微生物工程重点整理

1、微生物工程复习资料微生物工程复习资料第一章 绪论1、 微生物工程：利用微生物的特定性状和功能，通过现代化工程技术生产有用物质或把微生物直接作为生物反应器的技术体系；是将传统发酵与现代DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的现代发酵技术。2、 微生物工程的特点：优点（与化学工程相比）：1、生产过程通常在常温常压下进行，操作条件温和，不需考虑防爆问题。2、原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，没有精制的必要。3、生产过程是以生命体的自动调节方式进行的，因此多个反应就象一个反应一样，可在单一设备（发酵罐）中进行。4、能容易地生产复杂的高分子化合物，如酶、光学活性体等。5、能高度选择

2、性地进行复杂化合物在特定部位反应，如氧化、还原、官能团导入等。6、生产产品的生物体本身也是发酵产物，富含维生素、蛋白质、酶等有用物质；除特殊情况外，培养液一般不会对人和动物造成危害。7、通过微生物菌种改良，能够利用原有设备使生产飞跃上升。例如青霉素的生产。面临的挑战：1、化学合成工业的竞争；2、农业生物工程的冲击。3、 发酵工业对微生物菌种的要求：1、能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并形成所需的代谢产物，产量高。2、可以在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵，且所需酶活力高。3、根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变株或调节突变株或野生菌株。4、选育抗噬菌体能力强的菌株，使其不易感染

3、噬菌体。5、菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。6、菌种不是病原菌，不产生有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。4、 发酵工程发展过程中几个标志性人物和事件：1）1680列文胡克 显微镜2）1857 巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起3）1897 毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精酶4）1905 科赫 固体培养基的发明，奠定了纯培养技术。5）1928 弗莱明发现青霉素6）1953 Watson 和Crick 双螺旋结构5、 发酵工程研究内容（5点）：1） 微生物菌株选育微生物菌株选育、改造与功能优化技术；2） 发酵工艺发酵过程优化、控制与反应器技术；3） 单元操作发

4、酵工程过程工程技术；4） 发酵产品分离提取工艺发酵产品高效提取技术与装备；5） 废物处理绿色制造工艺的开发。6、一般菌种分离纯化和筛选步骤：标本制备标本材料的预处理富集培养菌种初筛菌种复筛性能鉴定菌种包藏第二章 工业微生物菌种的选育及扩大培养1、 原生质体融合概念：就是把两个亲本的细胞分别去掉细胞壁，获得原生质体，将两亲本的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞质融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。2、 原生质体育种技术主要有哪些：融合、转化技术、诱变技术3、 原生质体融合的方法和特点。方法：1）硝酸钠法；2）高钙离子法；3）PEG

5、法；4）多聚化合物法。特点：1）大幅度提高亲本之间重组频率；2）扩大重组的亲本范围；3）原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大；4）可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中；5）用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。4、 原生质体融合的基本工程（步骤）：5、 原生质体形成率和再审率（计算方法）：1）将用酶处理前的菌体经无菌水(或高渗溶液)系列稀释，涂布在完全培养基平板上培养，计出原菌数，该数值为A。2）将用酶处理后得到的原生质体分别经如下两个过程处理：用无菌水适当稀释，在完全培养基上培养

6、计数。由于原生质体在低渗透压下会破裂失活，所以长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数，该数值为B。用高渗透压液适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和，该数值为C。原生质体形成率= 原生质体再生率=6、 菌种保藏原理及保藏方法：原理：主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。保藏方法：1）斜面冰箱保藏法；2）沙土管保藏法；3）菌丝速冻法；4）石蜡油封存法；5）真空冷冻干燥保藏法；6）液

7、氮超低温保藏法。7、 种子扩陪的概念，目的以及标准：种子扩大培养：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。目的：（1）接种量的需要，抑制侵染；（2）缩短发酵周期；（3）逐级适应。标准：（1）生长活力强、同步性较好；（2）生理状态稳定，生产能力稳定；（3）总量及浓度满足要求；（4）无杂菌及噬菌体污染。8、 种子扩陪的过程（实验室，生产车间）：1）实验室阶段：培养物选择的原则：目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：对于不产孢子和芽孢的微生物，获

8、得一定数量和质量的菌体；对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。对于产孢子的微生物：获得一定数量和质量的孢子:培养步骤少,因而更容易获得量和质稳定的种子,但操作繁琐。获得一定数量和质量的菌丝体:便于操作,但需要更仔细的控制。培养基选择的原则：培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。起始接种物的传代问题：目的：使菌种的传代次数尽可能的少。细菌 保藏斜面 活化斜面产孢子 保藏 母斜面 子斜面2）生产车间阶段

9、：培养物的选择原则：在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。菌丝体比孢子要有利：缩短发酵时间；有利于获得好的发酵结果。培养基选择的原则：目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本；二是驯化。发酵级数的确定：一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）二级种子 （小罐）发酵青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）二级种子（中罐）发酵发酵级数确定的依据：级数受

10、发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响；级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级；在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。接种量的确定：过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。 种龄：种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。种子的质量要求：量：要求达到一定的浓度；质：形态(生长处于某个阶段、均匀等等)理化指标：

11、C、N、P的含量，pH，酶活等；无污染。9、 根据菌种特点，在实验室阶段，扩陪目的有所不同（对于产孢子与不产孢子而言）：1）对于不产孢子和芽孢的微生物获得一定数量和质量的菌体。2）对于产孢子的微生物获得一定数量和质量的孢子；获得一定数量和质量的菌丝体。10、关于菌种的异常分析：异常现象原因分析采取措施早期糖耗过慢、细胞生长缓慢接种孢子活力不够或接种量太少改善孢子制备过程早期糖耗过快、镜检有杂菌出现染菌分析感染原因，重新制种早期糖耗正常、细胞着色不深、有自溶现象、菌浓OD不再提高有可能出现噬菌体感染细胞生长过快，镜检正常接种量过大或溶氧过高镜检正常，考虑缩短种子培养时间繁殖菌丝不分散而聚团接入孢

12、子数以及通风搅拌效果欠佳加入某些表面活性剂促进菌丝分散，改善通风搅拌效果，如无法修正，重新制种菌丝粘附在罐壁上，最后易形成菌丝团搅拌效果不好，泡沫过多改善搅拌效果、加入适量的消泡剂、提高种子罐装料系数等第三章 培养基的设计与灭菌1、 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。巴氏消毒法，是将物料加热至60维持30min，以杀死不耐高温的微生物营养细胞。2、 灭菌：是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。灭菌条件：121，20-30min。消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。3、 除菌的

13、方法：培养基的加热灭菌、空气的过滤除菌、紫外线或电离辐射、化学药物灭菌4、 连续灭菌的流程与设备：（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到6070 °C ，以免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度（126132°C ）；3）维持罐，使料液在灭菌温度下保持57min。因为：连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的；4）冷却管，使料液冷却到4050°C后（冷水喷淋） ，输送到预先灭菌过的罐内。 注意：培养基连消时，发酵罐、加热塔、维持罐、冷却管要事先进行灭菌。5、 间歇灭菌与连续灭菌的比较优

14、点缺 点连续灭菌1.高温短时灭菌，培养基 营养成分损失少。2.发酵罐占用时间缩短， 利用率高。 1.设备复杂，操作麻烦, 染菌机会多。2.不适合含大量固体物 料的灭菌。间歇灭菌1.设备要求低，不需另外 加热、冷却装置。2.操作要求低，适合小批 量生产规模3.适合含大量固体物料的 灭菌1.培养基的营养物质损 失大，灭菌后培养基 质量下降2.发酵罐的利用率较低3.不适合大规模生产的 灭菌6、 空气除菌：空气中微生物(包括细菌、酵母、霉菌和病毒) 含量一般为103 米。一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上。灰尘粒子的平均大小约0.6m左右，空气除菌主要去除空气中的微粒(0.61m）。7、 空气除菌的方法

15、：过滤除菌、热杀菌、试剂灭菌、辐射灭菌8、 深层介质过滤的原理：微粒随气流通过滤层时，由于滤层纤维的层层阻碍，使气流出现无数次改变运动速度和方向的绕流运动，引起微粒与滤层纤维间产生惯性冲击、拦截、布朗扩散、重力沉降、静电引力等作用把微粒滞留在纤维表面上，实现过滤的目的。1、惯性冲击作用：2、拦截滞留作用：3、布朗扩散：1um 慢气流 不规则 直线运动4、重力沉降：重力 > 气流拖带力5、静电引力作用9、 发酵生产中制备无菌空气的大致过程 ：空气空压机贮气罐冷却除油水加热（以上为空气预处理）总过滤器分过滤器无菌空气（以上为空气过滤）10、 发酵罐的特点：轴封严密，泄漏少；能承受一定压力、温

16、度；搅拌通风装置保证气液充分混合；具有足够的冷却面积；死角少，灭菌彻底；适宜的径高比（高与直径的比值为2.54）11、 发酵罐的类型：搅拌釜反应器、鼓泡式反应器、气升式反应器12、 培养基类型：1）按培养基成分：合成培养基；天然培养基；半合成培养基。2）按物理状态分：固体（固体；半固体；脱水）；液体。3）按用途、类型分：基础培养基；完全培养基；富集培养基；选择培养基；鉴别培养基； 孢子培养基；种子培养基；发酵培养基。13、 配制孢子培养基时应注意哪些方面：配制时需注意：A）营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。如灰色链霉菌在葡萄糖-硝酸盐-其他盐的培养基上都能很好地生长和产生孢子，

17、但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只长菌体而不产孢子B）所用无机盐的浓度要适量，否则会影响孢子量和孢子颜色。C）注意pH和培养基的湿度。14、 常见的孢子培养基有哪些：1）麸皮培养基2）小米培养基3）大米培养基4）玉米碎屑培养基5）用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制的琼脂斜面培养基15、 工业上常用碳源、氮源（有机、无机、实速）各有哪些？氮源对发酵液pH产生的何种影响？碳源：糖类（最广泛的；葡萄糖最易被利用）、油脂、有机酸、低碳醇等。氮源：有机氮源：豆饼（粕）粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、玉米浆、尿素等。无机氮源：铵盐、硝酸盐等。速效氮：无机氮源和尿素、玉米浆等可被迅速利用。迟效氮：

18、蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用。氮源对发酵液pH产生的影响：(NH4)SO4 ® 2NH3 + H2SO4 NaNO3 + 4H2 ® NH3 + 2H2O + NaOH 反应中所产生的NH3被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质。在常用的无机氮中，硫酸铵被菌体利用后会使培养液的pH下降，为生理酸性物质；硝酸钠被同化时则引起培养液pH上升，为生理碱性物质。16、 典型的无机盐和微量元素的功能：磷酸盐磷：是某些蛋白质和核酸的组成成分；磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用；微生物对磷的需要量一般为0.0050.01mol/L。常用K3PO4、Na2HPO

19、4 、NaH2PO4。硫：硫含硫氨基酸的组成成分，胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸。某些产物的组成成分，青霉素、头孢霉素。硫是构成一些酶的活性基。硫酸镁加入培养基中，在碱性条件下会形成氢氧化镁沉淀，配料时要注意。铁：细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化物酶等组成成分。微生物有氧氧化必不可少的元素。盐钾：不参与细胞结构物质的组成是许多酶的激活剂菌体生长所需钾量约为0.1g/L（以K2SO4计）。微量元素：微量元素需量微少，但又不可缺少一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中，本身含有，不必另加 ，某些金属离子，特别是汞离子和铜离子，具有明显的毒性。17、 生长因子的概念、类别及哪些提供生长因子：生长因子：微生

20、物生长不可缺少的微量有机物质。类别：维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍生物。提供生长因子的农副产品原料：玉米浆、麸皮水解液、糖蜜。18、 前提的概念：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而又较大的提高。19、 促进剂和抑制剂的概念：促进剂：促进剂是指那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。抑制剂：抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。20、 淀粉水解糖的制备方法（优缺点）（了解）：（1）酸解法：以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高

21、温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。优点：生产简易，由淀粉逐步水解为葡萄糖的整个化学反应过程，仅在一个高压容器内进行，水解时间短，设备生产能力大；缺点：1）由于水解作用是在高温高压条件下进行的，要求设备耐腐蚀、耐高温、高压；2）在酸水解过程中，除了淀粉的水解反应外，尚有副反应的发生，将造成淀粉的利用率降低；3）酸水解法对淀粉原料要求严格，淀粉浓度不宜过高。（2）酶解法（双酶水解法）：酶解法可分两步：第一步：利用a-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖，使淀粉的可溶性增加，此过程称“液化”；第二步：利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖，此过程称“糖化”。“液化”和“糖化”都是在酶作用下完

22、成的，故得名。优点：1）淀粉水解是在酶的作用下进行的，酶解反应条件温和，对设备要求较低。2）微生物酶作用的专一性强，淀粉的水解副反应少，因而水解糖液纯度高，淀粉的转化率（出糖率）高。3）可在较高淀粉乳浓度下水解，且可采用粗原料。4）酶法制得的糖液色浅、较纯净、无苦味、质量高。缺点：酶解反应时间较长（需2-3天），要求的设备较多，需具备专门培养酶的条件，由于酶本身是蛋白质，易造成糖液过滤困难。（3）酸酶结合法：酸酶法：特点：液化速度快；糖化是由酶来进行的，对液化液要求不高，可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率；用酸较少，产品颜色浅，糖液质量较高。酶酸法：10、淀粉的酸水解会发生哪些反应：1）葡萄

23、糖的复合反应2）葡萄糖的分解反应。第四章 微生物反应动力学1、 微生物反应动力学的研究内容：揭示动态变量和发酵条件之间的关系。2、 反应计量学的相关内容（细胞衡算、联立解方程、呼吸熵得率系数）：反应计量学是对反应物的组成和反应转化程度的数量化研究。化学反应计量：物质的量-物质的量微生物反应计量的复杂性、不完全性：反应成分种类繁多；代谢途径错综复杂；生物生长和代谢产物生成并存。各物质和各组分之间的数量关系：碳源+氮源+O2=菌体+有机产物+CO2+H2O（1）微生物反应过程元素衡算：细胞的分子式CHxOyNz 典型细胞 CH1.8O0.2N0.5CHmOn+aO2+bNH3 cCHxOyNz+d

24、CHuOvNw+eH2O+fCO2 例：酵母耗氧培养，采用乙醇为基质，符合如下反应方程：C2H5OH+aO2+bNH3 cCH1.66O0.13N0.49+eH2O+fCO2 且呼吸商RQ=0.5，求各系数。解：根据元素平衡：C：2=c+f；H：6+3b=1.66c+2e；O：1+2a=0.49c+e+2f；N：b=0.13c已知呼吸熵RQ=0.5，则f=0.5a将以上5式联立求解，得：a=1.84；b=0.14；c=1.10；e=2.30；f=0.92。（2）得率系数：基于底物消耗的细胞得率系数、产物得率系数： 基于碳消耗的细胞得率系数Yc：由于Yc仅考虑底物和细胞的共同项碳，可以认为它比细

25、胞得率系数更合理。Yc一定小于1，一般在0.40.6之间。基于能量消耗的细胞得率Yave-：能量参数：有效电子数、总有效能、ATP。基于有效电子数的细胞得率是指底物完全氧化失去每1mol有效电子时的细胞生成量。 底物有效电子数，即底物完全燃烧所转移的有效电子数。耗氧培养时，碳源异化代谢的能量主要是通过氧化磷酸化得到，每消耗1mol氧，需要传递4mol电子。因此：1mol葡萄糖完全氧化时，需要消耗6mol氧气，因此 =1×6×4=24（mol电子） 基于总有效能的细胞得率YKJ：E-消耗的总能量（包括同化和分解代谢）基于ATP生成的细胞得率。YATP/S相对于基质的ATP生成

26、得率。Ms基质的分子质量。（3）能量衡算：3、 三种发酵基本操作方式的特点：1）分批操作：特点：效率低。尽管微生物的活性和机能因其所处的环境大幅度变化，也根本不控制培养基组分浓度等环境因素，而任其自然变化，这样不利于生产。在每一批主反应（生产阶段）之前，必须进行几级种子培养。但由于操作相对较易，目前仍是发酵工业的主要方式。2）补料分批操作：介于分批培养和连续培养之间的操作方式；在进行分批培养的时候，随着营养的消耗，向反应器内补充一种或多种营养物质，以达到延长生产期和控制发酵过程的目的。反复补料分批培养：随着补料操作的进行，发酵液的体积逐渐增大，到了一定时候将部分发酵液取出，剩下的发酵液继续进行

27、补料分批培养，如此可反复进行多次，称为反复补料分批培养。3）连续操作：优点：省去了反复放料、清洗、装料、灭菌等步骤，避免了延迟期，提高设备的利用率和单位时间产量。发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制；易于分期控制，可以在不同罐中控制不同的条件。缺点：对设备、仪器及控制元器件的技术要求较高，从而增加投资成本；开放的系统和长周期发酵，易造成杂菌污染；长周期连续发酵易发生微生物变异，生长慢的高产菌株可逐渐被生长快的低变异菌株取代，从而降低产率；丝状菌体易附着在器壁上和在发酵液中结团，造成连续操作的困难。4、 发酵动力学的相关内容：1）发酵过程的反应描述及速度概念：生物过程反应速度的描述：菌体生长速率/

28、菌体比生长速率；基质消耗速率/基质比消耗速率；产物形成速率/产物比形成速率。菌体生长速率、比生长速率：比生长速率除受细胞自身遗传信息支配外，还受环境因素的影响。例题：以乙醇为惟一碳源进行产气气杆菌培养，菌体初始溶度Xo=0.1kg/m3,培养至3.2h,菌体溶度为8.44 kg/m3，如果不考虑延迟期，比生长速率一定，求倍增时间td？解：2）基质消耗速率：以菌体得率系数为媒介，可确定基质的消耗速率与生长速率之间的关系。 发酵过程反应速度的描述：基质的消耗速度： (g.L-1.s-1)基质的消耗比速： (h-1、s-1)单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量称为比速，是生物反应中用于描

29、述反应速度的常用概念。发酵过程反应速度的描述：基质的消耗比速： (h-1)菌体的生长比速： (h-1)产物的形成比速： (h-1)3）分批操作：(1)微生物的生长动力学、微生物在一个密闭系统中的生长情况：延迟期： X=X0 产生的原因：适应培养基营养条件、适应培养基物理环境、抑制剂的降解、孢子发芽、种龄。指数生长期:=max (是由生物的遗传基因决定的) 减速期: 微生物的生长速度：f(s,p,T,pH,)在一定条件下(基质限制)：f(S)1) 细胞的生长为均衡式生长，因此描述细胞生长的唯一变量是细胞的浓度； 2) 培养基中只有一种基质是生长限制性基质，而其他组分为过量，不影响细胞的生长； 3

30、) 细胞的生长视为简单的单一反应，细胞得率为一常数。Monod方程： ：菌体的生长比速;S：限制性基质浓度；Ks：饱和常数；max: 最大比生长速度。例：在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：S(mg/l) 6 33 64 153 221(h-1) 0.06 0.24 0.43 0.66 0.70求在该培养条件下，求大肠杆菌的max，Ks？解：将数据整理：S/ 100 137.5 148.8 231.8 315.7 S 6 33 64 153 221max1.11 (h-1); Ks97.6 mg/L静止期： X=Xmax 衰亡期: (2)基质消耗动力学的基本概念： S1 菌体S S2 产物

31、S3 维持维持消耗(m) ：指维持细胞最低活性所需消耗的能量，一般来讲，单位重量的细胞在单位时间内用于维持消耗所需的基质的量是一个常数。+维持物料衡算： 当以氮源、无机盐、维生素作为底物消耗时，由于这些组分只能构成细胞的组成成分，而不能提供能量，因此YX/S近似为定值。 当底物既为能源又为碳源时，但是此时还没有产物生成： (3)产物形成动力学的基本概念：一类发酵：产物的形成和菌体的生长相偶联（偶联型模型） 产物的形成与细胞生长呈相关的过程。产物是细胞能量代谢的结果，此时产物通常是基质的分解代谢产物。例如乙醇、乳酸发酵。其动力学方程可表示为：二类发酵：产物的形成和菌体的生长部分偶联（混合型）产物

32、的形成与细胞生长部分相关或具有间接关系，例如柠檬酸、谷氨酸发酵等。其动力学方程可表示为：三类发酵： 产物的形成和菌体的生长非偶联（非偶联型） 产物的形成与细胞生长不相关或无直接关系，其特点是细胞生长期基本无产物合成，细胞停止生长产物则大量合成。属于这类的产物是次级代谢产物。例如青霉素、链霉素等抗生素发酵。其动力学方程可表示为：4）补料分批操作：补料分批即可采用间歇添加，也可采用连续流加的方法。菌体： 限制性底物：产物： 菌体总量变化：恒速流加培养动力学特点：体积变化： 稀释率（更新速率）D：恒速流加培养菌体的变化速率：恒速流加培养底物浓度变化：恒速流加培养产物浓度变化：恒速流加培养的最大特点：

33、 （KL线性生长速率常数）指数流加培养动力学特点：指数流加能够保持恒定的比生长速率。由得指数流加时，限制性底物的浓度也应恒定（假设底物恒定为S）。则因此可见随着时间的不断增加，限制性底物的流速必须要随着时间的增加呈指数增加。当S << Sin时。上式可以简化为：5）连续操作：（1）菌体： 当达到稳定状态后： =D(2)限制性底物的物料衡算： 在稳态下，可以得到：达到稳态时，限制性底物浓度和稀释率的关系：故菌体浓度和稀释率的关系：（3）产物浓度： （4）临界稀释率Dc：在单级连续培养过程中，可以通过改变加料的速率来改变稳态下的菌体比生长速率。 (5)连续培养的细胞产率：对有些连续培养

34、，其过程优化的目标是达到单位时间单位体积的细胞产量（Px）最大， Px称为细胞产率。第五章 发酵过程工艺的优化与控制1、 温度对发酵有哪些影响？1）温度对微生物细胞成长的影响：温度升高 细胞的生长繁殖加快生长代谢和繁殖都是酶促反应，随着温度的升高，反应速度加快，呼吸强度增加，必然导致细胞生长繁殖加快。另一方面,随着温度的上升，酶失活的速度也越快，菌体衰老提前，发酵周期缩短。2) 温度对产物形成的影响：阿累尼乌斯方程： 活化能E的大小表明温度变化引起酶反应速率的大小。假如：生长活化能 34 kJ/mol；呼吸活化能71kJ/mol；产物形成活化能112kJ/mol。则此结果表明产物形成速率对温度

35、的反应最为敏感，偏离最适温度引起的生产率下降比其他两个参数的变化更为严重。3）温度影响发酵液的物理性质：温度除了影响发酵过程中各反应速率外，还可以通过改变发酵液的物理性质，间接影响微生物的生物合成。溶解度、氧的传递、基质分解速率4）温度还可能影响生物合成的方向： 2、 发酵热由哪些组成（各是什么意思，定义）：（1）生物热（Q生物）：产生菌在生长繁殖过程中本身会产生大量的热。（2）搅拌热（Q搅拌）：搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间、液体和设备之间的摩擦，产生数量可观的热。（3）蒸发热（Q蒸发)：空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换，同时必然会引起水分的蒸发，蒸发所需的热量即为蒸发

36、热。（4）显热（Q显）：排出气体所带的热。（5）辐射热（Q辐射）：因罐内外的温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。3、 发酵热的测定方法（2个）：方法一：通过测定一定时间内冷却水的流量和冷却水的进出口温度，由下式求得这段时间内的发酵热：Q发酵 = GC (t2- t1) / V (J / m3· h)G冷却水流量，kg/h；C水的比热，J/kg·；t1、t 2进、出口的冷却水温度，；V发酵液体积，m3方法二：通过罐温的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自动控制装置测得温度随时间上升的速率S, 按下式可求得发酵热 ：Q 发酵=（M1C1+M2C2）·S（KJ/

37、h）S温度随时间上升的速率，/h；M1系统中发酵液的质量，kg；M2系统中发酵罐的质量，kg；C1发酵液的比热，kJ/ kg·；C2发酵罐的比热，kJ/kg·4、 氧气传递的阻力分析（传氧、耗氧）：氧传递的各种阻力的示意图：氧传递可分供氧和耗氧两个方面：供氧部分耗氧部分包括通过气膜、气-液界面、液膜及液体主流的扩散。包括氧分子自液体主流通过液膜、菌丝丛、细胞膜及细胞内的扩散。推动力：氧的分压p或浓度差C供氧方面的阻力： 1)气膜阻力（ 1/k1；1/KG）：与空气情况有关。2)气液界面阻力（1/k2；1/KI）：与空气情况有关。3)液膜阻力（1/k3；1/KL）：与发酵液的

38、成分和浓度有关。4)液流阻力（1/k4；1/KLB）：与发酵液的成分和浓度有关。耗氧方面的阻力： 1）细胞周围液膜阻力（1/k5；1/KLC）与发酵液的成分和浓度有关。2）菌丝丛或团内的扩散阻力（1/k6；1/KA）与微生物的种类、生理特性状态有关。3）细胞膜的阻力（1/k7；1/KW）与微生物的生理特性有关。4）反应阻力（1/k8；1/KR）与微生物的种类、生理特性有关。氧在传递过程中，需损失推动力以克服上述阻力，过程中需克服的 总阻力等于供氧阻力和耗氧阻力之和，即：供氧方面：由于氧很难溶于水，所以供氧方面的气液面阻力（1/KI）是氧溶于水时的限制因素。良好的搅拌使气泡和液体充分混合而产生湍

39、流，可减少1/kL、1/kLB，加速氧的传递。耗氧方面：细胞壁上与液体主流中氧的浓度差很小，即1/kLC很小； 在搅拌和合理的 工艺条件下，结团现象减少，因而能降低1/kA ；通过搅拌、添加表面活性剂等方法，增加细胞膜透性，可使1/kw降低；1/kR与微生物生长及代谢的条件有关：培养基的成分与其相应的酶的作用失活；某些生理条件如温度、pH等不适于酶的反应；一些代谢物的积累或未能及时从反应处移去。通过选育优良菌种，优化反应条件将1/kR降低。5、 KLa的影响因素：1）搅拌：把从空气管中引入发酵罐的空气打成碎泡，增加气-液接触面积“a”,亦即增加氧的传递面积。使液体形成涡流，从而延长气泡在液体中

40、的停留时间。增加液体的湍流程度，降低气泡周围的液膜阻力和液体主流中的流体阻力，从而增大KLa值。使培养液分布均匀，减少菌丝结团现象，降低细胞壁表面的液膜阻力，改善细胞对氧和营养物质的吸收，同时降低细胞周围“废物”和“废气”的浓度。搅拌转速对KLa的影响很大，对微生物的摄氧率也有影响，但对C*无影响。但过高的搅拌速度不但浪费动力，还会损伤菌体，引起菌体自溶及减产等。2）空气流速：KLa随空气速度的增加而增大。若空气速度过大，将使叶轮发生“过载”，即叶轮不能分散空气，此时气流形成大气泡在轴的周围逸出。当空气速度超过“过载”速度后，KLa并不随之而增加。3）培养液的性质：在发酵过程中，菌本身的繁殖及

41、其代谢可引起发酵液物理性质的不断变化，如改变培养液的表面张力、黏度和离子浓度等；而这些变化会影响气体的溶解度、发酵液中气泡的直径和稳定性及其合并为大气泡的速度等。发酵液的性质还影响液体的湍动以及界面或液膜的阻力，因而显著地影响氧的传递效率。4）微生物生长的影响：随着微生物的生长，发酵液中细胞浓度的增加，会使KLa逐渐变小。菌丝体形态也影响KLa值。5）消泡剂的影响：消泡剂的加入使得KLa值显著下降。6）离子强度的影响：电解质溶液的KLa值比水中的要大。7）空气分布器和发酵液高度对通气效率的影响：生产实践证明，多孔环状鼓泡器的效果并不比单孔鼓泡器好。且多孔鼓泡器易堵。高位发酵罐,增加发酵罐的高度

42、(D:H=1:7)；增加了气-液接触时间，提高了氧的利用率。8）其它因素：搅拌影响发酵罐溶氧的主要因素是：单位体积液体的搅拌功率P/V，搅拌转数和空气的截面流速。另有些因素也在一定程度上影响溶氧：搅拌器组数和间距对溶氧的影响：据径高比和发酵液的特性决定,一般来说，当H/D = 2. 5时，用多组搅拌器可提高溶氧系数10%，当H/D = 4并采用较大的空气流速和较大的功率时，多组搅拌器可提高溶氧系数25%。若搅拌器之间相互位置不恰当，则流型和空气分布情况将发生变化，就会引起溶氧系数的大幅度降低。功率、转速、风量之间的关系对溶氧的影响：增加搅拌功率、搅拌转速和风量，对一定的设备而言都会增加溶氧。但

43、三者之间存在着相互关系，增加风量虽然能增加溶氧，但在转数不变的情况下会降低搅拌功率，溶氧又会随之降低。有机物质和表面活性剂对KLa影响：某些有机物质如蛋白胨，能降低KLa，如在水中加入10000ppm的蛋白胨，则KLa值降低到未加时的40%左右。但某些少量的醇、酮和酯反而会使KLa值提高,如将20 ppm的这类物质加入水中，能使KLa值增加50100%。6、 氧气传递的推动力是什么：要提高推动力，只能设法提高C*或减少CL。1）提高氧饱和浓度（C*）：可降低培养温度,提高罐压,富氧,降低培养基浓度等。但这几方面局限性都很大。2）降低溶氧浓度（CL）：降低CL可通过减少空气流量等方法来达到，但溶

44、氧浓度不能低于临解氧浓度。另外，减少空气流量本身会使KLa下降。7、 影响微生物对氧需求的因素：1）微生物不同；2）生长时间不同；3）细胞浓度不同；4）培养基的成分和浓度不同；5）pH、T。8、 呼吸强度、摄氧率、临界氧溶度：比耗氧速率（呼吸强度）： 微生物耗氧速率常用单位质量的细胞（干重）在单位时间内消耗氧的量，即比耗氧速率（或呼吸强度）来表示。当氧为限制性基质时，比耗氧速率为摄氧率：单位体积培养液，在单位时间内消耗的氧量称为摄氧率。临界氧浓度：各种微生物的呼吸强度是不同的，并且呼吸强度是随着培养液中溶解氧浓度的增加而加强，直至达到一个临界值为止，这个临界值称为“临界氧浓度”。9、 KLa的

45、测定方法：测定发酵 过程中发酵液溶氧浓度、摄氧率、液相体积氧传递系数KLa的变化，随时掌握发酵过程的供氧需氧情况。为准确判断设备的通气效果提供可靠数据，进而控制发酵过程。1）摄氧率的测定： 2）液相体积氧传递系数KLa的测定： 10、CO2对发酵的影响：1）CO2对氨基酸、抗生素等的微生物生长具有刺激或抑制作用：通常，CO2对菌体生长具有抑制作用。当排气CO2浓度高于4%时，糖代谢和呼吸作用速率下降。例：发酵液中CO2浓度达到0.16 mol/L，就会严重抑制酵母菌的生长；当进气口CO2对含量占混合气体的80%时，酵母活力与对照相比降低20%。2）CO2对微生物生产能力的影响：例：CO2抑制紫

46、苏霉素的合成，当在通气中加入11% CO2 ，紫苏霉素的产量下降33%。在发酵15h后，通气中加入11% CO2，红霉素的产量减少60%。3）CO2对微生物的生长以及产物的形成都有非常重要的作用。或刺激或抑制菌体生长；或增加或减少产量。4）在生产中严格控制CO2的通入量，能够促进菌体生长，增加产量，提高效率，节省成本。11、控制CO2浓度的手段：1）CO2浓度的控制主要取决于其对发酵的影响，如果对发酵有促进作用，应该提高其浓度；反之应设法降低其浓度。2）提高通气量和搅拌速度：增加溶解氧的同时，还可以降低CO2的浓度；降低通气量和搅拌速度：降低溶解氧的同时，还可以增加CO2的浓度。12、泡沫产生

47、的原因：在微生物好氧培养中，发酵液往往会产生大量泡沫这是正常现象。其形成的原因包括：外力、微生物代谢和培养基的成分：1）外力：通气和搅拌速率；2)微生物代谢：氨气、二氧化碳（发酵性泡沫）；3)培养基成分：含有表面活性物质，如花生饼粉、玉米浆、皂苷、糖蜜等。13、泡沫产生的危害：1）逃液造成损失；2）增加染菌的几率；3）由于菌体粘附罐壁，造成菌体量减少；4）妨碍菌体呼吸，造成代谢异常，菌体自溶。14、泡沫的消长规律：1）泡沫的产生量随着搅拌速度的增加而增加，随着通气量的增加而增加；2）泡沫和所用原材料的性质有关。（如：玉米浆>花生饼粉>黄豆饼粉>）；3）泡沫的产生和发酵过程有关

48、。第六章 发酵染菌及其防治1、 造成染菌的可能途径有哪些：1）菌种培养过程操作不当；2）培养基灭菌不彻底；3）发酵设备（如发酵罐、管道）密封不严；4）空气除菌不净。2、 染菌对发酵会造成哪些影响：染菌仍是发酵工业的致命伤。轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量；严重者造成生产失败，浪费大量原材料，造成严重经济损失，而且扰乱生产秩序，破坏生产计划。遇到连续染菌，特别是又找不到染菌原因，未有防治措施时，往往会影响人们的情绪和生产积极性，造成无法估量的危害。3、 不同杂菌的种类对发酵的影响：发酵过程危害最大的杂菌种类青霉素的发酵链霉素的发酵四环素的发酵谷氨酸的发酵柠檬酸的发酵细短产气杆菌细短杆菌、假

49、单孢杆菌双球菌、芽孢杆菌、荚膜杆菌噬菌体青霉菌在抗生素的发酵过程中，青霉素的发酵污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害更大；链霉素的发酵污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比污染粗大杆菌更有危害；谷氨酸的发酵最怕噬菌体的污染。4、 发酵的异常现象有哪些：1）溶解氧的异常变化：当杂菌是好气性微生物时，溶解氧的变化是在较短时间内下降，直至接近于零，且在长时间内不能回升；当杂菌是非好气性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧升高。2）排出的CO2异常变化：好气性发酵排出的气体中的CO2含量与糖代谢有关。对于特定的发酵过程，工艺确定后，排出的气体中的CO2含量的变化是有规律的。染菌后，培养

50、基中糖的消耗发生变化 ，引起排气中CO2含量的异常变化，如杂菌污染时，糖耗加快，CO2含量含量增加，噬菌体污染后，糖耗减慢，CO2含量减少。因此，可根据CO2含量的异常变化判断染菌。3）其他异常现象：如菌体生长不良、PH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液的颜色异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的粘度异常增加等判断染菌。 5、 无菌实验的方法：1）显微镜检查法（镜检法）；2）肉汤培养法；3）平板划线培养或斜面培养检查法；4）发酵过程的异常现象观察法。无菌试验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（由红色变为黄色）或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，

51、即可判断为染菌。6、 根据杂菌种类初步判断染菌原因：杂菌的种类染菌原因分析耐热的芽孢杆菌培养基或设备灭菌不彻底球菌、无芽孢杆菌等不耐热菌种子带菌/空气除菌不彻底浅绿色菌落的杂菌设备或冷却盘管的渗漏霉菌无菌室灭菌不彻底或无菌操作不当酵母菌糖液灭菌不彻底或糖液放置时间过长7、 不同时期染菌的挽救和处理方法：1）种子培养期染菌：处理：应经灭菌后弃之,并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。2）发酵前期染菌：处理：营养成分消耗不多，应迅速重新灭菌；另处，补充必要的营养成分，重新接种进行发酵。3）发酵中、后期染菌：处理：可以加入适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度；产品的含量若达

52、一定值，只要明确是染菌也可放罐。4）发酵后对设备的处理：处理：空罐加热灭菌后至120以上、30min后，才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法进行处理。8、 杂菌污染的途径和方法：1）种子带菌及防治：原因分析：种子保存、种子换代及接种、种子培养基、种子培养设备。防治措施：检查发生污染所用的保藏菌种；检查发生污染的种子罐接种所用的三角瓶等器皿；检查对三角瓶、棉花塞、培养基等所进行的灭菌操作；检查天菌锅的工作情况， 校核温度表和压力表。灭菌锅工作时锅内空气务必排尽；检查无菌室的无菌状况，特别是接种箱。检查接种箱所用的杀菌熏剂；检查操作人员的操作技术；对杂菌或噬菌体进行微生物检验。2

53、）空气带菌及防治：原因分析：要杜绝无菌空气带菌，就必须从空气的净化工艺和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。空气净化系统导致染菌，占总染菌的18.9。防治措施：油渗入空气：改用无油润的压缩机；列管式冷却器穿孔；过滤介质松动，空气走短路；过滤介质被水润湿；过滤介质老化。3）设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治。盘管的渗漏染菌及防治：原因分析：由于存在温差（内冷却水温、外灭菌温），温度急剧变化，或发酵液的pH低、化学腐蚀严重等原因 。防治措施：生产上可采取仔细清洗,检查渗漏,或降低冷却水中CL-1的含量等措施加以防治。空气分布管的“死角”染菌及防治：原因分析：受搅拌与通风的影响，易磨蚀穿孔；管中的空气流速不一致，靠近空气进口处流速最大，离进口处距离越远流速越小。 防治措施：采取频繁更换空气分布管或认真洗涤等措施。发酵罐的渗漏染菌及防治：原因分析：发生局部化学腐蚀或磨蚀，产生穿孔渗漏；罐焊接处等的周围容易积集污垢；发酵罐的制作