专题五 DNA的粗提取与鉴定上课用

1、在在NaClNaCl溶液浓度低于溶液浓度低于0.14 0.14 mol/Lmol/L时，时，DNADNA的溶解度随的溶解度随NaClNaCl溶液浓度的增加而逐渐溶液浓度的增加而逐渐降低；在降低；在0.14 mol/L0.14 mol/L时，时，DNADNA溶解度最小；当溶解度最小；当NaClNaCl溶溶液浓度继续增加时，液浓度继续增加时，DNADNA的的溶解度又逐渐增大。溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol2 molL L时，时，DNADNA的溶解度的溶解度最大，浓度为最大，浓度为 0 014 mol14 molL L时，时，DNADNA的溶解度最低。

2、利的溶解度最低。利用这一原理，可以使用这一原理，可以使DNADNA在在盐溶液中溶解或析出盐溶液中溶解或析出 从核从核DNA数目来看：猪数目来看：猪38条，鸡条，鸡78条，条，哺乳动哺乳动物血物血0条条，猕猴桃，猕猴桃58条，洋葱条，洋葱16条，豌豆条，豌豆14条，条，菠菜菠菜12条，条，大肠杆菌大肠杆菌1条条。请选择动植物材料。请选择动植物材料各一种。各一种。哺乳动物的血细胞无细胞核及细胞器。哺乳动物的血细胞无细胞核及细胞器。液体培养基中的大肠杆菌的液体培养基中的大肠杆菌的DNA量减少。量减少。鱼卵是减数分裂的产物。鱼卵是减数分裂的产物。 合适的材料：鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；极易

3、吸水胀破。问：我们应该如何将问：我们应该如何将DNA单独分离出来？单独分离出来？方案一 在滤液中加入在滤液中加入NaClNaCl，使，使NaClNaCl溶液浓度为溶液浓度为2mol/L2mol/L，过滤除去，过滤除去不溶的杂质不溶的杂质，再加入，再加入蒸馏水蒸馏水，调节调节NaClNaCl溶液浓度为溶液浓度为0.14mol/L0.14mol/L，析出，析出DNADNA，过滤，过滤除去除去溶液中的杂质溶液中的杂质，再用，再用2mol/L2mol/L 的的NaClNaCl溶液溶解溶液溶解DNADNA。 讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？方法步

4、骤方法步骤 加入物质加入物质 目的目的 1 1.制备鸡血细胞液制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液柠檬酸钠溶液 2 2.提取鸡血细胞细胞核物质提取鸡血细胞细胞核物质 20 m120 m1蒸馏水蒸馏水 幻灯片 18 3 3.溶解细胞核内的溶解细胞核内的DNADNA 2 m12 m1L L 的的NaCINaCI溶液溶液4040mLmL 幻灯片 18 4 4.析出含析出含DNADNA的黏稠物的黏稠物 蒸馏水蒸馏水 5 5.滤取含滤取含DNADNA的黏稠物的黏稠物 6 6.将将DNADNA的黏稠物再溶解的黏稠物再溶解 2 mol2 molL L 的的NaClNaCl溶液溶液20 mL20 mL 7 7.过滤含

5、过滤含DNADNA的的NaCNaCl l 溶液溶液 8 8.提取含有杂质较少的提取含有杂质较少的 DNADNA 冷却的冷却的9595的酒精的酒精50 mL50 mL 幻灯片 18 A A:(1)1)向试管中加入向试管中加入0 0.015 mol015 molL L 的的NaClNaCl溶液溶液5 5mLmL (2)2)加入加入DNADNA (3)43)4 mLmL二苯胺试剂二苯胺试剂 9 9.DNADNA的鉴定的鉴定 B B:(1)(1)向试管中加入向试管中加入0 0.015mol015molL L 的的NaClNaCl溶液溶液5 5mLmL (2)4 m2)4 mL 二苯胺试剂二苯胺试剂 加

6、入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加速血细胞破裂加速血细胞破裂 溶解溶解DNA 使使2mol/L的的NaCl溶液稀释至溶液稀释至0.14mol/L使得使得DNA最大限度地释出最大限度地释出 使含使含DNA的黏稠物被留在纱布上的黏稠物被留在纱布上使含使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中除去含除去含DNA的滤液中的杂质的滤液中的杂质提取提取DNA A出现蓝色出现蓝色 B无变化无变化一、提取血细胞核物质一、提取血细胞核物质 问题：问题：这时的滤液可能含有哪些细胞这时的滤液可能含有哪些细胞成分？成分？ 主要有主要有DNADNA、RNAR

7、NA、核蛋白、多糖、核蛋白、多糖等等 我们应该如何将我们应该如何将DNADNA单独分离出来？单独分离出来？ 将物质的量浓度为将物质的量浓度为2mol/L2mol/L的氯化钠溶的氯化钠溶液加入到滤液中，并用玻璃棒液加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个沿一个方向不停地轻轻搅拌方向不停地轻轻搅拌，使其混合均匀，使其混合均匀，这时这时DNADNA在溶液中呈溶解状态。在溶液中呈溶解状态。二、溶解细胞核内的二、溶解细胞核内的DNADNA三、析出含三、析出含DNADNA的粘稠物的粘稠物 缓慢贴壁加入蒸馏水，并用玻璃棒缓慢贴壁加入蒸馏水，并用玻璃棒沿沿一个方向不停地轻轻搅拌一个方向不停地轻轻搅拌，以利于，以利于DN

8、ADNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使加水量，使NaClNaCl溶液的终浓度为溶液的终浓度为0.10.10.2mol/L0.2mol/L，直到溶液中丝状物不再增，直到溶液中丝状物不再增加时为止。加时为止。四、滤取含四、滤取含DNADNA的粘稠物的粘稠物 用放有用放有多层纱布多层纱布的漏斗，过滤上一步的漏斗，过滤上一步中的溶液至中的溶液至1000mL1000mL的烧杯中，含的烧杯中，含DNADNA的的粘稠物被留在纱布上。粘稠物被留在纱布上。五、将五、将DNADNA的黏稠物再溶解的黏稠物再溶解 取一个取一个50mL50mL的烧杯，向烧杯内注入物的烧杯，向

9、烧杯内注入物质的量浓度为质的量浓度为2mol/L2mol/L的氯化钠溶液的氯化钠溶液20mL20mL，用，用钝头镊子钝头镊子将纱布上的黏稠物将纱布上的黏稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃棒夹至氯化钠溶液中，用玻璃棒沿一个沿一个方向不停地轻轻搅拌方向不停地轻轻搅拌，使黏稠物尽可，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。能多地溶解于溶液中。六、过滤含有六、过滤含有DNADNA的氯化钠溶液的氯化钠溶液 取一个取一个100mL100mL的烧杯，用放有两层纱布的烧杯，用放有两层纱布的漏斗，过滤上一步中的溶液，的漏斗，过滤上一步中的溶液，取其取其滤液滤液，DNADNA溶于滤液中。溶于滤液中。七、提取含杂质较少的七、提取

10、含杂质较少的DNADNA 纯化：向滤液中贴壁缓慢加入纯化：向滤液中贴壁缓慢加入50mL50mL冷冷却却的体积分数为的体积分数为95%95%乙醇，并用玻璃棒乙醇，并用玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌朝一个方向缓慢、均匀地搅拌，溶液，溶液中会出现含杂质较少的中会出现含杂质较少的DNADNA丝状物。丝状物。 用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。注意观察：丝状物是取上面的水分。注意观察：丝状物是什么颜色的？什么颜色的？ 白色白色八、八、DNADNA的鉴定的鉴定 溶解：在物质的量浓度为溶解：在物质的量浓度为2mol/L2mol/L的的NaClNaCl溶液溶液5m

11、L5mL，放入丝状物，放入丝状物，用玻璃用玻璃棒搅拌棒搅拌，使之溶解。同时设置不放，使之溶解。同时设置不放入丝状物的对照组。入丝状物的对照组。 显色：加入显色：加入4mL4mL的二苯胺试剂。混合的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于均匀后，将试管置于沸水中加热沸水中加热5min5min。观察颜色变化。观察颜色变化。1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3、二苯胺试剂要现配现用，否则会

12、影响鉴定的效果。练习练习1、请解释提取、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。的实验操作中主要的步骤的目的。答：提取答：提取DNA的的第一步是材料的选取第一步是材料的选取，其目的，其目的是一定要选取是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是第二步是DNA的释放和溶解的释放和溶解，这一步是实验成功，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；全部溶解；第三步是第三步是DNA的纯化的纯化，即根据，即根据DNA的溶解特

13、性、的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；与杂质分开；最后一步是对最后一步是对DNA进行鉴定进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。这是对整个实验的结果的检测。2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取与提取DNA一样容易吗？一样容易吗？答：答：提取蛋白质比提取提取蛋白质比提取DNA的难度大的难度大。这是因为，。这是因为，与与DNA相比，相比，蛋白质对温度、盐浓度、蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件等条件要敏感得多，很容易失活要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结；并且蛋白质的

14、空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取提取没有一种统一的方法没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。2.实验中实验中NaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为2 molL和和0.14 molL对对DNA有何影响有何影响?1.在在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是中加入蒸馏水的作用是( )。A.稀释血液、冲洗样品稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低使血细胞破裂、降低NaCl浓度使浓度使DNA析出析出C.使血细胞破裂、增大使血细胞破裂、增大DNA溶解量溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA答：答：B答：前者是溶解答：前者是溶解DNA，后者是使，后者是使DNA析出析出3.DNA3.DNA遇二苯