基因组文库构建

1、编辑ppt1第四章 基因组文库的构建基因组文库(genomic library)即基因文库(gene bank)是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。构建基因文库时先提纯生物的总DNA，通过机械剪切或酶切使其成为一定大小的片段，连接到适当载体(常为噬菌体)上，经体外包装转染细菌，得到一群含不同DNA片段的重组噬菌体颗粒。此即是基因文库。这群DNA片段含盖基因组全部基因。编辑ppt2 cDNA文库(cDNA library) ： 克隆的重组cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特定物种或器官的所有mRNA制备得到的cDNA。 cDNA分子克隆(cDNA clo

2、ne) ：将cDNA片段装在载体上转化细菌,扩增出多克隆的过程，最终可建立cDNA文库。编辑ppt3建库的目的：1.从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；2.是从来源复杂的总mRNA的cDNA文库中分离稀有的cDNA克隆。建库的关键：如何产生足够数量的重组DNA建库应注意： 1.保证载体DNA和靶DNA均不被外源DNA序列污染； 2.尽可能用“ 电话克隆”。编辑ppt4 组织 载体 ( 选择一种) mRNA DNA cDNA 部分或完全 消化的 DNA 甲基化，加接头 的双链 DNA 大小分级 可供克隆的 DNA 片段 连接 DNA 片段和载体 重组载体 DNA 导入 E.coli (体外包装或转

3、化) 基因库的鉴定与效价测定 筛选目的基因 扩增文库长期保存 构建基因组 DNA 和 cDNA 文库的流程示意图 编辑ppt5 第一节 DNA克隆片段的产生与分离一.基因组DNA的片段化 1.用限制酶片段化:用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach) 存在的问题： 所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段的混合群体。以每个载体可插入13kbDNA计算， 基因库至少含1030万个重组质粒。从中筛出目的基因工作量是很大的。 目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个基因分载在 几个重组质粒上，完整筛出更不容易。编辑ppt62

4、.随机片段化： 超声波：可产生300bp的短片段。高速搅拌：1500转/分30分 可切 平均长度8kb的分子群体。3.双酶消化单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考虑到载体容量，如噬菌体插入片段不超过25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平均长度为256bp) ,识别6bp的限制酶切割平均长度4096 bp. 编辑ppt7双酶切产生的DNA片段平均大小不超过1kb,但如采用双酶部分消化，产物的分子量可达1030kb,它们存在着随机序重叠，用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片段群体按大小分开，可得到的分子量大小约为20kb的随机DNA片段群体。二. DNA片断大小的分部 如已知含目的基因克隆

5、片段的大小范围，可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳将DNA群体按大小分部分离。三.目的基因克隆片段的富集。编辑ppt8 四.克隆数的确定任一DNA序列在文库中出现的概率： N:该序列需要克隆的总数；p:待克隆DNA序列在文库中设定的出现概率，一般为99；I：待克隆DNA片段的长度，假定为17kb;G: 基因组DNA的总长度，如人类为3109bp)/1ln()1ln(GIpN编辑ppt9 将数据代入上式 = 8.1105N的含义是克隆大小为17kb的人类DNA时，所构建的基因文库数必须在 8.1105 以上时，才能以99的概率得到此克隆。)30/171ln()99. 01ln(MbkbN编

6、辑ppt10五. cDNA文库 一.概况: cDNA文库是通过反转录mRNA，并制备双链双链cDNAcDNA(double stranded cDNA)来构建的。 构建cDNA文库的策略是取决于：(1)目的mRNA的相对丰度；(2)筛选方法： 除简单的分子杂交法外还可对表达产物用各种方法进行鉴定。编辑ppt11cDNA文库的优点 (1)使遗传物质为RNA病毒可建立文库； (2)因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选； (3)从分化特异的细胞的cDNA文库中可分离到特异表达的基因。 (4)建库时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。 (5) cDNA文库可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。编辑p

7、pt12但应注意： (1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。 (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或不同组织细胞中的mRNA制备的cDNA文库会包含一些共同和特异序列。这可用于分离差异表达的基因。 (3)cDNA文库的DNA无内含子、调节元件和基因间DNA。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部分重叠的cDNA克隆。编辑ppt132.制备cDNA文库 分离代表细胞中主要mRNA(rRNA和tRNA因其丰富和大小的一致性，可以通过分级直接分离)。mRNARNA的提取的提取可以通过

8、多胸腺嘧啶的柱子分离。然后被反转录。cDNA第一链的合成用oligo(dT)引物，因为长的mRNA没有被完全反转录,因此中部可加另一引物。第二链第二链cDNAcDNA的合成的合成是用自身引物的，一个更有效的方法是在cDNA第一链加尾(如多聚胞嘧啶)，然后用oligo(G)为引物起始第二链的合成。这样产生的双链cDNA可以通过加接头或同聚尾巴插入载体。编辑ppt14 AAAAAAA mRNA (a) 随机六碱基 (b)寡聚(dT)引物 第一条 cDNA 的合成 An An NNNNNN Tn (c)发夹引物 (d)同聚物加尾反应 第二条 cDNA 的合成 TTTTTT GGGGGG TTTTTT

9、 CCCCCC 加接头 1 TTTTTT GGGGGG TTTTTT AAAAAA CCCCCC AAAAAA 切除发夹 通过以下途径将 cDNA 插入载体 a. 平端克隆 TTTTTT b. 加接头 AAAAAA c. 进一步进行同聚物加尾反应 加接头 2 TTTTTT AAAAAA 经酶切进行定向克隆 cDNA 克隆 编辑ppt15第二节 构建文库的载体一一.噬菌体载体噬菌体载体 基础：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或包装后转染宿主细胞。 载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。 重组筛选： 插入载体通过可见标记的插入失活(cI基因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈；现代的载体携带lacZ

10、基因，以兰-白筛选)。编辑ppt16 置换载体Spi-表型(对P2感染敏感性消失)是中心“ 填充片段”gam和red基因座丢失引起的。 供体DNA的大小： 插入载体：0-10kbp; 置换载体：9-23kbp。 插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105所限制。 主要应用： 插入载体:cDNA克隆和表达文库;噬菌体展示。 置换载体:基因组DNA克隆。编辑ppt17二. 粘粒粘粒( (cosmid) )载体载体 基础：包含噬菌体cos位点的质粒； 导入宿主：经体外包装，再转染宿主细胞； 载体筛选：类似于质粒 重组筛选：可见标记插入失活和小片段插入的阳性筛选； 供体DNA大小：30-

11、45kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105所限制。 主要应用：基因组文库构建。编辑ppt18 真核基因组 DNA 取代型噬菌体载体 COS Charon 4A 机械剪切 EcoRI EcoRI 酶切 加人工接头 酶切 连接 cos cos 体外包装 转染 E.coli 编辑ppt19三.质粒载体构建cDNA文库双链质粒 DNA5 3 AAAAAAn 加锚定引物(寡聚 T) pBR322 5 3 AAAAAn 3 5 TTTT RT 酶 限制酶 用 NaOH 降解 mRNA 用 Klenow 酶合成第二链 SI 酶降解发夹结构末端转移酶dGTP 末端转移酶加寡聚 C C

12、CC CCC GGGGGG 连接 转化 E.coli 扩增 以质粒为载体构建 cDNA 文库编辑ppt20四.大容量克隆载体 基因组作图中使用的高容量人工染色体克隆载体的比较基因组作图中使用的高容量人工染色体克隆载体的比较。载体系统克隆容量评价YAC(酵母人工染色体)酵母着丝粒,复制起始点和端粒200kb2Mbp嵌合发生率高(在基因组中不相连的连续片段)；不稳定(自发缺失)；很难与酵母染色体分离；PAC(P1 人工染色体)细菌噬菌体 P1100300kbBAC(细菌人工染色体)F 质粒300kb稳定，但在细菌外难以维持MACs(哺乳类人工染色体)基于 Epstein-Barr 病毒的游离载体3

13、00kb 人类人工游离染色体(human artificial episomal chromosome,HAECHAEC)是一类发展 中的 MACs,它来自于 Epstein-Barr 病毒编辑ppt21(1)(1)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids) 基础：大肠杆菌F质粒 导入宿主：电转化 载体筛选：显性选择标记重组筛选：插入片段大小供体DNA大小：300kbp主要应用：大基因组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体在每个细胞中维持一个或两个拷贝，产生少量供体DNA。编辑ppt22 HindIII Co

14、s NotI NotI Z T7 SP6 ParC CMr HindIII 部分酶切 ParB BAC oriS ParA PFGL repE HindIII CIP Pulsed-field gel electrophoresis 连接编辑ppt23编辑ppt24 (2) P1P1载体和载体和P1P1人工染色体人工染色体(P1 artificial chromosomes, PACs) 基础：噬菌体P1 导入宿主：体外包装和转导 载体筛选：显性选择标记 重组筛选：应用对致死标记的打断进行阳性筛选 供体DNA大小：约100kbp 主要应用：大基因组分析 评论：重排和嵌合分子少。载体维持低拷贝，

15、但可以通过诱导噬菌体P1溶菌循环扩增。编辑ppt25(3)(3)酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromsomes, YACs) 基础：酿酒酵母中心粒、端粒和ARS 导入宿主：转化酵母原生质体 载体筛选：显性筛选标记(营养缺陷型的恢复) 重组筛选：插入片段大小 供体DNA大小：2000kbp 主要应用：大基因组分析，YAC转基因小鼠 评论：YAC的缺点是高频率的自发缺失，和克隆的嵌合化。重组载体的大小，需要电泳分析，有时难以区分内源性染色体。YAC维持低拷贝。编辑ppt26 CEN4 EcoRI ARSI SUP4 TRPI Amp URA3 DNA ori

16、EcoRI 部分酶切 TEL TEL BamHI BamHI BamHI 和 PFEG(pulsed field gel Ecoli 双酶切 electrophorcsis ) 脉冲电泳 变角电场电泳 连接 编辑ppt27第三节 文库的筛选 一.基因组DNA文库的筛选 筛选DNA文库是分离目的基因常用的方法；在成千上万的克隆中仅极少数含目的基因，且大多数基因的产物不具有可选择的表型特征，因此可采用以下策略来进行筛选：(1)用特异探针进行分子杂交；(2)用免疫和生化方法来检测基因产物；(3)用特异性引物进行PCR扩增。编辑ppt28二.cDNA的筛选 (1)最佳的cDNA文库其mRNA在细胞中高

17、水平特异表达； (2)有的目的mRNA的丰度极低，那么就应选择其丰度相对较高的细胞来构建文库，并要计算好文库应具有的克隆数； (3)细胞中某种蛋白质的表达量常常是表明mRNA丰度的敏感指标。编辑ppt29表 24.4 根据所提供的来源和信息，从 cDNA 或基因组文库中分离基因的策略所提供的信息所提供的信息筛选策略筛选策略功能克隆功能克隆- -不需要表达不需要表达高度度 mRNA丰富克隆从 cDNA 文库中随机选择克隆，测序确定产物已知部分序列用寡核苷酸探针筛选a有部分克隆或同源序列在低严格条件下用克隆的片段或同源基因筛选已知部分多肽序列用简并性寡核苷酸猜测体猜测体(guessmers)筛选文

18、库两种组织中表达差异差减筛选，通过差减杂交得到富含差异表达克隆的文库cDNAcDNA 表达的功能克隆表达的功能克隆提供突变通过对突变表型的互补筛选(表型恢复)提供抗体同免疫检测筛选文库特异性的产物通过特殊技术筛选文库，如对 DNA 结合蛋白的 southweatern 杂交，相互作用蛋白的酵母双杂交体系，酶对底物的转化等定位克隆定位克隆提供结构突变如果突变由缺失引起，从基因组消减文库来克隆由转座子插入引起的突变如果突变由插入或转座子件引起，用转座序列作为探针筛选突变体文库，通过质粒拯救分离克隆基因在染色体上的位置通过从相关标记或染色体断点相连接的染色体步移(chromosomewalking,

19、)定位克隆，标记可能是增强子包载载体的转座因子非筛选方法非筛选方法基因组作图和测序对整个基因组系统化分析表达序列标记对随机 cDNA 克隆的大量克隆和分析a 以 PCR 为基础的方法也可应用编辑ppt30 探针的特异性可通过以下的策略来解决： 选基因的特异序列为探针； 长度不低于1720Nt； 控制退火温度。 碱基的简并性可通过以下的策略来解决： 选用简并程度最低的序列； 选用使用频率最高的密码子； 简并密码子的第3个碱基可用H； 应用混合探针； 控制退火温度。编辑ppt31 三. 应用寡核苷酸探针来分离目的基因1.寡核苷酸探针的来源(1)从某一物种分离到的基因序列可作为另一物种的核酸探针；(

20、2)由蛋白质保守区中相邻的67个氨基酸推导合成出核酸探针。 合成探针时必须考虑到： 探针的特异性； 碱基的简并性。编辑ppt32四.假阳性克隆的克服 应用混合探针分离克隆基因虽取得了良好的效果，但也会产生相当数量的假阳性。克服假阳性的方法有二: (1)制备“ 猜测体(guessmer)” 探针 猜测体 探针是根据特定物种某已知蛋白的密码子使用频率，选择含有密码子简并程度最低的蛋白质区段进行人工合成的低简并性寡核苷酸探针。编辑ppt33TC CTAGAGAGCT 保守的氨基酸序列 CysMetAspGluMetLysArgAsnIle 特异的 DNA 序列 A TG -ATG-GA -GA -A

21、TG-AA -AG AA -ATT C 简并的探针含 8 种不同序列 A CGC TGTATGGATGAAATGAA G TGCATGGATGAAATGAA T TGTATGGACGAAATGAA TGCATGGACGAAATGAA TGTATGGATGAGATGAA TGCATGGACGAGATGAA TGCATGGATGAGATGAA TGTATGGACGAGATGAA 同 cDNA 文库杂交 唯一的“猜测体”5 TGCATGGACGAGATGAAGCGCAACATC 3 同克隆基因杂交的正确序列 5 TGCATGGACGAATGAA 3 ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTAT

22、AG 猜测体与克隆基因杂交存在错配 G C5 TGCATGGACGA ATGAAGCGCAA ATC 3 ACGTACCTGCT TACTTCGCGTT TAG T A 事实上的 DNA 序列5 TGCATGGACGAAATGAAGCGCAATATC 3 ACGTACCTGCTTTACTTCGCGTTATAG 编辑ppt34 猜测体探针只要有85的 碱基能和目的基因配对即可杂交。如连续的配对区较长(达1012Nt),那么猜测体探针作用的强度足以鉴定出含目的基因的阳性克隆。 如错配的核苷酸均匀分散在探针分子的各部位，那么这种猜测体探针就不会和目的基因的序列杂交。 提高杂交温度，以减少假阳性。编辑

23、ppt35(2)PCR猜测体技术 测定尿酸氧化酶末端一段32aa的序列； 根据此段顺序两侧的序列推测,合成一组引物； 从猪肝中提取mRNA,反转录成cDNA,用以上 述引物对此cDNA进行特异扩增。 扩增产物连接到载体上进行克隆，并用唯一猜 测体探针进行杂交，选择阳性克隆。此猜测体 探针是按32aa序列推导猜测而来的。 分离的克隆中部为上述32aa,两端为引物序列。 用这段插入序列为探针，在严格条件下筛选 噬菌体cDNA文库。编辑ppt36 32aa 尿酸氧化酶 猪肝 mRNA 以 32aa 两侧序列 为根据,合成两组 RT 简并引物 cDNA 用简并引物特异扩增猪肝的 cDNA 混合连接，克

24、隆 PCR 扩增产物 用猜测体探针 从重组质粒中切下 筛选阳性克隆 插入序列 以插入序列为探针 筛选 cDNA 文库编辑ppt37 五.应用差别杂交或 扣除杂交法分离克隆的目的基因(一)差别杂交(diffential hybridization)1.差别杂交要拥有两种细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，而另细胞群体中目的基因不表达。2.制备两种不同的mRNA提取物。一种含一定比例目的基因mRNA的总mRNA;另一种不含目的基因mRNA的总mRNA;3.通过这两种总mRNA为探针的平行杂交对目的基因cDNA克隆文库进行筛选。编辑ppt38 表达目的基因的细胞 不表达目的基因的细胞 RT

25、提取 mRNA cDNA 提取 mRNA 制备带有放射 重组到 制备带有放射 标记的 cDNA 探针 载体上 标记的 cDNA 探针 与影印的 NC 转染 E.coli 与影印的 NC 进行分子杂交 构成 cDNA 文库 进行分子杂交 影印 影印 放射自显影 放射自显影 比对 比对 筛选出含目的基因的阳性克隆编辑ppt39(二)扣除杂交 差减杂交的缺点： (1) 灵敏度低 (2)重复性差 (3)需用大量的杂交膜，工作量大，费时， 费钱 故可用扣除杂交来筛选，扣除杂交也可用来分析缺失突变基因编辑ppt40 野生型 DNA 缺失突变型 A B C A C 基因组 DNA 剪切 用生物素标记 A B

26、 C 过量 变性，退火杂交 A C B 过生物素柱 裹着生物素 的小磁珠 生物素柱 未结合的 DNA B B B 加接头，PCR 扩增 重组，转化，形成克隆库编辑ppt41(三).用差别显示分离克隆的目的基因 DDRTPCR (1) 从一对不同的组织或器官中分离总 mRNA,分别称为 A 组和 B 组， 并同时进行以下反应 mRNA 5 GCAAAAAAAAAAAAn 3 3 CGTTTTTTT 5 RT 酶 3 锚定引物(5 TnGC3 ) 5 GCAAAAAAAAAAAn 3 3 CGTTTTTTT 5 5 随机引物 3 CGTTTTTTT 5 3 锚定引物(5 TnGC3 ) 5 端随机

27、引物 放射性标记 dNTP 5 GCAAAAAA3 3 CGTTTTTTT5 编辑ppt42 A B A 组特有的条带 B 组特有的条带 A,B 共有但丰度不同的条带DDRTPCR编辑ppt43(四)用免疫的方法分离克隆的目的基因 1.用靶蛋白制备抗体 2.用这种抗体制备抗抗体，一扩大信号。 3.标记抗抗体； 4.进行免疫实验。编辑ppt44 噬菌体,粘粒 或质粒文库 影印到 NC 膜上 进行分子杂交或免疫反应 纯化噬菌斑和菌落 编辑ppt45 母板 影印到 NC 上 目的蛋白抗抗体 目的蛋白抗体 放射自显影的 X 光片 利用抗体筛选表达文库编辑ppt46六.筛选YAC文库 从理论上只要分离到

28、大量的基因组克隆，并构建它们的限制图就可鉴别出重叠的基因组克隆，进而构建出全基因组的物理图。 实际上是很困难的。 (1)重叠的片段多，重叠的长度不均衡；(2)工作量大； 一个标准的YAC文库插入片段的总和相当于58个基因组大小，则需约500个96孔板和相应数量的杂交膜。因此，一般采Locus- specfic PCR来筛选。用“ 集”(pool)为单位(相当于4块96孔板)或用“ 超级集”(相当与20块96孔板)逐轮筛选，逐步缩小筛选范围。编辑ppt47七.基因定位克隆 基因定位克隆 (map-based cloning)是用于分离未知结构的目的基因。 从理论上说，任何已鉴别的突变基因都可用这种方法分离出来。 条件是： (1)已建立含此基因的YAC文库