第三章沉淀技术

1、第三章第三章第一节第一节 蛋白质沉淀的基本原理蛋白质沉淀的基本原理 第二节第二节 蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用应用 一、蛋白质的溶解性一、蛋白质的溶解性 蛋白质是由许多氨基酸缩水形成的一条或几条多肽链所蛋白质是由许多氨基酸缩水形成的一条或几条多肽链所组成的两性高分子聚合物，溶解性是由其组成、构象以及分组成的两性高分子聚合物，溶解性是由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基子周围的环境所决定。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基分布在蛋白酸残基向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基分布在蛋

2、白质立体结构的外表面。因此，质立体结构的外表面。因此，蛋白质表面大部分是亲水的，蛋白质表面大部分是亲水的，而其内部大部分是疏水的而其内部大部分是疏水的 ( (见图见图4-1) 4-1) ，亲水和疏水区域的分，亲水和疏水区域的分布和程度将决定蛋白质在水相环境中的溶解程度。在生理布和程度将决定蛋白质在水相环境中的溶解程度。在生理pHpH值条件下，如果这些可离子化的基团和水分子在蛋白质表面值条件下，如果这些可离子化的基团和水分子在蛋白质表面同时存在，则离子化基团至少能部分带电并被溶剂化。同时存在，则离子化基团至少能部分带电并被溶剂化。分子分子量的大小对蛋白质的溶解度也会有影响量的大小对蛋白质的溶解度

3、也会有影响，通常情况下分子量，通常情况下分子量小的蛋白质比起在结构上类似的大分子量蛋白质更易溶解小的蛋白质比起在结构上类似的大分子量蛋白质更易溶解。 另外，蛋白质的溶解度同样另外，蛋白质的溶解度同样也取决于所处环境的物理化学性也取决于所处环境的物理化学性质。影响蛋白质溶解度的外部因质。影响蛋白质溶解度的外部因素主要有温度、素主要有温度、pHpH、介电常数和介电常数和离子强度。但是在同一特定的外离子强度。但是在同一特定的外部条件下，不同的蛋白质具有不部条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度，这是因为同的溶解度，这是因为溶解度归溶解度归根结底取决于溶质本身的分子结根结底取决于溶质本身的分子结构构。如

4、分子所带电荷的性质和数。如分子所带电荷的性质和数量、亲水与疏水基团的比例及两量、亲水与疏水基团的比例及两种基团在蛋白质分子表面的排列种基团在蛋白质分子表面的排列等。等。 二、蛋白质胶体溶液的稳定性二、蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质分子是分散相，蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质分子是分散相，水是分散介质。就其分散程度来说，蛋白质溶液属于胶体水是分散介质。就其分散程度来说，蛋白质溶液属于胶体系统，但是它的分散相质点是分子，它是蛋白质分子与溶系统，但是它的分散相质点是分子，它是蛋白质分子与溶剂（水）所构成的均相系统，分散程度以分散相质点的半剂（水）所构成的均相系统，分散程度

5、以分散相质点的半径来衡量。根据分散程度可以把分散系统分为径来衡量。根据分散程度可以把分散系统分为3 3类：分散相类：分散相质点小于质点小于1 1nmnm的为真溶液，大于的为真溶液，大于100100nmnm的为悬浊液，介于的为悬浊液，介于1 1nmnm100nm100nm的为胶体溶液。从蛋白质相对分子量的测定和的为胶体溶液。从蛋白质相对分子量的测定和形状的观测知道，其分子的大小已达到胶体质点形状的观测知道，其分子的大小已达到胶体质点1 1nmnm100nm100nm范围之内，具有胶体性质，如布朗运动、丁达尔现象、范围之内，具有胶体性质，如布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、粘度大以及不能透过半透膜的

6、性质等。电泳现象、粘度大以及不能透过半透膜的性质等。 球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈地吸引水分子球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈地吸引水分子作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围。实验证明，作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围。实验证明，每一克蛋白质约可以结合每一克蛋白质约可以结合0.30.3g g0.5g0.5g的水，使蛋白质分子表的水，使蛋白质分子表面形成一层水膜，称面形成一层水膜，称水化膜水化膜。蛋白质分子表面具有许多可解。蛋白质分子表面具有许多可解离的基团，因此在一定的离的基团，因此在一定的pHpH条件下，能与其周围电性相反的条件下，能与其周围电性相反的离子形成所谓

7、离子形成所谓双电层双电层。由于水化层和双电层这两种稳定的因。由于水化层和双电层这两种稳定的因素，使蛋白质溶液成为亲水的胶体溶液。由于水化膜和双电素，使蛋白质溶液成为亲水的胶体溶液。由于水化膜和双电子层的存在，蛋白质颗粒彼此不能接近，因而增加了蛋白质子层的存在，蛋白质颗粒彼此不能接近，因而增加了蛋白质溶液的稳定性，阻碍蛋白质胶粒从溶液中沉淀出来。溶液的稳定性，阻碍蛋白质胶粒从溶液中沉淀出来。 三、沉淀动力学三、沉淀动力学 溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值降低是一个动力溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集学过程。当体系变得不稳定以后

8、，分子互相碰撞并产生聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：热运动作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：热运动（布朗运动）；对流运动，由机械搅拌产生；差速沉降，（布朗运动）；对流运动，由机械搅拌产生；差速沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。其中和两种机理在蛋由颗粒自由沉降速度不同造成的。其中和两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，第白质沉淀中起主导作用，第3 3种机理在沉降过程中起主导作种机理在沉降过程中起主导作用（如在废水处理中）。由布朗运动所造成的碰撞导致异向用（如在废水处理中）。由布朗运动所造成的碰撞导致异向聚集，而由对流运动所造成的碰撞导致同向聚集。聚集，而由对流运动所造成的碰撞

9、导致同向聚集。 沉淀剂的性质和浓度，加入蛋白质溶液的方式，反应沉淀剂的性质和浓度，加入蛋白质溶液的方式，反应器的几何形状和水力学特性都会影响沉淀过程的动力学和聚器的几何形状和水力学特性都会影响沉淀过程的动力学和聚集体的数量与大小。沉淀剂的加入可快可慢，可以溶液形式集体的数量与大小。沉淀剂的加入可快可慢，可以溶液形式也可以固体形式加入（如硫酸铵）。在搅拌式反应器或管式也可以固体形式加入（如硫酸铵）。在搅拌式反应器或管式反应器或活塞式流动反应器中，它们的混合情况各不相同，反应器或活塞式流动反应器中，它们的混合情况各不相同，因此沉淀剂和蛋白质溶液之间的接触状况在这些反应器中很因此沉淀剂和蛋白质溶液之

10、间的接触状况在这些反应器中很不相同，得到的絮体或聚集体的性质也不相同。不相同，得到的絮体或聚集体的性质也不相同。 一、基本方法一、基本方法 蛋白质的沉淀有蛋白质的沉淀有可逆和不可逆沉淀可逆和不可逆沉淀两种。蛋白质发生沉两种。蛋白质发生沉淀后，若用透析等方法除去使蛋白质沉淀的因素后，可使蛋淀后，若用透析等方法除去使蛋白质沉淀的因素后，可使蛋白质恢复原来的溶解状态，这就是蛋白质的可逆沉淀。重金白质恢复原来的溶解状态，这就是蛋白质的可逆沉淀。重金属盐类、有机溶剂、生物碱试剂等也可使蛋白质发生沉淀，属盐类、有机溶剂、生物碱试剂等也可使蛋白质发生沉淀，但不能用透析等方法除去沉淀剂而使蛋白质重新溶解于原来

11、但不能用透析等方法除去沉淀剂而使蛋白质重新溶解于原来的溶剂中，这种沉淀作用称为不可逆的沉淀。生化分离纯化的溶剂中，这种沉淀作用称为不可逆的沉淀。生化分离纯化中最常用的几种蛋白质的沉淀方法是：中最常用的几种蛋白质的沉淀方法是：盐析法（中性盐沉盐析法（中性盐沉淀）、有机溶剂沉淀、选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性淀）、有机溶剂沉淀、选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）、等电点沉淀、有机聚合物沉淀、金属离子沉淀法。沉淀）、等电点沉淀、有机聚合物沉淀、金属离子沉淀法。 1 1盐析法（中性盐沉淀）盐析法（中性盐沉淀） 盐析法中常用的中性盐有盐析法中常用的中性盐有( (NHNH4 4) )2 2SOSO4

12、 4、NaNa2 2SOSO4 4、NaHNaH2 2POPO4 4等。等。 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，称为随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，称为“盐溶盐溶”；当盐；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称这种现象称“盐析盐析”。盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，可恢。盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，可恢复蛋白质的活性。除蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都复蛋白质的活性。除蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等

13、都可以用盐析法进行沉淀分离，可以用盐析法进行沉淀分离，20204040饱和度的硫酸铵可以饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，使许多病毒沉淀，4343饱和度的硫酸铵可以使饱和度的硫酸铵可以使DNADNA和和rRNArRNA沉淀，沉淀，而而tRNAtRNA保留在上清液中。盐析法突出的优点是：成本低，不保留在上清液中。盐析法突出的优点是：成本低，不需要特别昂贵的设备；操作简单、安全；对许多生物活性需要特别昂贵的设备；操作简单、安全；对许多生物活性物质具有稳定作用。常用于各种蛋白质和酶的分离纯化。物质具有稳定作用。常用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 （1 1）中性盐沉淀蛋白质的基本原理）中性盐沉淀蛋白质的

14、基本原理 蛋白质和酶均易溶蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的于水，因为该分子的COOHCOOH、NHNH2 2和和OHOH都是亲水基团，都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成分子周围形成1 1nmnm100nm100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力。蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越子之间的作用力。蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水

15、中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。图形成沉淀。图4-24-2为盐析示意图。为盐析示意图。 图图4-2 4-2 蛋白质盐析原理示意图蛋白质盐析原理示意图 （2 2）中性盐的选择）中性盐的选择 常用的中性盐中最重要的是（常用的中

16、性盐中最重要的是（NHNH4 4) )2 2SOSO4 4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： 溶解度大，尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是溶解度大，尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（因而盐析操作也要求在低温下（0044）进行。）进行。 分离效果好。有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就分离效果好。有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去可以除去7575的杂蛋白，纯度提高了四倍。的杂蛋白，纯度

17、提高了四倍。 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用（或蛋白质用（2 23 3）mol/Lmol/L的的( (NHNH4 4) )2 2SOSO4 4保存可达数年之久。保存可达数年之久。 价格便宜，废液可以肥田不污染环境。价格便宜，废液可以肥田不污染环境。 （3 3）盐析的操作方法）盐析的操作方法 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较度太大，要使蛋白质完

18、全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。长的离心时间。 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量见下表。硫酸铵浓度各种饱和度下需加固体硫酸铵的量见下表。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数。而不用实际的克数或克分子数。 （4 4）盐析曲线的制作）盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：和度。具体操作方法如下： 取已定量测定蛋白质或酶的

19、活性与浓度的待分离样品溶取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至液，冷至0055，调至该蛋白质稳定的，调至该蛋白质稳定的pHpH值，分值，分6 61010次次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，

20、如此连续可得到二个级分，如此连续可得到6 61010个级分，按照每次加入硫个级分，按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pHpH缓冲液中，测定其蛋缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。 （5 5）盐析的影响因素）盐析的影响因素 有关影响盐析的因素如下所述。有关影响盐析的因素如下所述。 蛋白质的浓度蛋白质

21、的浓度 中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。低。

22、通常认为比较适中的蛋白质浓度是通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.52.53.03.0，相当，相当于于25 25 mg/mLmg/mL30 mg/30 mg/mLmL。 pHpH值对盐析的影响值对盐析的影响 蛋白质所带净电荷越多，它的蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变溶解度就越大。改变pHpH值可改变蛋白质的带电性质，因而就值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pHpH值常选在该蛋值常选在该蛋白质的等电点附近。白质

23、的等电点附近。 温度的影响温度的影响 温度是影响溶解度的重要因素，对于温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的。在一般中蛋白质的溶解度大多数还是随温度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。情况下，对蛋白质盐析的温度要

24、求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在但对于某些对温度敏感的酶，要求在0044下操作，以避下操作，以避免活力丧失。免活力丧失。 2 2有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 （1 1）基本原理）基本原理 主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如2020时水的介电常数为时水的介电常数为8080，而乙醇和丙酮的介电常数分别是，而乙醇和丙酮的介电常数分别是2424和和21.421.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶

25、液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。质溶解度降低而沉淀。 另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。 有机溶剂沉淀法的优点是：分辨能力比盐析法高，即有机溶剂沉淀

26、法的优点是：分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀；沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用内沉淀；沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。其透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。作需在低温下进行。 （2 2）有机溶剂的选择和浓度的计算）有机溶剂的选择和浓度的计算 有机溶剂的选择有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉

27、淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。乙醇。 进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算： V = VV = V0 0 (S(S2 2 S S1 1) ) (100(100S S2 2) (4-1) (4-1) 式中式中 VV需加入需加入100100浓度有机溶剂的体积，浓度有机溶剂的体积，mLmL； V

28、V0 0原溶液体积，原溶液体积，mLmL； S S1 1原溶液中有机溶剂的浓度，原溶液中有机溶剂的浓度，g/100mLg/100mL； S S2 2所要求达到的有机溶剂的浓度，所要求达到的有机溶剂的浓度，g/100mLg/100mL。 100 100是指加入的有机溶剂浓度为是指加入的有机溶剂浓度为100100，如所加入的有机，如所加入的有机溶剂的浓度为溶剂的浓度为9595，上式的，上式的(100(100S S2 2) ) 项应改为项应改为 (95 (95S S2 2) ) 。 上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发情况，实际上存在一定的

29、误差。有时为了获得沉淀而不着重情况，实际上存在一定的误差。有时为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。 （3 3）有机溶剂沉淀的影响因素有关影响有机溶剂沉淀）有机溶剂沉淀的影响因素有关影响有机溶剂沉淀的因素如下所述。的因素如下所述。 温度多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解温度多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。值得注意的是大多数生物大分子如蛋度随温度降低而下降。值得注意的是大多数生物大分子如蛋白

30、质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度（机溶剂必须预先冷至较低温度（-10-20-10-20），操作要在冰，操作要在冰浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。 样品浓度样品浓度对有机溶剂沉淀生物大分子的影样品浓度样品浓度对有机溶剂沉淀生物大分子的影响

31、与盐析的情况相似：低浓度样品要使用比例更大的有机溶响与盐析的情况相似：低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。但对于低浓度的样品，杂蛋白与性的样品易产生稀释变性。但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。反之，对于高样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。反之，对于高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降。通常，使用白的共沉淀作用大，分离效果下降。通常，使

32、用5 5 mg/mLmg/mL20 mg/20 mg/mLmL的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的沉淀分离效的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的沉淀分离效果。果。 pHpH值值 有机溶剂沉淀适宜的有机溶剂沉淀适宜的pHpH值，要选择在样品稳值，要选择在样品稳定的定的pHpH值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pHpH值，值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。 离子强度离子强度 离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。以蛋白质为例，盐浓度太大或太

33、小都有不利影响，重要因素。以蛋白质为例，盐浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中通常溶液中盐浓度以不超过盐浓度以不超过5 5为宜为宜，使用乙醇的量也以不超过，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性原蛋白质水溶液的倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常是在低盐或低浓度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。度缓冲液中沉淀蛋白质。 有机溶剂沉淀法经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等生物有机

34、溶剂沉淀法经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分离，使用时先要选择合适的有机溶剂，然后注大分子的沉淀分离，使用时先要选择合适的有机溶剂，然后注意调整样品的浓度、温度、意调整样品的浓度、温度、pHpH值和离子强度，使之达到最佳值和离子强度，使之达到最佳的的分离效果。沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一分离效果。沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。活性

35、。 3 3选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法 这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯，称为选择件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。常用的有热变性、选择性酸碱变性和有机溶性变性沉淀法。常用的有热变性、选择性酸碱变性和有机溶剂变性等。剂变性等。多用于除去某些不耐热的和在一定多用于除去某些不耐热的和在一定pHpH值下易变性值下易变性的杂蛋白。的杂蛋白。 （1 1）热变性）

36、热变性 利用生物大分子对热的稳定性不同，加热利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使某些非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在升高温度使某些非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最为简便，不需消耗任何试剂，但分离效率溶液中。此方法最为简便，不需消耗任何试剂，但分离效率较低，通常用于生物大分子的初期分离纯化。较低，通常用于生物大分子的初期分离纯化。 （2 2）有机溶剂）有机溶剂 不同蛋白质和酶等对于表面活性剂和有不同蛋白质和酶等对于表面活性剂和有机溶剂的敏感性不同，在分离纯化过程中使用它们可以使那机溶剂的敏感性不同，在分离纯化过程中使用它们可以使那些敏感性强的杂蛋白变性沉淀，

37、而目的物仍留在溶液中。使些敏感性强的杂蛋白变性沉淀，而目的物仍留在溶液中。使用此法时通常都在冰浴或冷室中进行，以保护目的物的生物用此法时通常都在冰浴或冷室中进行，以保护目的物的生物活性。活性。 （3 3）选择性酸碱变性）选择性酸碱变性 利用蛋白质和酶等在不同利用蛋白质和酶等在不同pHpH值条值条件下的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化件下的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤。流程中附带进行的一个分离纯化步骤。 4 4等电点沉淀法等电点沉淀法 用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，此法多与用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，此法多与其

38、他方法结合使用。其他方法结合使用。 等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质，在等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。但是，由于许多蛋白质的等电点此法进行初步的沉淀分离。但是，由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较

39、溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或低，效果不理想，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。此其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。此法主要用在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的法主要用在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。物。 5 5有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法 该法主要使用该法主要使用PEGPEG聚乙二醇（聚乙二醇（PolyethyenePolyethyene glycol glycol）作作为沉淀剂。有机聚合物最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一

40、为沉淀剂。有机聚合物最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中应用些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中应用最多的是聚乙二醇最多的是聚乙二醇HOCHHOCH2 2(CH(CH2 2OCHOCH2 2) )n nCHCH2 2OH (n OH (n 4)( Polyethylene Glycol 4)( Polyethylene Glycol 简写为简写为 PEG )PEG )，它的亲水性强，它的亲水性强，溶于水和许多有机溶剂，无毒，对热稳定，对大多数蛋白质溶于水和许多有机溶剂，无毒，对热稳定，对大多数蛋白质有保护作用，分子量广有保护作用，分子量广

41、泛，在生物大分子制备中，用的较多泛，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为的是分子量为600060002000020000的的 PEGPEG。 PEGPEG的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液时还受离子强度、溶液pHpH和温度等因素的影响。和温度等因素的影响。 在一定的在一定的pHpH下，盐浓度越高，所需下，盐浓度越高，所需PEGPEG的浓度越低，溶的浓度越低，溶液的液的pHpH越接近目的物的等电点，沉淀所需越接近目的物的等电点，沉淀所需PEGPEG的浓度越低。的浓度越低。在一定范围内，高分子量和浓度高的在一定范围内，高分子量和浓度高的PEGPEG沉淀的效率高。沉淀的效率高。以以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分的证实，上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分的证实，其解释主要有：认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生其解释主要有：认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用；由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子共沉淀作用；由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀；聚合物与生物大分子之间以氢键相互作脱水而发生沉淀；聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成