简论人β防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定

1、简论人b防御素4在大肠杆菌中的融合表达及其多克隆抗体的制备和鉴定【摘要】目的：构建人p防御素4 ( human p defensin 4, hbd4 )基因的原核融合表达载体pgex 4t 2/mhbd4,诱导gst hbd4融合蛋白在大肠杆菌中表达，并制备其多克隆抗体。方法：从重组克隆载体pmd18 t/hbd4中扩增hbd4成熟肽编码基因，并克隆入pgex 4t 2中，在iptg诱导下，表达gst hbd4融合蛋白。以表达的融合蛋白gst hbd4作为免疫原免疫家兔制备抗gst hbd4的抗血清，抗体效价及特异性分别用elisa和westernblot法鉴定。结果：在大肠杆中成功表达mr约

2、为3xxxx年家兔2只，选腹股沟和脊柱两侧为注射点，多点注射凝胶悬液进行免疫。首次剂量约为500 pg,其后加强免疫的剂量减半。于初次免疫后4周，加强免疫1次，此后每隔2周加强 免疫1次，共3次。末次加强免疫后的第10天，抽血，分离血清。1.2.5兔抗gst hbd4抗体效价的测定 采用间接elisa法检测抗 体效价。用裂解上清(含可溶性gst hbd4融合蛋白，浓度约为1.0 mg/l),包 被elisa板,49过夜。弃去孔内液体，用洗涤液(1xpbs,含0.5ml/l tween20) 洗涤3次，每次3 mine留取1孔加入100 pl稀释液作空白对照外，其余各孔 加入100 pl稀释的待

3、测抗体或未免疫兔的血清,379温育1 h（稀释液为1xpbs, 含0.5 ml/l tween20, 1 ml/l bsa）o洗涤后每孔加稀释的hrp羊抗兔igg 100 pl（1:1000稀释）作为二抗，379温育1 h,洗涤后每孔加100 pl新配制的dab 显色液，37°c温育20 min。每孔加50 pl2 mol/l h2so4终止反应后，读取a4901.2.6兔抗gst hbd4融合蛋白抗体特异性的western blot分析将 含有表达质粒pgex 4t 2/mhbd4的大肠杆菌dh5a的全菌蛋白，经 sds page分离，并转移至硝酸纤维素膜上，以50 g/l脱脂奶粉

4、于室温封闭1 h后，加入1:1000稀释的兔抗gst hbd4融合蛋白抗血清379温育1 h,以 tbst室温洗膜3次后，加入1:1000稀释的hrp标记的羊抗兔igg作为二抗同 上温育及洗膜，用dab显色试剂盒显色。2结果2.1pcr结果upmd18 t/hbd4质粒为模板,d1和d2为引物，pcr 反应扩增mhbd4 cdna,得到近170 bp的目的片段，与预期大小相符（图1）o图1 hbd4成熟肽编码基因的pcr扩增结果（略）fig 1 pcr amplification of mhbd4 cdna1: 100 bp dna ladder; 2: product of pcr ampl

5、ification.2.2原核表达载体pgex 4t 2/mhbd4的构建与鉴定用bamh i和 ecori对重组表达载体pgex 4t 2/mhbd4进行双酶切鉴定，与预期结果相 符（图2 ）测序结果表明，重组表达载体pgex 4t 2/mhbd4插入片段的序 列为预期的hbd4成熟肽的编码序列。图2重组质粒pgex 4t 2/mhbd4酶切鉴定结果（略）fig 2 identification of recombinant plasmid pgex 4t 2/mhbd4 by endonuclease digestion1: dna marker; 2, 3: recombinant pg

6、ex 4t 2/mhbd4 digestedby bamh l/ecor i; 4: recombinant pgex 4t 2/mhbd4 without digestion.2.3融合蛋白gst hbd4的诱导表达及表达形式分析将重组表达载体pgex 4t 2/mhbd4转入大肠杆菌dh5c（中，通过iptg诱导表达目的蛋白。表达产物行sdspage结果显示，可见有新生蛋白条带出现，表达量为体总蛋白的20%30%, mr约为3xxxx年jose ramon对人染色体8p23的 基因序列图谱分析时发现一种新的0防御素。hbd4cdna216bp开放读框编 码72个氨基酸的前肽、50个氨基酸的

7、成熟肽。国外研究表明，hbd4对金黄色葡萄球菌、肉葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等具有抑制和杀灭作用，特别是绿脓杆菌杀伤作用更强，是已知其他防御素作用的6倍。hbd4表达于睾丸、 胃窦、子宫等各种黏膜细胞和上皮组织，与hbd3、溶菌酶有协同作用,是单核 细胞的趋化物4。因此hbd4对人体各个系统的先天免疫尤其是黏膜和上皮的 防御起非常重要的作用。因而建立hbd4的原核表达系统，在大肠杆菌中大量表 达hbd4,以及制备其相应的抗体，从蛋白质水平检测hbd4的表达就十分重 要。我们利用pcr方法扩增出hbd4成熟肽编码序列mhbd4 cdna,并 重组于gst融合蛋白表达载体pgex 4t 2中，经

8、鉴定gst hbd4融合蛋 白在大肠杆菌中获得高效表达。以表达gst hbd4融合蛋白作为抗原免疫家 兔，获得了具有较高抗体滴度及特异性的gst hbd4融合蛋白多克隆抗血清。 gst hbd4融合蛋白的表达及其多抗制备的成功，不仅克服了防御素多肽对宿主细胞的毒性作用，可以方便地利用凝血酶切去其中的gst部分来获得hbd4纯品7,为进一步研究hbd4的生物活性及临床应用奠定基础；而且融合蛋白本身也可增强hbd4免疫原性，避免了应用传统方法制备抗血清时hbd4 来源困难、成本高的缺点。由于表达的gst蛋白是血吸虫蛋白抗原sj26 (schistosoma japonicum, mr26000),

9、与人体内的gst有较远的亲缘关系，因此 通过gst融合蛋白制备的抗血清就与人体内的gst没有交叉反应8,因此本研 究获得的gst hbd4多克隆抗体可用于hbd4的组织分布的检测，用于hbd4 基因表达调节的实验研究。【参考文献】1 fellermann k, stange ef. defensin innate immunity at theepithelial frontierj. eur j gastroenterol hepatol, 2001, 13(7): 771-776.2 傅海燕，张 剑，路 凡，等.人a防御素的融合表达、纯化及生物活性分析j.细胞与分子免疫学杂志，2006,

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