微生物学：第七章 微生物的遗传变异和育种

1、第七章第七章 微生物的遗传变异和育种微生物的遗传变异和育种1、遗传：指上一代生物如何将自身的一整套遗传基、遗传：指上一代生物如何将自身的一整套遗传基因稳定地传递给下一代的行为或功能。因稳定地传递给下一代的行为或功能。2、遗传型：即基因型，指某一生物个体所含有的全、遗传型：即基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。3、表型：指某一生物体所具有的一切外表特征和内、表型：指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境条件下通过在特性的总和，是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。代谢和发育而得到

2、的具体体现。4、变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引、变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。5、饰变：指外表的修饰性改变，即一种不涉及遗传、饰变：指外表的修饰性改变，即一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型转录、转译水平上的表型变化。变化。 微生物的遗传和变异的特点：微生物的遗传和变异的特点：、微生物的代谢作用旺盛，有极高的繁殖速度；生活史、微生物的代谢作用旺盛，有极高的繁殖速度；生活史周转快；环境因素可在短期内重复影响其生长和繁殖，易周转快；环境因素

3、可在短期内重复影响其生长和繁殖，易发生变异，又能迅速产生大量后代，有利于自然选择和人发生变异，又能迅速产生大量后代，有利于自然选择和人工选择。工选择。、微生物细胞体积小，面积大，与外界环境能直接接触。、微生物细胞体积小，面积大，与外界环境能直接接触。当环境条件变化剧烈时，大多数个体易死亡而淘汰，个别当环境条件变化剧烈时，大多数个体易死亡而淘汰，个别细胞则发生变异而适应新环境。细胞则发生变异而适应新环境。、大多数微生物均进行无性繁殖，而且营养体多为单倍、大多数微生物均进行无性繁殖，而且营养体多为单倍体，因而便于建立纯系及长期保存大量品系。如果一旦发体，因而便于建立纯系及长期保存大量品系。如果一旦

4、发生变异，也能够迅速在性状上反映出来。生变异，也能够迅速在性状上反映出来。第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种 第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种第四节第四节 基因工程基因工程第五节第五节 菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退、复壮和保藏第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础一、证明遗传物质基础的三个经典实验一、证明遗传物质基础的三个经典实验 1 1、经典转化实验、经典转化实验研究对象：肺炎链球菌研究对象：肺炎链球菌S S型和型和R R型。型。动物实验动物实验 细菌培养试验细菌培养试验 S S型菌的无细胞抽

5、提液试验型菌的无细胞抽提液试验 长出大量长出大量R R菌和少量菌和少量S S菌菌离体转化实验离体转化实验1)1)从活的从活的S S菌中抽提各种细胞成分（菌中抽提各种细胞成分（DNA,DNA,蛋白质，荚蛋白质，荚膜多糖等）；膜多糖等）；2)2)对各组分进行转化实验：对各组分进行转化实验：2、噬菌体感染实验、噬菌体感染实验研究对象：噬菌体研究对象：噬菌体过程：过程： 3、植物病毒的重建实验、植物病毒的重建实验研究对象：研究对象：TMV AND HRV 过程：过程： （一）核酸存在的七个水平（一）核酸存在的七个水平细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细胞水平：存在于细胞核或核质体，单核或多核细

6、胞核水平细胞核水平: 原核与真核生物的细胞核结构不同，核外原核与真核生物的细胞核结构不同，核外DNA染色体水平染色体水平: 倍性倍性(真核真核)和染色体数和染色体数核酸水平：核酸水平：DNA或或RNA，复合或裸露，双链或单链，复合或裸露，双链或单链基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，基因水平：具自主复制能力的遗传功能单位，长度与信息量，转录转录翻译翻译密码子水平：信息单位，起始和终止密码子水平：信息单位，起始和终止,核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基核苷酸水平：突变或交换单位，四种碱基二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式（二）原核生物（二

7、）原核生物的质粒的质粒定义：定义：是一类小型闭合环状核外双螺旋是一类小型闭合环状核外双螺旋DNADNA分子，能独立于细胞核进分子，能独立于细胞核进行自主复制，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。行自主复制，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。性质：性质：可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，通过交换掺入染色体上，以附加体的形式存在；以附加体的形式存在；质粒是一质粒是一种复制子种复制子，根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的，根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，控

8、制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒严紧型质粒的复制受细胞核的复制受细胞核控制，与染色体控制，与染色体DNADNA复制相伴随复制相伴随, ,一般一个寄主细胞内只有少数几一般一个寄主细胞内只有少数几个拷贝；个拷贝；松弛型质粒松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体的复制不受细胞核控制，在染色体DNADNA复制停复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10-20010-200个个或更多。或更多。可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有胞转移到另一

9、个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。成为基因工程的载体。功能多样化功能多样化功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生功能：进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。重组：在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。存在范围：很多细菌存在范围：很多细菌制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与

10、染色体和制备：包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除蛋白质等成分、去除RNARNA和蛋白质等步骤。和蛋白质等步骤。鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶鉴定：电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法切图谱等方法典型质粒简介典型质粒简介 1)F因子 (fertility factor)：又称致育因子或性因子。功能：决定细菌的性别，同时还具有转移能力。 tra转移区：与质粒转移和性菌毛合成有关。转座因子：可整合到宿主染色体的一定部位，导致基因重组。2)R因子因子(resistance factor)：又称又称R质粒质粒 结构：结构：由两个相连的DNA片段组成RTF

11、和r决定因子。 RTF功能：RTF即抗性转移因子。含调节DNA复制和拷贝数的基因以及转移基因，具有转移功能。r决定因子功能：r决定因子即抗性决定因子。无转移功能，含各种抗性因子。作用：作用： 引起致病菌对多种抗生素的抗性，对传染病的防治造成危害；R质粒可用做菌株筛选时的选择性标记或改造成外源基因的克隆载体。 3)Col因子因子(colicinogenic factors): 即产大肠杆菌素因子。即产大肠杆菌素因子。4)Ti质粒质粒(tumor inducing plasmid)： 即诱癌质粒。是植物遗传工程的主要载体。即诱癌质粒。是植物遗传工程的主要载体。5)巨大质粒巨大质粒(mega 质粒质

12、粒)： 发现于根瘤菌属中，上面有一系列固氮基因。发现于根瘤菌属中，上面有一系列固氮基因。 第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种一、基因突变 简称突变，指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。（一）类型1、根据表型划分 选择性突变选择性突变具有选择性标记，可通过某种环境条件使它们得到优势生长，从而取代原始菌株。非选择性突变非选择性突变无选择性标记，而只有一些性状的数量差别，如菌落大小、颜色深浅、代谢物产量等。(1) (1) 营养缺陷型：营养缺陷型：某一野生型菌株由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异

13、类型，称为营养缺陷型。它们可在加有某生长因子的基本培养基平板上选出。(2) (2) 抗性突变型：抗性突变型：由于基因突变而使原始菌株产生了对某种化学药物或致死物理因子抗性的变异类型。它们可在加有相应药物或用相应物理因子处理的培养基平板上选出。 (3) (3) 条件致死突变型：条件致死突变型：某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并实现其表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖的突变类型，称为条件致死突变型。TsTs突变株突变株( (温度敏感突变株温度敏感突变株) )：是一类典型的条件致死突变株，指可在某一温度下生长而在另一温度下不生长的突变株。(4) (4) 形态突变型：形态突

14、变型：指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生改变。(5) (5) 抗原突变型：抗原突变型： 指由于基因突变而引起的抗原结构发生突变的变异类型 。(6) (6) 产量突变型：产量突变型：通过基因突变而获得的在有用代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株，称为产量突变型。若产量高于原始菌株者，称为正变株，反之则称负变株。 （二）突变率（二）突变率1、概念：指某一个细胞（或病毒粒）每一个世代中发生、概念：指某一个细胞（或病毒粒）每一个世代中发生某一性状突变的概率。也是突变在每个细胞生存的单位生某一性状突变的概率。也是突变在每个细胞生存的单位生物学时间（世代）内发生的概率。物学时间（世代）内发生的概率

15、。 2、测定：、测定： 应用选择培养法来直接测定突变率应用选择培养法来直接测定突变率 。（三）基因突变的特点（三）基因突变的特点1、自发性：各种性状的突变，可以在没有人为的诱变因素处理下自发地产生。2、不对应性：指突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。3、稀有性：自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低和稳定的。4、独立性：突变的发生一般是独立的，某一基因的突变率不受它种基因突变率的影响。5、可诱变性：自发突变的频率可因诱变剂的影响而大为提高。6、稳定性：基因突变后的新性状是稳定的。7、可逆性：由原始的野生型基因变异为突变型基因的过程，称为正向突变，相反的过程则称为回复突变或回变。任何

16、性状都可发生正向突变，也都可发生回复突变。 （四）基因突变的自发性和不对应性的证明（四）基因突变的自发性和不对应性的证明 突变是通过适应而产突变是通过适应而产生的，突变的原因与生的，突变的原因与性状间是相对应的。性状间是相对应的。 突变是自发的，突变是自发的，与环境是不相与环境是不相对应的。对应的。 PK1、变量实验、变量实验（1）实验内容：）实验内容： E.coli对于对于phageT1的抗性变异波动实验。的抗性变异波动实验。（2）原理：）原理： 通过小试管中抗性细菌数的波动情况证明细菌抗通过小试管中抗性细菌数的波动情况证明细菌抗性的来历。如果抗药性的出现是由于细菌对于药物所性的来历。如果抗

17、药性的出现是由于细菌对于药物所发生的适应性的反应，那么分装在许多小试管中的样发生的适应性的反应，那么分装在许多小试管中的样品将出现大致相等数目的细菌；如果抗药性的出现是品将出现大致相等数目的细菌；如果抗药性的出现是由于基因突变，由于突变在时间上的随机性，不同试由于基因突变，由于突变在时间上的随机性，不同试管中的抗性细菌数将会表现高度波动。管中的抗性细菌数将会表现高度波动。 （3）结果：）结果： 从来自同一个培养物的大试管取样测定的抗性菌落数从来自同一个培养物的大试管取样测定的抗性菌落数比较接近，而来自不同培养物比较接近，而来自不同培养物(20支小试管支小试管)的样品的抗性的样品的抗性菌落数的数

18、值却相差很大。菌落数的数值却相差很大。（4）结论：）结论： E.coli抗噬菌体性状的突变，不是由环境因素抗噬菌体性状的突变，不是由环境因素噬噬菌体诱导出来的，而是在它接触到噬菌体前，在某一次细菌体诱导出来的，而是在它接触到噬菌体前，在某一次细胞分裂过程中随机地自发产生的。这种自发突变发生得越胞分裂过程中随机地自发产生的。这种自发突变发生得越早，则抗性菌落出现得越多，反之则越少。噬菌体在这里早，则抗性菌落出现得越多，反之则越少。噬菌体在这里仅起着淘汰原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型仅起着淘汰原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用。的作用。 2、涂布实验、涂布实验（1）实验内容：

19、）实验内容：（2）实验原理：）实验原理： 若抗性是在接触噬菌体以后产生的，那么喷噬菌体以若抗性是在接触噬菌体以后产生的，那么喷噬菌体以前的重新涂布无非使细菌所处的位置发生改变，而不会因前的重新涂布无非使细菌所处的位置发生改变，而不会因为涂布大大地改变细菌对于噬菌体的反应，因此两组培养为涂布大大地改变细菌对于噬菌体的反应，因此两组培养皿上出现的抗性菌落数应相等；若抗性发生在接触噬菌体皿上出现的抗性菌落数应相等；若抗性发生在接触噬菌体以前，那么在喷上噬菌体以前某些菌落中的抗性突变型细以前，那么在喷上噬菌体以前某些菌落中的抗性突变型细菌已经分裂若干次，在不经重新涂布的培养皿上形成一个菌已经分裂若干次

20、，在不经重新涂布的培养皿上形成一个菌落，在重新涂布的培养皿上出现若干菌落。菌落，在重新涂布的培养皿上出现若干菌落。（3）结果：重新涂布的培养皿上出现的抗性菌落多于未）结果：重新涂布的培养皿上出现的抗性菌落多于未经重新涂布的。经重新涂布的。（4）结论：抗性突变的发生在接触噬菌体之前。）结论：抗性突变的发生在接触噬菌体之前。 3 3、影印培养实验、影印培养实验（1 1）实验内容：）实验内容：（2）实验原理：）实验原理： 通过盖印章的方式，在未接触抗性因素的条件下筛选通过盖印章的方式，在未接触抗性因素的条件下筛选出的抗性突变株。由于实验过程中没有接触过抗性因素，出的抗性突变株。由于实验过程中没有接触

21、过抗性因素，所以直接证明了基因突变的自发性。所以直接证明了基因突变的自发性。（3）结果：得到越来越多的抗性菌落，最终甚至可以得）结果：得到越来越多的抗性菌落，最终甚至可以得到纯的抗性菌株细胞群。到纯的抗性菌株细胞群。（4）结论：基因突变的自发性。）结论：基因突变的自发性。 （五）突变机制（五）突变机制1、诱发突变的机制、诱发突变的机制（1）点突变：即狭义的基因突变，指）点突变：即狭义的基因突变，指DNA的单个碱基发生替的单个碱基发生替换所引起的突变。换所引起的突变。1）碱基置换：一对碱基被另一对碱基所置换。）碱基置换：一对碱基被另一对碱基所置换。转换：即转换：即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤

22、或是一个嘧啶被链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换另一个嘧啶所置换颠换：即颠换：即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被链中的一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。另一个嘌呤所置换。 2) 移码突变：移码突变： 指指DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添分子中的一个或少数几个核苷酸的增添(插入插入)或缺或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株。一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株。a. 由于在由于在DNA分子的编码区

23、插入或缺失非分子的编码区插入或缺失非3的整数倍个的整数倍个(1个、个、2个或个或4个个)核苷酸而导致阅读框架位移，导致翻译出来的蛋白质核苷酸而导致阅读框架位移，导致翻译出来的蛋白质的氨基酸序列与野生型完全不同。的氨基酸序列与野生型完全不同。 b. 如果插入或缺失的碱基正好是如果插入或缺失的碱基正好是3个或其整倍数，那么在翻译个或其整倍数，那么在翻译出的多肽上可能是多一个、几个或少一个、几个氨基酸，而不出的多肽上可能是多一个、几个或少一个、几个氨基酸，而不完全打乱整个氨基酸序列。完全打乱整个氨基酸序列。 （2）染色体畸变）染色体畸变 指染色体的结构和数目的改变。是指染色体的结构和数目的改变。是D

24、NA分子大范围的分子大范围的损伤。损伤。1）染色体结构变异）染色体结构变异缺失缺失 指染色体丢失了一个片段，使之位于这个片段上的基指染色体丢失了一个片段，使之位于这个片段上的基因也随之丢失。因也随之丢失。重复：重复： 一个染色体上某一片段出现两份或两份以上，使位于一个染色体上某一片段出现两份或两份以上，使位于这些片段上的基因多了一份或几份。这些片段上的基因多了一份或几份。 缺失和重复都起因于染色体上基因数目的变化。缺失和重复都起因于染色体上基因数目的变化。倒位倒位 在同一染色体上某一个片段作在同一染色体上某一个片段作180的颠倒，造成染色的颠倒，造成染色体上基因顺序的重排。如果颠倒的片段包括着

25、丝粒在内的体上基因顺序的重排。如果颠倒的片段包括着丝粒在内的倒位称为臂间倒位，不包括着丝粒的倒位称为臂内倒位。倒位称为臂间倒位，不包括着丝粒的倒位称为臂内倒位。易位易位 一个染色体臂的一段移接到另一非同源染色体的臂上一个染色体臂的一段移接到另一非同源染色体的臂上的结构变异。的结构变异。 最常见的是相互易位，非同源染色体间相互交换染色最常见的是相互易位，非同源染色体间相互交换染色体片段，造成染色体间基因的重排。体片段，造成染色体间基因的重排。 倒位和易位都起因于染色体上基因排列位置的变化。倒位和易位都起因于染色体上基因排列位置的变化。 2 2 自发突变：无人为因素下的低频率（约自发突变：无人为因

26、素下的低频率（约10109 9 10106 6）（1 1）背景辐射）背景辐射 （2 2）有害产物积累）有害产物积累 （3 3）碱基错配）碱基错配: :其中其中（六）紫外线对（六）紫外线对DNA的损伤及机体对损伤的损伤及机体对损伤DNA的修复的修复紫外线作用：同链紫外线作用：同链DNA的相邻的相邻T间形成共价间形成共价T二聚体，阻二聚体，阻碍碱基间正常配对，从而引起突变或死亡。碍碱基间正常配对，从而引起突变或死亡。 (1) 光复活光复活(2) 切除修复切除修复(3) 重组修复重组修复(4) SOS修复修复 （1）光复活作用把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称

27、为光复活作用。光复活机理：经紫外线照射所形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗中与光激活酶（photoreactivating enzyme）结合，形成的复合物暴露在可见光（300-500nm）下时，此酶会因获得光能而发生解离，从而使二聚体重新分解成单体。由于在一般的微生物中都存在着光复活作用，所以在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射及处理照射后的菌液。（2） 暗修复作用暗修复作用又称切除修复（excision repair），是细胞内的主要修复系统，用于修复被诱变剂（包括紫外线、烷化剂、X射线和射线等）损伤后的DNA的机制。全部修复过程由四种酶完成，即内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体

28、的5一侧切开一个3- OH和5-P的单链缺口；外切核酸酶从5-P至3-OH方向切除二聚体，并扩大 缺口；DNA聚合酶修补缺口连接酶连接裂口1、由核酸内切酶切开二聚体、由核酸内切酶切开二聚体的的5末端，形成末端，形成3-OH和和5-P的单链缺口的单链缺口2、核酸外切酶从、核酸外切酶从5-P到到3-OH方向切除二聚体，并扩大方向切除二聚体，并扩大缺口。缺口。3、DNA聚合酶以另一条互补聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的链为模板，从原有链上暴露的3-OH端起合成缺失片段。端起合成缺失片段。4、连接酶将新合成的、连接酶将新合成的3-OH与原有的与原有的5-P相连接。相连接。二、突变与育种二、

29、突变与育种菌种工作包括三方面：选种、育种、复壮和保藏。菌种工作包括三方面：选种、育种、复壮和保藏。选种选种从自然界和生产中选择符合需要菌种。从自然界和生产中选择符合需要菌种。育种育种进一步提高已有菌种某种性能，使更符合要求。进一步提高已有菌种某种性能，使更符合要求。 选育新菌种可从几方面着手：选育新菌种可从几方面着手：1）从原有菌株入手进行各种遗传改造工作。）从原有菌株入手进行各种遗传改造工作。2）根据文献资料报导的微生物种属，向国内外菌种保）根据文献资料报导的微生物种属，向国内外菌种保藏机构索取同种或同属菌株，从中寻求符合要求者。藏机构索取同种或同属菌株，从中寻求符合要求者。3）根据所需菌种

30、特性、嗜好或工艺要求，从特定的生）根据所需菌种特性、嗜好或工艺要求，从特定的生态环境中以特定方法重新分离自然菌株。态环境中以特定方法重新分离自然菌株。（一）自发突变与育种（一）自发突变与育种1、生产育种、生产育种 在利用微生物进行大生产的过程中由于微生物会以在利用微生物进行大生产的过程中由于微生物会以10-6左左右的突变率进行自发突变，从而分离出生产性状优于原菌株右的突变率进行自发突变，从而分离出生产性状优于原菌株的优良菌株。的优良菌株。 2、定向育种、定向育种 用某一特定环境长期处理某一微生物群体，同时不断地用某一特定环境长期处理某一微生物群体，同时不断地进行移种传代，以达到积累和选择合适的

31、自发突变体的一种进行移种传代，以达到积累和选择合适的自发突变体的一种古老育种方法。古老育种方法。 （二）诱变育种（二）诱变育种 利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后设法采用简便、快速、高效促进其突变率大幅度提高，然后设法采用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选少数符合目的的突变株，以供生产科的筛选方法，从中挑选少数符合目的的突变株，以供生产科研之用。研之用。 基本步骤：基本步骤：原种原种 （出发菌株）（出发菌株） 纯化纯化斜面斜面同步培养同步培养离心洗涤离心洗涤振荡打散振荡打散过滤过滤菌悬液菌悬液诱变处理诱

32、变处理 平板分离平板分离 斜面斜面 （活菌计数）（活菌计数） （计数）（计数） （变异率）（变异率） 斜面斜面 斜面斜面 保藏及扩大试验保藏及扩大试验（初筛）（初筛） （复筛）（复筛） （再复筛）（再复筛） 诱变育种基本步骤诱变育种基本步骤1、出发菌株的选择、出发菌株的选择(1) 对出发菌株的要求对出发菌株的要求 生长快，营养要求粗放，发育早，产孢子多，对诱变生长快，营养要求粗放，发育早，产孢子多，对诱变剂敏感性高，已能积累少量产品或前体物的菌株。剂敏感性高，已能积累少量产品或前体物的菌株。(2) 出发菌株的选择出发菌株的选择1) 选取自然界新分离的野生型菌株，它们对诱变因素敏感，选取自然界新

33、分离的野生型菌株，它们对诱变因素敏感，容易发生变异；容易发生变异；2) 选取生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选取生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选得到的菌株，与野生型菌株较相象，容易达到较好的诱选得到的菌株，与野生型菌株较相象，容易达到较好的诱变效果；变效果；3) 选取每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变选取每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变可能效果迭加，积累更多的提高。可能效果迭加，积累更多的提高。 2、出发菌株的纯化、出发菌株的纯化(1) 目的：获得遗传性状基本一致的，并且稳定的变种。目的：获得遗传性状基本一致的，并且稳定的变种。(2) 原因：遗传

34、背景复杂的菌种诱变后负变率将增加；诱原因：遗传背景复杂的菌种诱变后负变率将增加；诱变史长的菌株，采用强烈诱变剂处理，又不进行纯化分离，变史长的菌株，采用强烈诱变剂处理，又不进行纯化分离，诱变效果差。诱变效果差。 (3) 纯种分离方法：常用划线分离法和稀释分离法。纯种分离方法：常用划线分离法和稀释分离法。 3、同步培养（前培养）、同步培养（前培养）(1)目的：获得生理状态一致的培养物。目的：获得生理状态一致的培养物。(2) 原因：突变率高，重现性也好。原因：突变率高，重现性也好。(3) 方法：方法：1) 细菌一般要求培养至对数生长期；细菌一般要求培养至对数生长期； 2) 霉菌处理使用分生孢子，应

35、该将分生孢子在液体培养基霉菌处理使用分生孢子，应该将分生孢子在液体培养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，并恰好未形成中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，并恰好未形成菌丝体。菌丝体。 4 4、单细胞、单细胞( (或单孢子或单孢子) )悬液的制备悬液的制备(1) (1) 目的：获得单细胞目的：获得单细胞( (或单孢子或单孢子) ) 、均匀的悬液。、均匀的悬液。(2) (2) 原因：一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，还可减少原因：一方面分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，还可减少分离现象发生。另一方面又可避免长出不纯菌落。分离现象发生。另一方面又可避免长出不纯菌落。(3) (3)

36、 方法：方法：1) 1) 菌龄：对数期细胞、刚成熟的孢子或活化的孢子菌龄：对数期细胞、刚成熟的孢子或活化的孢子 。2) 2) 菌悬液浓度：一般真菌孢子或酵母菌细胞悬浮液的浓度为菌悬液浓度：一般真菌孢子或酵母菌细胞悬浮液的浓度为10106 6个个/ /mLmL、放线菌或细菌的浓度为放线菌或细菌的浓度为10108 8个个mLmL左右。左右。 3) 3) 菌悬液的配制方法：菌悬液的配制方法： 离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬液，放离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡1010minmin，令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸令其

37、分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。过滤。通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。 5、诱变处理、诱变处理 (1) 诱变剂种类的选择诱变剂种类的选择 常用诱变剂有两大类：物理诱变剂和化学诱变剂。常用诱变剂有两大类：物理诱变剂和化学诱变剂。 常用的物理诱变剂：常用的物理诱变剂： 紫外线、紫外线、x射线、射线、射线射线(如如Co60等等)、等离子、快中子、等离子、快中子、射线、射线、射线、超声波等。射线、超声波等。常用的化学诱变剂：常用的化学诱变剂： 碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等。碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等。 (2) 最适诱变剂量的选

38、择最适诱变剂量的选择1) 诱变剂剂量的表示方式诱变剂剂量的表示方式a.UV的剂量指强度与作用时间的乘积。的剂量指强度与作用时间的乘积。b.化学诱变剂常以在一定外界条件下诱变剂的浓度和作用化学诱变剂常以在一定外界条件下诱变剂的浓度和作用时间的乘积来表示。时间的乘积来表示。c.在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂的相对剂量。在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂的相对剂量。 2) 最适诱变剂量的确定最适诱变剂量的确定a.确定依据确定依据 诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活群体中占有诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大的比例。最大的比例。 b. 确定方法确定方法 通过比

39、较剂量通过比较剂量存活率曲线和剂量存活率曲线和剂量诱变率曲线，找到某诱变剂诱变率曲线，找到某诱变剂的剂量的剂量存活率存活率诱变率三者的最佳结合点，即为诱变剂的最适剂量。诱变率三者的最佳结合点，即为诱变剂的最适剂量。 剂量剂量存活率曲线存活率曲线 以诱变剂的剂量为横坐标，以细胞存活率的对数值为纵坐标绘制以诱变剂的剂量为横坐标，以细胞存活率的对数值为纵坐标绘制的曲线。的曲线。 剂量剂量诱变率曲线诱变率曲线 以诱变剂的剂量为横坐标，以诱变后获得的突变细胞数为纵坐标以诱变剂的剂量为横坐标，以诱变后获得的突变细胞数为纵坐标绘制的曲线。绘制的曲线。 c.紫外诱变的方法紫外诱变的方法紫外灯应先预热紫外灯应先

40、预热2030min 将将10m1菌悬液放在直径为菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为的培养皿中，液层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器，使用启动磁力搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离功率紫外灯管，照射距离为为30cm左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理株需处理10min左右。左右。设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。当的照射剂量。 实验中避

41、免光复活现象：实验中避免光复活现象： 实验时，为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红实验时，为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。养，然后再进行分离筛选。 (3)诱变剂的处理方式诱变剂的处理方式1) 单因子处理单因子处理 采用单一诱变剂处理出发菌株。采用单一诱变剂处理出发菌株。 2) 复合因子处理复合因子处理 指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。 两种或多种诱变剂先后使用。两种或多种诱变剂先后使用。 同一种诱变剂的重复使用。同一

42、种诱变剂的重复使用。 两种或多种诱变剂的同时使用。两种或多种诱变剂的同时使用。 (4)诱变剂的处理方法诱变剂的处理方法 1) 直接处理方法直接处理方法 将菌悬液用物理、化学因子处理，然后涂平板分离突变株。将菌悬液用物理、化学因子处理，然后涂平板分离突变株。 2) 生长过程处理生长过程处理 适用于诱变作用强的而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过适用于诱变作用强的而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过程中只对程中只对DNA起作用的诱变剂，如起作用的诱变剂，如NTG、LiCl、秋水仙碱等。秋水仙碱等。 将诱变剂加入培养基涂平板。将诱变剂加入培养基涂平板。 先把培养基制成平板，将一定浓度的诱变剂和菌体加入平板。

43、先把培养基制成平板，将一定浓度的诱变剂和菌体加入平板。 摇瓶振荡培养处理摇瓶振荡培养处理Ames实验实验 利用细菌营养缺陷型的回复突变检出环境或食品中是利用细菌营养缺陷型的回复突变检出环境或食品中是否存在化学致癌剂的一种简便有效方法。否存在化学致癌剂的一种简便有效方法。1、诱变的生物化学统一性、诱变的生物化学统一性 任何能改变核酸结构的因素，都可引起核酸生物学功任何能改变核酸结构的因素，都可引起核酸生物学功能的改变能的改变 2、筛选简单模型研究高等生物的突变（癌症）、筛选简单模型研究高等生物的突变（癌症）(1) 化学物质对核酸结构的改变和对生物的三致作用化学物质对核酸结构的改变和对生物的三致作

44、用(2) 致突变因素，一般都有致突致癌致畸效应（三致作致突变因素，一般都有致突致癌致畸效应（三致作用），反之亦然用），反之亦然(3) 对原核生物有效的因素，则对非细胞生物和真核生物对原核生物有效的因素，则对非细胞生物和真核生物也有效也有效(4) 能引起易鉴出的选择性突变的因素，也能引起难以检能引起易鉴出的选择性突变的因素，也能引起难以检出的非选择性突变出的非选择性突变(5) 凡能引起负变的因素，也可引起正变凡能引起负变的因素，也可引起正变(6) 凡能引起回复突变的因素，一般也能引起正向突变凡能引起回复突变的因素，一般也能引起正向突变3、Ames实验原理：实验原理： 根据诱变剂的共性原则，即：化

45、学试剂对细菌的诱变率根据诱变剂的共性原则，即：化学试剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比，利用细菌营养缺陷型的回复突与其对动物的致癌性成正比，利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测食品或环境中是否存在致癌剂。鼠伤寒沙门氏菌的变来检测食品或环境中是否存在致癌剂。鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸缺陷型组氨酸缺陷型(his-)菌株在基本培养基菌株在基本培养基-的平板上不能生长，的平板上不能生长，如发生回复突变则能生长。如发生回复突变则能生长。4、方法、方法第三节第三节 基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种 基因重组：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到起，基因重组：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到起，

46、经过经过遗传遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组或遗传重组。为基因重组或遗传重组。 杂交：两个性状不同的菌株或变种之间进行细胞结合，遗传杂交：两个性状不同的菌株或变种之间进行细胞结合，遗传物质交换重新组合成新的性状。物质交换重新组合成新的性状。 一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组特点：（特点：（1 1）片段性）片段性 （2 2）单向性）单向性 （3 3）转移机制独特而多样）转移机制独特而多样 （一）转化（一）转化1 1、定义、定义 受体菌直接吸收了来自供体菌的受体菌直接吸收了来自供体菌的DNADNA片段，通过交片段，通

47、过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得供体菌部换，把它组合到自己的基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象。转化后的受体菌，称转化子，供分遗传性状的现象。转化后的受体菌，称转化子，供体菌的体菌的DNADNA片段称为转化因子。片段称为转化因子。 2 2、感受态、感受态（1 1）定义）定义 感受态即受体菌最易接收外源感受态即受体菌最易接收外源DNADNA片段并实现片段并实现转化的生理状态。转化的生理状态。（2 2）特点）特点1 1）表示细胞具有摄取外源）表示细胞具有摄取外源DNADNA的能力；的能力；2 2）自然转化的感受态细胞受）自然转化的感受态细胞受感受态因子感受态因子调节调节； 是调节

48、感受态的一类特异蛋白，它可以催化外来是调节感受态的一类特异蛋白，它可以催化外来DNADNA片段片段的吸收或降解细胞表面某种成分，让细胞表面的的吸收或降解细胞表面某种成分，让细胞表面的DNADNA受体显露受体显露出来。它包括三种主要成分：与膜相关的出来。它包括三种主要成分：与膜相关的DNADNA结合蛋白、细胞结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。壁自溶素和几种核酸酶。 3)3)是细胞群体在某个生长阶段的一种特性，大多与生是细胞群体在某个生长阶段的一种特性，大多与生长周期有关长周期有关 。4)4)是反映细胞个体之间遗传信息交流的一种程度。是反映细胞个体之间遗传信息交流的一种程度。 3 3、转化机制、

49、转化机制（1 1）转化发生的条件）转化发生的条件1) 1) 受体细胞处于感受态。受体细胞处于感受态。2) 2) 受体细胞吸附的转化因子，必须是双链的受体细胞吸附的转化因子，必须是双链的DNADNA，且且DNADNA分子的相对分子质量不小于分子的相对分子质量不小于3 310105 5 。 转化不需两个细胞直接接触转化不需两个细胞直接接触（2 2）转化的过程）转化的过程1)1)感受态的出现感受态的出现 2)2)DNADNA的结合与进入的结合与进入G G+ +G G- -3) 3) DNADNA的整合（重组）的整合（重组） 进入细胞的外源进入细胞的外源DNADNA通过同源重组以置通过同源重组以置换的

50、方式整合进受体换的方式整合进受体染色体染色体DNADNA，经复制和经复制和细胞分裂后形成重组细胞分裂后形成重组体。体。 （3 3）影响转化效率的因素：）影响转化效率的因素：1) 1) 受体细胞的感受态受体细胞的感受态决定转化因子能否被吸收决定转化因子能否被吸收进入受体细胞；进入受体细胞；2) 2) 受体细胞的限制酶系统和其他核酸酶受体细胞的限制酶系统和其他核酸酶决定转决定转化因子在整合前是否被分解；化因子在整合前是否被分解；3) 3) 受体和供体染色体的同源性受体和供体染色体的同源性决定转化因子的决定转化因子的整合。整合。 4 4、转染、转染(1)(1)定义：把噬菌体或其他病毒定义：把噬菌体或

51、其他病毒DNADNA（RNARNA）提取出来，提取出来，用它去感染感受态的宿主细胞，并产生正常噬菌体或用它去感染感受态的宿主细胞，并产生正常噬菌体或病毒后代。病毒后代。(2)(2)转染和转化：作为转染的病毒核酸，并不是作为供转染和转化：作为转染的病毒核酸，并不是作为供体基因的功能，被感染的宿主也决不是能形成转化子体基因的功能，被感染的宿主也决不是能形成转化子的受体菌。的受体菌。（二）转导（二）转导1、定义：、定义： 通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性

52、状的现象，称为转导。后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。由转导作用而获得部分新性状的重组细胞，称为由转导作用而获得部分新性状的重组细胞，称为转导子。转导子。 2、转导过程（种类）、转导过程（种类）(1) 普遍转导普遍转导1）定义：通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组）定义：通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段上任何小片段DNA进行进行“误包误包”，而将其遗传性状传，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称为普遍转导。递给受体菌的现象，称为普遍转导。 2 2）普遍转导中外源）普遍转导中外源DNADNA的三种后果的三种后果进入受体的外源进入受体的外源DNADNA通过与细胞染色体的

53、重组交换而通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子形成稳定的转导子完全普遍转导。完全普遍转导。 流产转导流产转导 外源外源DNADNA被降解，转导失败，在选择平板上无菌落被降解，转导失败，在选择平板上无菌落形成形成 进入受体的外源进入受体的外源DNADNA通过与细胞染色体的重组交通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子换而形成稳定的转导子完全普遍转导。完全普遍转导。a. a. 定义：定义： 经转导而获得了供体菌经转导而获得了供体菌DNADNA片段的受体菌，导片段的受体菌，导入的外源入的外源DNADNA若与受体细胞核染色体组上的同源区若与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，再经过双交换而

54、整合到染色体组上，从而段配对，再经过双交换而整合到染色体组上，从而使后者成为一个遗传性状稳定的重组体的现象称为使后者成为一个遗传性状稳定的重组体的现象称为完全普遍转导。形成的转导子称为普遍转导子。完全普遍转导。形成的转导子称为普遍转导子。 流产转导流产转导 a. 定义：定义： 经转导而获得了供体菌经转导而获得了供体菌DNA片段的受体菌，如果片段的受体菌，如果外源外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，也不在其内既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。象就称流产转导。 b. 过程过程 (2) 局限

55、转导局限转导1）定义：指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定）定义：指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。导子的现象。2）特点）特点 只能转导供体菌的个别特定基因；只能转导供体菌的个别特定基因； 该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带；该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带； 缺陷噬菌体是由于其在形成过程中所发生的低频率缺陷噬菌体是由于其在形成过程中所发生的低频率 “误误切切”，或由于双重溶源菌的裂解而形成；，或由于双重溶源菌的裂解而形成；局限转导噬菌体的产生要通过局限转导噬

56、菌体的产生要通过UV等因素对溶源菌的诱导并等因素对溶源菌的诱导并引起裂解后才产生。引起裂解后才产生。 3 3）局限转导类型：）局限转导类型：a.a. 低频转导：低频转导： 指通过一般溶源菌释放的噬菌体所进行的转导，指通过一般溶源菌释放的噬菌体所进行的转导，因其只能形成极少数（因其只能形成极少数（1010-4-4-10-10-6-6）转导子，故称低）转导子，故称低频转导。频转导。b.b. 高频转导：高频转导： 指通过双重溶源菌所产生的裂解物所进行的转指通过双重溶源菌所产生的裂解物所进行的转导，因其含有等量的正常噬菌体和缺陷噬菌体，导，因其含有等量的正常噬菌体和缺陷噬菌体，具有高频率的转导功能，故

57、称高频转导。具有高频率的转导功能，故称高频转导。（3 3）局限性转导与普遍性转导的主要区别：）局限性转导与普遍性转导的主要区别：1 1）局限性转导中，被转导的基因共价地与噬菌体）局限性转导中，被转导的基因共价地与噬菌体DNADNA连接，与噬菌体连接，与噬菌体DNADNA一起进行复制、包装以及被一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而完全转导包装的可能全部是宿导入受体细胞中。而完全转导包装的可能全部是宿主菌的基因；主菌的基因； 2 2）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。定的个别基因导入受体，故称为局限性转导

58、。3、转导和溶源转变、转导和溶源转变（1）溶源转变：当正常的温和噬菌体感染其宿主而）溶源转变：当正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。状的现象，称为溶源转变。（2）溶源转变与转导有着本质的不同。）溶源转变与转导有着本质的不同。首先，这种温和噬菌体并不携带任何来自供体菌的首先，这种温和噬菌体并不携带任何来自供体菌的外源基因，使宿主带来新性状的正是噬菌体本身的外源基因，使宿主带来新性状的正是噬菌体本身的基因；基

59、因；其次，这种温和噬菌体是完整的，而不是缺陷的；其次，这种温和噬菌体是完整的，而不是缺陷的；第三，获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是第三，获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是什么转导子；什么转导子；第四，获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失。第四，获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失。 1946年，Joshua Lederberg等认为细菌的转化有些与高等动物、植物的接合相类似。因此他们设计了一个实验来观察细菌是否存在接合现象。 中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。 1） F+F-杂交理化因子的处理可将理化因子的处理可将F F因子消除而使因子消除而使F F+

60、+菌株变成菌株变成F F- -菌株菌株Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此高频重组菌株。2 2）HfrHfr F F- -Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细胞转移。F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中。HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。大肠杆菌基因组很大（），其遗传图谱须用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成3 3）