三氯化铁乙醇溶液供试品溶液的制备： 取本品6g，研碎，加乙醚40ml，加热回流1小时，滤过，滤液挥去乙醚，残渣加丙酮 l ml使溶解，作为供试品溶液。对照药材溶液制备： 取牡丹皮对照药材lg，同法制成对照药材溶液。对照品溶液制备： 取丹皮酚对照品，加丙酮制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。阴性对照溶液的制备： 按处方比例称取除牡丹皮外的其他药材同法制成阴性对照品溶液。阴性对照溶液制备其它各药材用量药材名称枸杞子菊花熟地黄酒萸肉山药茯苓泽泻用量（g）0.41380.41381.65520.82760.82760.62070.6

14、207操作方法： 照薄层色谱法通则（0502)试验，吸取供试品溶液，对照品溶液，阴性对照溶液各10ul分别点于同一硅胶 G薄层板上,使成条状,以环己烷-乙酸乙酯（ 3 : 1)或者环己烷-三氯甲烷-无水乙醇（7:3:1） 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸性 5%三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的条斑。同时用阴性对照品与对照药材对比以排除浓缩丸中其他药材的干扰。定量鉴别研究 本品方中牡丹皮为较主要的一味中药，故选其为测定对象。根据文献的有关报道，牡丹皮中有效成分为丹皮酚及芍药苷等，中国药典2015年版该方中以丹皮酚为其

15、含量测定项目，故本品以丹皮酚为含量测定指标，采用HPLC色谱法，并参考有关文献进行系统的方法学研究。实验仪器：高效液相色谱仪，具塞锥形瓶2个，25ml移液管1个，1ml移液管1个，分析天平（万分之一），冷凝管2个，圆底烧瓶2个。实验试剂：70 %甲醇，甲醇-水（7:3），丹皮酚对照品。供试品溶液的制备： 取本品1.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70 %甲醇 25ml ，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照品溶液制备： 取丹皮酚对照品适量，精密称定，加7 0 % 甲醇制成每 l ml中含丹皮酚 45ug的溶

16、液 ,即得。阴性对照溶液的制备： 按处方比例称取除牡丹皮外的其他药材,按杞菊地黄丸的制备工艺及供试品的制备方法制备阴性溶液。阴性对照溶液其它各药材用量药材名称枸杞子菊花熟地黄酒萸肉山药茯苓泽泻用量（g）0.10350.10350.41380.20690.20690.15520.1552色谱条件选择 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱；以甲醇-水（70:30）为流动性；检测波长为274nm。理论塔板数（n）的计算 n=16（tR /w）2 理论塔板数按丹皮酚峰计算不得少于3500。拖尾因子 据公式T=W0.05h/2d1计算 ， T范围在0.95-1.05之间。分离度 据公式R=2(tR2-tR1)

17、/(w1+w2)计算分离度（R1.5）。阴性对照试验 将供试品溶液（按正文中条件制备），阴性对照溶液，丹皮酚对照品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定。（应该得到三个色谱图）结果阴性应无干扰。线性试验 分别精密吸取对照品溶液4、8、12、16、20l,按上述色谱条件,测定峰面积。以色谱峰峰面积（y）为纵坐标,对照品进样量(x)为横坐标,绘制标准曲线并进行线性回归,得回归方程，相关系数r应不低于0.999。精密度试验重复性:分别取同一批供试品,按供试品测定项下方法,重复制备样品6次,进行测定，计算含量平均值，结果用RSD值表示，一般要求RSD3。中间精密度: 在同一个实验室

18、，不同时间由不同分析人员,用不同设备测定结果之间的精密度，结果用RSD值表示，一般要求RSD3。准确性（回收率） 取已知含量的样品，共6份，精密称定，分别精密加入一定量丹皮酚对照品，按照前述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，定容。按上述色谱条件进行测定，计算回收率，一般要求回收率应在95-105%之间, RSD3。稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液,分别在制备后0、1、2、3、4、6、8、12h进样,测定色谱峰峰面积, 计算峰面积积分平均值，结果用RSD值表示，一般要求RSD3。耐用性试验 不同品牌或不同批号的同类型色谱柱 ；流动相的组成比例的变化；柱温；流速，检测波长等。样品的含量测定 取不

19、同批号制剂样品，分别按供试品溶液的制备方法制备，按上述色谱条件测定计算出样品中丹皮酚的含量，RSD3。7、 酒萸肉定性鉴别研究实验仪器：冷凝管4个，圆底烧瓶4个，离心管2个，分液漏斗1个，硅胶G薄层板2个实验试剂：甲醇，30%乙醇，乙酸乙酯，乙醚，三氯甲烷，熊果酸对照品，10%硫酸乙醇薄层板：硅胶G薄层板展开剂：三氯甲烷-甲醇（3 : 1)；正丁醇-冰乙酸-水（4:1:5上层）；三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2下层）显色剂：10%硫酸乙醇供试品溶液的制备: 取本品杞菊地黄丸（浓缩丸）15g，研碎，加水100mL，加热回流30分钟，放冷，离心，取上清夜，用乙酸乙酯50mL振摇提取3次，分取乙酸乙

20、酯液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。对照品溶液的制备: 取熊果酸对照品 ，加乙酸乙酯制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。对照药材溶液的制备：取山茱萸对照药材1g，加乙醚40ml，加热回流1h，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1ml溶解，作为对照药材溶液。阴性对照药材溶液的制备: 按处方比例和制法制备不含山茱萸的阴性样品，制成阴性样品溶液。称取泽泻0.75g、茯苓0.75g和熟地黄2g，30ml水加热回流提取1个小时，过滤，提取液浓缩至一定浓度；取枸杞子0.5g、牡丹皮0.75g和菊花0.5g，70%乙醇加热回流提取1个小时，过滤，浓缩成适当浓度；合并以上两种浓缩液，加山药

21、细粉1g；加70%乙醇20mL，加热回流提取1个小时，滤过，蒸干，加适量水溶解，分别用10ml乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为阴性对照溶液。操作方法：按照薄层色谱法（通则0502)试验，吸取上述供试品溶液,对照品溶液，对照药材溶液,阴性对照液，分别点于同一块硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇（3 : 1)或正丁醇-冰乙酸-水（4:1:5上层）或三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2下层）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加热至斑点显色清晰，在紫外光(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上：，显相同颜色的突光斑点。8、 菊花定性鉴别实验仪器：冷凝管2个，圆底烧瓶2个，硅胶G薄层板2个，玻璃漏斗