高效液相色谱[1]

1、高效液相色谱最新1高效液相色谱最新220.1 20.1 概述概述 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）：）：在经典液相色谱的在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱法的理论和实验方法，基础上，引入了气相色谱法的理论和实验方法，采用了采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，发展而成的一种现代液相色谱分析方法。发展而成的一种现代液相色谱分析方法。高效液相色谱最新3相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1分析对象分析对象 GC：能气化、热稳定

2、性好、且沸点较低的样品，能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚 物的样品不可检测物的样品不可检测 占有机物的占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品，溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制不受样品挥发性和热稳定性的限制, 分子量大、分子量大、 难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均 可检测用途广泛可检测用途广泛 占有机物的占有机物的80%高效液相色谱最新4vGC：流动相为惰性气体：流动相为惰性气体流动相与组分无亲合作用力，仅起运载作用；组分

3、流动相与组分无亲合作用力，仅起运载作用；组分只与固定相作用只与固定相作用 vHPLC：流动相为液体：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相种类较多，选择余地广流动相极性和流动相极性和pHpH值的选择也对分离起到重要作用值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性可以增大分离选择性2流动相差别流动相差别高效液相色谱最新5二、二、HPLC

4、的特点的特点高效液相色谱最新620.2 HPLC20.2 HPLC的分类和基本原理的分类和基本原理20.2.1 HPLC20.2.1 HPLC的分类的分类 1按固定相的聚集状态分：按固定相的聚集状态分： 液液-液色谱法（液色谱法（LLC）和液）和液-固色谱法（固色谱法（LSC）2按分离机制分：按分离机制分：高效液相色谱最新720.2.1 20.2.1 基本原理基本原理l 塔板理论塔板理论l 速率理论速率理论 在高效液相色谱中在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项则速率方程中的分子扩散项B/u较小，可以忽略不计，即较小，可

5、以忽略不计，即： H=A+ B/u+Cu H = A + C u 故液相色谱故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。经典液相色谱法经典液相色谱法 + 气相色谱法气相色谱法 液体的粘度比气体液体的粘度比气体大一百倍，密度为气大一百倍，密度为气体的一千倍，故体的一千倍，故降低降低传质阻抗传质阻抗是提高柱效是提高柱效主要途径主要途径高效液相色谱最新8 采用小粒度、窄分布的球形固定相，均匀装柱。采用小粒度、窄分布的球形固定相，均匀装柱。AA 采用低黏度流动相，低流速。采用低黏度流动相，低流速。C C ，u u 液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。液

6、相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。一般恒温操作。一般恒温操作。H = A + C u由由Van Deemter 方程式可以获得方程式可以获得HPLC分离条件：分离条件：高效液相色谱最新920.3 20.3 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法20.3.2 20.3.2 液液- -液分配色谱法液分配色谱法根据流动相与固定相极性的差别，可将液根据流动相与固定相极性的差别，可将液- -液色谱分为液色谱分为极性小的先流出，适于极性组分分离极性小的先流出，适于极性组分分离正相液正相液- -液色谱液色谱 流动相极性流动相极性 BC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系高

7、效液相色谱最新14B + H+ BH+RSO3Na RSO3- + Na+BH+ RSO3-|BH+ RSO3-（1）分离机理）分离机理 以分析碱类物质以分析碱类物质B B为例为例流动相流动相固定相固定相（PICB）中性离子对中性离子对高效液相色谱最新15（2）常用离子对试剂）常用离子对试剂 烷基磺酸钠烷基磺酸钠分析碱（正电荷）分析碱（正电荷）四丁基季铵盐四丁基季铵盐分析酸（负电荷）分析酸（负电荷）a与流动相的极性有关（同反相色谱）与流动相的极性有关（同反相色谱）b与与R的链长有关：的链长有关：R长，极性长，极性， k， tR（3）影响）影响k的因素的因素（4）适用）适用：有机酸、碱、盐，离子

8、型和非离子：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化合物的混合物。在药物分析中应用很广型化合物的混合物。在药物分析中应用很广高效液相色谱最新16在反相色谱法中，在反相色谱法中，通过调节流动相的通过调节流动相的pH，抑制样品组，抑制样品组分的解离分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，称为有机弱酸、弱碱的目的，称为离子抑制色谱法（离子抑制色谱法（ISCISC）（1）适用范围）适用范围 弱酸弱酸 3.0pKa 7.0弱碱弱碱 7.0pKa 8.0（2）抑制剂）抑制剂 弱酸（乙酸）、弱碱（氨水）或缓冲盐弱酸（乙酸）、弱碱（氨水）或缓冲盐（3

9、）影响）影响k的因素的因素a与流动相的极性有关（同反相色谱）与流动相的极性有关（同反相色谱）b与流动相与流动相pH有关：弱酸有关：弱酸 pHpKa k， tR 弱碱弱碱 反之反之高效液相色谱最新177 7种四环素类抗生素对照品种四环素类抗生素对照品色谱柱：色谱柱：C18（250mm*4.6mm，5m）流动相：甲醇流动相：甲醇-乙腈乙腈-0.01mol/L 草酸溶液草酸溶液（pH2.0）（11:12:67, V/V/V）检测器检测器 ：UV 267nm高效液相色谱最新18其分离原理与离子交换色谱原理一样，其分离原理与离子交换色谱原理一样，电导检测器检测。电导检测器检测。问题问题：由于：由于流动相

10、流动相都是强电解质，其电导率比都是强电解质，其电导率比待测离子约高待测离子约高2 2个数量级，这种强背景电导会完个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。全掩盖待测离子信号。19751975年年SmallSmall提出，在离子交换柱之后，再串结一提出，在离子交换柱之后，再串结一根根抑制柱抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。相，从而可

11、用电导检测器检测各种离子的含量。高效液相色谱最新19例：例：分析阴离子时，以分析阴离子时，以NaOHNaOH为流动相，抑制柱为高为流动相，抑制柱为高容量的强酸性阳离子交换树脂，则发生下列反应：容量的强酸性阳离子交换树脂，则发生下列反应：分离柱：分离柱：交换反应：交换反应：R R+ +OH OH - - + NaX + NaXR R+ +XX- - + NaOH+ NaOH洗脱反应：洗脱反应：R R+ +XX- - + + NaOHNaOHR R+ +OHOH- - + NaX+ NaX抑制柱：抑制柱：与组分反应：与组分反应：R R- -HH+ + + NaX + NaXR R- -NaNa+

12、+ + + HXHX与洗脱液反应：与洗脱液反应：R R- -HH+ + + NaOH + NaOHR R- -NaNa+ + + + H H2 2O O高效液相色谱最新20原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所种具有一般反应性能的所谓谓间隔臂间隔臂(环氧、联胺等环氧、联胺等)，再连接上再连接上配基配基(酶、抗原等酶、抗原等)，这种固载化的配基将只，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用

13、而被保的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。留。改变淋洗液后洗脱。高效液相色谱最新21 原理原理：对映异构体与手性选择物形成瞬间非对映立体异：对映异构体与手性选择物形成瞬间非对映立体异构构“配合物配合物”，由于两对映异构体形成的，由于两对映异构体形成的“配合物配合物”的稳定的稳定性不同，因而得到分离。性不同，因而得到分离。高效液相色谱最新2220.4 20.4 固定相固定相20.4.1 20.4.1 液液- -固色谱固定相固色谱固定相 大多具有吸附活性的吸附剂。大多具有吸附活性的吸附剂。 常用的有常用的有硅胶硅胶、氧化铝氧化铝以及以及高分子多孔微球高分子多孔微球1. 硅胶硅胶无定形全多孔

14、硅胶，球形全多孔硅胶、堆积硅珠无定形全多孔硅胶，球形全多孔硅胶、堆积硅珠2. 高分子多孔微球高分子多孔微球由苯乙烯与二乙烯苯交联而成由苯乙烯与二乙烯苯交联而成高效液相色谱最新23 化学键合固定相化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相；目前应用最广、性能最佳的固定相； 一般的键合相用硅胶为载体：一般的键合相用硅胶为载体： a. 硅氧碳键型：硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiOSi C (ODS） 20.4.2 20.4.2 化学键合相化学键合相1. 非极性键合相非极性键合相 键合相表面基团为非极性烃基，键合相表面基团为非极性烃基，如如C18 、C8、 C1

15、和苯基等。和苯基等。一般用于反相色谱一般用于反相色谱高效液相色谱最新24（1） 载体性质载体性质多数产品采用全多孔多数产品采用全多孔YWG、YQG或堆积硅珠作载体或堆积硅珠作载体 YQG-C18H37（5 5m m）、）、YWG-C6H5（10 m） Nucieosil C18、Zorbax-ODS（2） 表面覆盖度表面覆盖度 参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例覆盖度的大小，决定是分配还是吸附作用占主导。覆盖度的大小，决定是分配还是吸附作用占主导。（3） 键合基团的链长键合基团的链长 链长链长、极性、极性、载样量、载样量、k k值值高效

16、液相色谱最新25时间，时间，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。高效液相色谱最新26 常见的有醚基和二羟基键合相。常见的有醚基和二羟基键合相。 此类固定相应用较少。此类固定相应用较少。2. 中等极性键合相中等极性键合相3. 极性键合相极性键合相常用极性键合相

17、为氨基键合相（强极性）、常用极性键合相为氨基键合相（强极性）、氰基（中强极性）键合相。氰基（中强极性）键合相。一般用于正相色谱。一般用于正相色谱。高效液相色谱最新27 流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。 流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况。离状况。不与固定相发生化学反应不与固定相发生化学反应对试样有适宜的溶解度，对试样有适宜的溶解度，k=25纯度要高，粘度要小纯度要高，粘度要小必须与检测器相适应必须与检测器相适应20.5 20.5 流动相（溶剂系统）流动相（溶剂系统）流动相的基本要求流动相的基本要求高效液相色谱最

18、新2822114kknRs121212RRttkkKK 主要受溶剂种类的影响主要受溶剂种类的影响k 主要由溶剂的配比所决定主要由溶剂的配比所决定高效液相色谱最新2920.5.2 Snyder20.5.2 Snyder溶剂分类溶剂分类 SnyderSnyder选了三个参考物质，用于检验溶剂的三种选了三个参考物质，用于检验溶剂的三种分子间作用力，分别用分子间作用力，分别用X Xe e、X Xd d及及X Xn n表述。表述。 将将8181种色谱常用溶剂，按种色谱常用溶剂，按X Xe e、X Xd d及及X Xn n在三角形坐标在三角形坐标图上的相邻关系分为八类（组）图上的相邻关系分为八类（组）高效

19、液相色谱最新30表中的表中的PP代表在正相色谱与硅胶吸附色谱法中溶剂的极性。代表在正相色谱与硅胶吸附色谱法中溶剂的极性。PP大，洗脱能力大。大，洗脱能力大。XeXe、XdXd与与XnXn为三种作用力的相对值，三者为三种作用力的相对值，三者之和为之和为1 1。其数值的大小，表示作用力的强弱。其数值的大小，表示作用力的强弱。高效液相色谱最新31质子给予体质子给予体偶极相互作用偶极相互作用质子接受体质子接受体溶剂选择性分类三角形图溶剂选择性分类三角形图Xe Xd Xn 12345678纯质子纯质子接受体接受体强偶极中性强偶极中性化合物化合物纯质子纯质子给予体给予体高效液相色谱最新321 1 组：脂肪

20、醚（纯质子接受体）组：脂肪醚（纯质子接受体）2 2 组：脂肪醇（质子接受组：脂肪醇（质子接受- -给予体）给予体）3 3 组：吡啶衍生物、四氢呋喃（质子接受体，易极化）组：吡啶衍生物、四氢呋喃（质子接受体，易极化）4 4 组：乙二醇、苄醇、乙酸、甲酰胺（质子给予体）组：乙二醇、苄醇、乙酸、甲酰胺（质子给予体）5 5 组：二氯甲烷、二氯乙烷（大偶极距）组：二氯甲烷、二氯乙烷（大偶极距）6 6 组：脂肪酮、酯、二氧六环、腈组：脂肪酮、酯、二氧六环、腈7 7 组：芳烃、芳醚、硝基化合物组：芳烃、芳醚、硝基化合物8 8 组：氟代醇、氯仿、水（质子给予体）组：氟代醇、氯仿、水（质子给予体）高效液相色谱最

21、新33流动相类别流动相类别 按流动相组成分：按流动相组成分：单组分和多组分；单组分和多组分； 按极性分：按极性分：极性、弱极性、非极性；极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱。等度洗脱和梯度洗脱。 常用溶剂：常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、水。乙腈、甲醇、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。高效液相色谱最新343. 3. 流动相选择流动

22、相选择 采用正相液采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。保留时间缩短。 在选择溶剂时，在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据溶剂的极性是选择的重要依据。正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强高效液相色谱最新35选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应

23、注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）使用前需要用微孔滤膜过滤，除去固体颗粒。）使用前需要用微孔滤膜过滤，除去固体颗粒。（3）流动相使用前最好脱气。）流动相使用前最好脱气。高效液相色谱最新3620.6 20.6 高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱最新37输液系统输液系统进样系统进样系统色谱柱系统色谱柱系统检测系统检测系统温控系统温控系统记录系统记录系统液相色谱法的一般流程简略图液相色谱法的一般流程简略图高效液相色谱最新381. 柱塞往复泵柱塞往

24、复泵无脉动无脉动流量恒定流量恒定能自由调节流量能自由调节流量耐高压耐高压耐腐蚀等特性耐腐蚀等特性20.6.1 输液泵输液泵高效液相色谱最新392. 梯度洗脱装置梯度洗脱装置高压二元梯度高压二元梯度: 利用两台高压输液利用两台高压输液泵，将两种不同极性的泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进梯度混合室，混合后进入色谱柱。入色谱柱。低压梯度低压梯度: 在常压下在常压下, 通过比例调通过比例调节阀节阀,将两种或多种不同极将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。入高压泵中混合。高效液相色谱最新4020.6.2 进样器与色谱

25、柱进样器与色谱柱1. 进样器进样器 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的通常使用耐高压的六通阀进样装置六通阀进样装置 高效液相色谱最新412. 色谱柱色谱柱 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径24.6 mm，柱长，柱长1025 cm。3. 色谱柱柱效的评价色谱柱柱效的评价 药典规定，用药典规定，用HPLCHPLC建立分析方法时，需进行建立分析方法时，需进行“系统适用性试验系统适用性试验” 最小理论塔板数、分离度、重复性和拖尾因子最小理论塔板数、分离度、重复性和拖尾因子高效液相色谱最新4220.6.3 液相色谱检测器液相色谱检测器特点：特点： 灵敏度高

26、；灵敏度高； 噪音低；噪音低； 不破坏样品；不破坏样品； 对流动相的流速和温度波动不敏感；对流动相的流速和温度波动不敏感； 可用于梯度洗脱可用于梯度洗脱 属于浓度型检测器属于浓度型检测器 1. 紫外检测器紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。高效液相色谱最新43紫外检测器的弱点紫外检测器的弱点只能检测有紫外吸收的样品只能检测有紫外吸收的样品流动相的选择有一定的限制，检测波长须大流动相的选择有一定的限制，检测波长须大于流动相的截止波长于流动相的截止波长截止波长截止波长紫外检测器的类型紫外检测器的类型用用1cm1cm光径的吸收池装光径的吸收池装待测溶剂待测溶剂，用空气作参比，用空气作参比，改变照射波长，当吸光值改变照射波长，当吸光值A=1A=1时，此时的波长称为时，此时的波长称为该溶剂的该溶剂的截止波长截止波长固定波长、固定波长、可变波长可变波长、光电二极管阵列光电二极管阵列高效液相色谱最新44（3 3） 光电二极管阵列检测器（光电二极管阵列检测器（DADDAD） 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特个二极