循环肿瘤细胞通过诱导系统性炎症及调控中性粒细胞的功能促进播散肿瘤细胞转移克隆的形成

1、循环肿瘤细胞通过诱导系统性炎症及调控中性粒细胞的功能促 进播散肿瘤细胞转移克隆的形成 尽管肿瘤的检测和治疗手段不断进步 , 但肿瘤的远处转移依然是 导致肿瘤相关死亡的最大原因。 循环肿瘤细胞在临床多种不同类型的 肿瘤病人体内都能检测出来 , 并且体内高水平的循环肿瘤细胞往往导 致肿瘤病人的差预后及生存期缩短。临床上 , 循环肿瘤细胞可以作为 液态活检的目标用来预测病人的预后及监测肿瘤的复发情况。 但除了 被认为是肿瘤转移起始细胞的来源外 , 关于循环肿瘤细胞是否能通过 其他机制影响肿瘤转移还知之甚少。目的 : 本研究为了探索循环肿瘤 细胞对肿瘤转移的作用及其作用机制。 方法 :(1) 利用两种

2、转移能力不 同的细胞系-B16F0和B16F1细胞,分别构建循环肿瘤细胞小鼠模型 (cir-B16F0 鼠)和肿瘤转移模型 (B16F1 荷瘤鼠);(2) 小鼠尾静脉先后 接种B1F0细胞和CFSE记的B16F1细胞，并分别于接种B16F1后5 h 和 24 h 处死小鼠并取其肺脏 , 然后冰冻切片并荧光显微镜下观察肺组 织中CFS商记肿瘤细胞的分布情况；(3)ELISA检测不同动物模型血 清中促炎因子-IL-6和IL-1 B -的浓度;(4)免疫组化检测不同模型 小鼠肺组织中中性粒细胞的浸润情况；(5)B16F1荷瘤鼠和B16F0与 B16F1混合接种鼠通过腹腔注射anti-Ly6G单克隆抗

3、体体内清除中性 粒细胞,然后观察观察其肺脏表面转移结节形成情况 ;(6) 从不同动物 模型体内分离其骨髓和腹腔趋化来的中性粒细胞，并将其与B16F1细胞混合接种到正常小鼠大腿肌肉 ,荷瘤 12天后去小鼠肌肉肿瘤组织 并称重;(7) 体内转染表达抗炎因子 -IL-37 的质粒,观察炎症对循环肿瘤细胞促进肿瘤转移及对中性粒细胞功能调控作用的影响 ;(8)real-time PCR检测 cir-B16F0 小鼠骨髓中性粒细胞中促瘤相关基因-Mmp9,Bv8,Arg1和Nos2及抑瘤相关基因-Trail 和Rab27a 的表达;分离 cir-B16F0 小鼠腹腔趋化来的中性粒细胞并体外用肿瘤 组织间液

4、(T-sMs)刺激培养12 h后real-timePCR佥测上述促瘤和抑瘤相关基因的表达 ;(9) 通过酶底物反应检测 cir-B16F0 小鼠腹腔中 性粒细胞中MPO勺释放，及通过流式细胞术检测cir-B16F0小鼠腹腔 中性粒细胞表面与其脱颗粒相关的表面标记分子 -CD63 的表达情 况;Western blot检测cir-B16F0小鼠腹腔中性粒细胞中与脱颗粒相 关的信号通路-P38MAPK和PI3K信号通路的激活情况；(10)分别用 real-time PCR 和ELISA检测cir-B16F0小鼠肺脏和脾脏中 Csf3(g-csf)和 Il6 的 mRNA水平，及其血清中 G-CSF

5、,IL-6 和 IL-1 B 的水平;(11)cir-B16F0小鼠体内中和IL-1 B后real-time PCR 检测其肺和脾中Csf3(g-csf) 和II6的mRN水平;(12)Western blot检测 cir-B16F0小鼠血清和肺脏中TLR2和TLR4配体-HMGB1,HSP70,S100A8,S100A9和 SAA3 的水平;(13)cir-B 16F0 小 鼠体内转染表达可溶性TLR2(sTLR2和 TLR4(sTLR4)质粒，观察 TLR2/4配体对循环肿瘤细胞诱导炎症反应和促进肿瘤转移的影响。结果:(1)循环肿瘤细胞通过促进播散肿瘤细胞(B16F1)的转移克隆形 成进而

6、促进肿瘤转移;(2)循环肿瘤细胞可以诱导IL-6,IL-1 B等促炎 因子的表达 , 进而诱导系统性炎症反应 ;(3) 循环肿瘤细胞促进肺组织 中中性粒细胞的浸润 ;(4) 体内清除中性粒细胞导致循环肿瘤细胞不能促进B16F1细胞肺转移；(5)循环肿瘤细胞促进中性粒细胞中Mmp9,Bv8,Arg1和Nos2基因的表达，而抑制TRAIL和Rab27a的表 达；(6) 循环肿瘤细胞上调中性粒细胞对肿瘤微环境刺激物的反应 性;(7)循环肿瘤细胞减弱中性粒细胞的脱颗粒能力及p38MAPI和PI3K 细胞信号通路的激活 ；(8) 体内转染表达 IL-37 能有效抑制循环 肿瘤细胞诱导的系统性炎症反应及其

7、对中性粒细胞功能的调控作用 , 但IL-37并不能直接作用于B16F1细胞，同时也不能直接影响循环肿 瘤细胞对中性粒细胞的功能及反应性的调控作用 ;(9)cir-B 16F0 小 鼠肺脏和脾脏中Csf3(g-csf)和116的mRN水平上调，同时,其血清 中G-CSF和IL-6的水平也上调；(10)cir-B16F0 小鼠中和IL-1 B后， 其肺和脾中Csf3(g-csf)和116的mRN水平均显著降低;(11)cir-B16F0 小鼠血清中TLR2/4配体-HMGB1和HSP7C水平上 升。同时，上调的TLR2/4配体进一步促进小鼠肺组织中内源性TLR2/4配体-S100A8,S100A9和SAA3的表达。这些TLR2/4配体共同促进 G-CSF,IL-6和IL-1 B的表达;(12)体内转染表达可溶性 TLR2(sTLR2) 和TLR4(sTLR4),可以有效抑制由循环肿瘤细胞诱导的G-CSF,IL-6和IL-1 B浓度的上调，同时也能有效