鼠肺表面活性物质结合蛋白D提取方法改良及鉴定

1、鼠肺表面活性物质结合蛋白d提取方法改良及鉴定【摘要】目的：提取及纯化sd大鼠肺灌洗液中表面 活性物质结合蛋白d(sp-d)o方法：取sd大鼠肺泡灌洗液, 经tris hc1 edta法提取和maltose agarose亲和层析 法纯化sp d,用sds page电泳及sp d与幽门螺杆菌的 玻片凝集试验鉴定。结果：从sd大鼠肺灌洗液中提取出较 高浓度的蛋白，经sds page电泳检测，分子量约43 kd, 提取的蛋白可与幽门螺杆菌发生明显凝集。结论：采用 maltose agarose亲和层析法可以从sd大鼠肺灌洗液中获 得较高纯度的sp do【关键词】肺泡表面活性物质相关蛋白质d；大鼠，

2、sprague dawley；组织提取物；方法；生物学鉴定法 abstract objective： to isolate and purify surfac tant prot ein d(sp d) from sd rat bronchoalveolar lavage liquid. metheds： sp d were eluted from bronchoaveolar lavage fluid of sd mice with tris hc1 edta, purified bymaltose agaroseaffinity chromatography, and then deter

3、mined by sds polyacrylamide gel electrophresis (sds page) and agglutination test with helicobacter pylori. resuits： sp d with high conce ntration was obt ained by maltose agarose affinity chromatography. the molecular weight of the obt ained sp d was 43kda. helicobacter pylori could be a.gglutinated

4、 by the protein. conclusion： highly pure sp d could be obtained from sd rat bronchoalveolar lavage liquid by affinity chromatography on maltose agarosekey words pulmonary surfactant associated proteins d； rats, sprague dawley； tissue extracts； methods； biological assay肺表面活性物质结合蛋白d ( surfactant prote

5、in d,sp d)是肺泡表面活性物质(ps)的重要蛋白成分之一 1,在调节表面活性磷脂代谢和肺防御功能方面起重要作 用2,临床上应用合成的肺表面活性物质治疗呼吸窘迫综 合征、胎粪吸入综合征等肺部疾病3。1989年persson a 等4通过高效液相色谱法，采用硫酸镁吸附，柠檬酸钠洗 提获得sp d,随着对其结构的深入研究，提取方法不断改 进，1998 年 strong p 等5采用 maltose agarose 亲和层 析及superose 6凝胶过滤，提取到了高纯度的sp d。但 由于superose 6柱价格昂贵，使该方法的应用受到限制。 综合国外文献，删去superose 6柱的提取

6、步骤，将洗提液 进行调整，从sd大鼠肺泡灌洗液中进行sp d提取，并通 过sds page电泳和与幽门螺杆菌的凝集反应对其性质进行 了鉴定，报道如下。1材料与方法1.1实验动物及主要试剂sd大鼠（贵阳医学院实验动物中心）。maltose agarose （sigma）,蛋白分子量标准，edta,叠氮 钠，tris,盐酸，cac12,甘氨酸，丙烯酰胺，甲叉双丙烯 酰胺，过硫酸铁，temed及考马司亮蓝等。幽门螺杆菌 nctc11637,获赠于中国疾病预防控制中心。1. 2方法1.2. 1鼠支气管肺泡灌洗液（balf）的获取取清洁级sd大鼠9只，腹腔内注射20%乌拉坦0.5 ml/100 g,处死

7、动物，固定、无菌操作分离出鼠肺，行气管 插管后，用注射器注入15ml无菌生理盐水，轻拍双侧肺部, 然后回收获取balfo1.2.2 spd的提取将 balf 配制成 20 mmol/l tris hc1 和 10 mmol/l edta,调节ph值为7. 4,室温下搅拌1 h,在4匸下10 000 g离心40 min,取上清液配制成20 mmol/l cac12,重调ph 至7.4,得sp d粗提物。1.2.3 spd的纯化将1 ml maltose agarose加入2 ml无菌注射器(注 射器内先放一张滤纸片)，制成层析柱，用含有10 mmol/l cac12, 0.02% (w/v)叠氮

8、钠，20 mmol/l tris hc1 ph7. 4 的平衡缓冲液平衡层析柱。将sp d粗提物加入层析柱，滤 过后用含 1 ininol/l nacl、10 mmol/l cac12、0.02% (w/v) 叠氮钠、20 mmol/l tris hc1 ph7. 4的缓冲液洗涤层析柱, 再用平衡缓冲液洗涤至背景吸光水平，最后用含有10 mmol/l edta,ph 7. 4的tbs缓冲液洗提并收集sp d。约1 ml收集 1管，同时以tbs缓冲液调零检测每管sp d洗提液的a280 值。1.2.4 sds page 电泳按文献方法6制备10%的sds-聚丙烯酰胺凝胶，将 提取的sp d样品1

9、5 u1与15卩1上样缓冲液混合，与蛋 白分子量标准品分别加入凝胶加样孔，100 v电泳约1 h至 澳酚兰指示剂接近凝胶底部，停止电泳，取出凝胶，经考马 司亮蓝染色7后拍照。1.2.5 spd的浓缩用冷冻真空干燥器浓缩和干燥sp do1.2.6幽门螺杆菌与spd的凝集试验用接种环取无菌生理盐水于玻片上，挑取幽门螺杆菌 nctc11637哥伦比亚血琼脂平板新鲜培养物于玻片上，在生 理盐水中涂抹均匀，用接种环取1环500 mg/l的sp d水 溶液与玻片上的菌液充分混和，同时分别以生理盐水与菌液 及生理盐水与sp d混和作为阴性对照，轻微晃动玻片，观 察凝集现象。2结果2. 1 sds page电

10、泳分析收集a280达0.05以上的洗提液，共获得sp d洗提 液约10 ml,经sds page电泳，在分子量45 kd与35 kd 之间见一条清晰条带，在分子量大于94 kda以上亦可见一 条清晰条带。见图lo2. 2 spd的浓缩共提取9只大鼠balf的sp d,浓缩后的sp d干粉 经电子天平称量，获得0. 131 1 g sp do2. 3幽门螺杆菌与spd的凝集试验幽门螺杆菌nctc11637与sp d可发生明显凝集现 象，阴性对照未见凝集现象。3讨论spd是肺泡表面活性物质的重要蛋白成分之一，主要 由肺泡ii型上皮细胞和克拉细胞合成8。sp d参与调节肺 表面活性磷脂代谢，并在肺防

11、御功能方面起重要作用，它可 与细菌表面结构结合，促使细菌发生聚集，加强中性粒细胞 和巨噬细胞的吞噬作用，参与致病因子的非抗体依赖性识别 和清除9 o sp d在某些疾病时会表达异常，如卡氏肺胞子 虫肺炎、肺癌等2。有报道证实sp d也存在于其他组织 器官，如胃、肾脏等等9。提取sp d对于进一步阐明其 功能及其在感染性疾病免疫中的作用具有重要意义。spd的来源主要有天然和基因工程合成两种，在结构 和活性的完整性方面，天然spd无疑优于基因工程合成的 spdo天然spd主要来源于羊水、肺泡蛋白沉积症患者肺泡 灌洗液，由于标本量少且不易获得，从羊水及肺泡沉积症患 者获取spd有较大难度，已有从鼠、

12、猪等动物肺泡灌洗液中 获取spd9, 10的报道。spd的提取方法有盐析法、凝胶过滤等方法，国外学 者多采用maltose agarose亲和层析及superose 6凝胶 过滤，但这些提取柱价格高昂，特别是superose 6凝胶过 滤柱，使该方法在国内的应用受到限制，且国内目前尚无提 取spd的文献报道。本实验综合国外文献方法并进行适当改 良，采用tris hc1 edta法从sd大鼠的肺泡灌洗液中获 得spd粗提物后，省掉了昂贵的superose 6柱，用自制的 maltose agarose注射器柱进行亲和层析，使spd在ca2+ 存在时吸附于柱上，再用edta代替容易出现沉淀的mnc

13、12 以去除ca2+,获得了纯度较高的spd。从sds page电泳结 果可以看出，提取的spd在电泳后分别可于3545 kd及94 kd以上各见一清晰条带，与文献4报道的spd可有43 kd 的单体和150 kd的多聚体两种存在形式一致。经干燥浓缩 后称量，maltose agarose 1 ml 可提取到约 30 mg spd。 根据spd作为一种天然免疫成分可以与幽门螺杆菌发生凝集 的特性7,又通过玻片凝集试验观察了所提取的sp d与 幽门螺杆菌nctc11637的凝集反应，结果表明提取的蛋白与 幽门螺杆菌nctc11637可发生肉眼可见的明显凝集，进一步 证实tris hc1 edta

14、法和maltose agarose亲和层析法 可提取到较高纯度和浓度的sp d,为广泛、深入地进行 sp d的相关研究提供了更经济、实用的方法。【参考文献】1 crouch e d parghi,s f kuan,et al. surfactant protein d：subcellular localization in nonciliated bronchiolar epithelial cells j am jphysiol,1992 (263):l60-l66.2 瞿介明，容朝晖,何礼贤卡氏肺胞子虫肺炎肺表 面活性蛋白a和d的变化j 中华传染病杂 志,2000(2):91-95.3 赵

15、玉红肺表面活性物质临床应用进展j 医 学文选，2006(3):545-547.4 persso n a, cha ng d, rust k, et al. purif icati on and biochemical characterization of cp4 (spd)j .biochemitry,1989(15)： 6361-6367.5 strong p,u kishore,c morgan,et al. a novel method of purifying lung surfactant proteins a and d from the lung lavage of alveo

16、lar proteinosis patients and from pooled amniotic fluid. j immunol methodsj . 1998 (220):139-149.6 张维铭现代分子生物学实验手册m 北京科 学出版社,2003:157-168.7 王建晖，王宝刚蛋白质凝胶电泳的快速染色技 术j 食品科学，2007 (1) ： 223-224.8 voorhout w f, t veenendaa 1. immunocy to chemical localization of surfactant protein d(spd)in type ii cells, clara cells, and alveolar macrophages of rat lungj j histochem. cytochemistry,1992 (40):1589-1597.9 wafa khamri, anthony p moran, mulugeta l worku,et al. variations in helicobacter pylo