血液检验的一般检验技术(第一次)

1、第一章 血液检验的一般检验技术实验一 血液标本采集一、 皮肤采血法【目的】 掌握皮肤采血法（collection of skin puncture blood），了解不同部位采血对检验结果的影响、【原理】 采血针刺破毛细血管后血液自然流出，用微量吸管吸收一定量的血液。【器材】1.一次性消毒采血针（图1-1）。2. 20l微量吸管（应校准后使用）或一次性微量吸管、胶乳吸头。3.试管、试管架。42ml吸管、吸耳球。5. 75%（V/V）乙醇脱脂棉球或碘酊脱脂棉球。6.无菌干脱脂棉或滤纸。【试剂】1. 洗涤液3管（蒸馏水、95%乙醇、乙醚）。2. 生理盐水。3. 75%乙醇或碘酊。【标本】末梢血【操

2、作】1. 准备材料 仔细阅读患者申请单，决定采血量。准备每个试验所需的试管。例如取试管1支，加入2ml生理盐水。取微量吸管与胶乳吸头相连，检查连接处是否漏气，或取一次性微量吸管备用。2. 选择采血部位 婴幼儿选择足跟采血，其他患者选择第三、四手指或耳垂（图1-2）。3.按摩皮肤 轻轻按摩皮肤或用热毛巾温暖皮肤，使局部自然充血。4.消毒皮肤 用75%乙醇脱脂棉球或碘酊脱脂棉球擦拭采血部位的皮肤，待干。 5.针刺皮肤 用左手拇指和示指固定采血部位使其皮肤和皮下组织绷紧，右手持一次性消毒采血针自指尖内侧迅速刺入（图1-3），深度23mm，立即出针。6.拭去第1滴血 待血液自然流出或稍加压力流出后，用

3、干脱脂棉擦去第1滴血。7. 吸血 血液自然流出时，用微量吸管吸血至10l刻度，然后用干脱脂棉压住伤口止血。如血流不畅，可以用左右自采血远端想指尖稍施压，使血液流出。8. 止血 采血完成后，用干脱脂棉压住采血部位进行止血，若有可能，贴上创可贴。9.稀释血液 用干脱脂棉擦净微量吸管外部后，将吸管伸入装有生理盐水的试管底部，慢慢排出吸管内的血液，并用上清液冲洗管内余血3次。【注意事项】1.采血前准备 在采集标本前，应使被检者尽量保持平静，减少运动。住院患者应尽量在早晨卧床时采血。尽量避免药物及饮食对检验结果的影响。在进行多项检查室，采集血液标本的顺序是血小板计数、红细胞计数、血红蛋白测定和白细胞计数

4、与分类。2. 选择采血部位 所选择采血部位的皮肤应完整，无烧伤、冻疮、发绀、水肿或炎症等。半岁一下婴幼儿由于手指小，可自拇指、足趾或足跟内、外侧缘采血；严重烧伤者可选皮肤完整处采血。 3. 消毒皮肤 因本实验具有创伤性，必须严格按无菌技术操作，防止采血部位感染，做到一人一针一管，避免交叉感染，最好用一次性采血针，皮肤消毒后，应待乙醇或碘酊挥发后采血，否则流出的血液不易成滴。 4. 针刺皮肤 进、出针要迅速，伤口要有足够深度。 5. 拭去第一滴血 因第一滴血混有组织液，应擦去。如血液不畅切勿用力挤压，以免造成组织液混入，影响结果的准确性。如采血用于自动血液分析仪，最好以优质无菌纸巾擦血，以免棉纤

5、维混入，造成仪器堵孔。 6.吸血与检测 微量吸管应定期进行校准，容量误差1%。血液充入管内的速度不宜过快，避免出现气泡，血液弯月面达到刻度线处即可。标本采集后应及时测定，最好在2h内完成，不宜在冰箱内存放。 实验二 改良牛鲍计数板的使用 【目的】 掌握改良牛鲍计数板（improved Neubauer hemocytometer）的使用方法。 【原理】 一定倍数稀释的血液或体液，混匀后滴入具有固定体积和精密划分刻度的改良牛鲍计数板中，在显微镜下对所选择区域中的细胞进行计数，再乘以稀释倍数，即可换算成单位体积内的细胞数。 【器材】1. 改良牛鲍计数板及盖玻片 改良牛鲍计数板为优质厚玻璃制成。每块

6、计数板由“H”型凹槽分为2个同样的计数池（图1-8）。计数池两侧各有一条支持柱，较计数池平面高出0.10。将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10的计数池。计数池内划有长、宽各3.0的方格，平均分为9个大格，每个大格面积为1.0平方毫米，容积为0.1立方毫米（l）。在这9个大格中，中央大方格用双线分为25个中方格，其中位于正中及四角的共5个中方格是红细胞、血小板计数区。每个中方格又用单线分为16个小方格。位于四角的4个大方格是白细胞计数区，它们分别用单线划分为16个中方格（图1-9）。2. 试管、试管架。3. 吸管、吸耳球。4. 微量吸管、胶吸头、干脱脂棉。5. 绸布。6. 玻棒。 7. 显

7、微镜。【试剂】1. 白细胞稀释液。2. 红细胞稀释液。【标本】 抗凝血【操作】1.准备计数板 先用流水冲洗计数板和盖玻片除去所有残留物，然后用乙醇洗涤，最后用绸布拭净，采用推压法从计数板下缘向前平推盖玻片，将其盖在计数池上。 2. 稀释血液 取试管2支，标明A、B，分别家白细胞稀释液0.38ml、红细胞稀释液2ml。再各加抗凝血20l、10l，混匀备用。 3.充池 充分混匀A液 23min，用微量吸管或玻棒将稀释血液滴入计数板和盖玻片交界处，利用虹吸作用让液体顺其间隙充满计数池；再取B液，以同样方法在另一侧计数板充池。 4. 静置计数板 充池后应平置于桌面上静置3min,待细胞下沉。 5. 计

8、数 先用低倍镜（10倍目镜和10倍物镜）观察，通过调节显微镜光栅减少光线进入量以便观察整个计数板的结构（大、中、小方格）及特征，同时观察血细胞分布是否均匀。在充A液的计数池观察白细胞计数范围，在充B液的计数池用高倍镜（10倍目镜和40倍物镜）观察红细胞计数范围（图1-10）。 6. 计数原则 须遵循一定的方向逐格进行（图1-10），以免重复或遗漏。对压线的细胞采用数左不数右，数上不数下的原则（图1-11）。记录所数5个中方格的红细胞数和4个大方格的白细胞数。 【注意事项】1. 计数板 （1）保证计数板和盖玻片清洁：操作中勿让手指接触计数板表面，以防污染，致使充池时产生气泡。如使用血液充池，计数

9、板和盖玻片使用后应依次用95%（V/V）乙醇、蒸馏水棉球擦拭，最后用清洁纱布揩净。千万无用粗糙织物擦拭，以免磨损计数板上的刻度。（2） 当盖玻片盖在计数板上时，若两层玻璃之间见到彩色条带（Newton环），说明计数板和盖玻片清洁良好，否则应重新清洁计数板和盖玻片。（3） 改良牛鲍计数板在启用前后每隔1年都鉴定1次，以防不合格或磨损而影响计数结果的准确性，鉴定内容是：盖玻片检查：包括厚度和平整度。厚度检查使用千分尺对盖玻片的厚度进行多点测定，最少测9个区，每区测2点，要求区域间厚度差<2m；平整度检查使用平面平晶仪检测盖玻片两表面的干涉条纹，其条纹细密均匀或微量弯曲即为符合要求；计数池深度

10、：将微米级千分尺尾部垂直架在计数板两堤上，移动尾部微米级千分尺，多点测量计数池的高度误差应在±2%（±2m）以内。2. 充池 一次完成充池，如充池过少、过多、有气泡或出现任何碎片，应拭净计数板及盖玻片后重新操作。3. 静置计数板 平放计数板，不能在充池后移动盖玻片。白细胞和红细胞计数一般需沉淀23min,血小板应沉淀1015min，血小板应沉淀1015min,且需注意保湿，因沉淀时间过长会因稀释挥发造成计数结果不准确。4. 计数 计数板中细胞如果严重分布不均，应重新充池计数。计数红细胞和血小板用高倍镜，计数白细胞用低倍镜。5. 计数原则 凡压线的细胞应按照数上不数下，数左不

11、数右的原则，避免漏数或重复计数。注意识别非细胞成分。 实验三 红细胞计数【目的】掌握显微镜红细胞计数（red blood cell ,RBC）的原理及操作方法。【原理】用等渗稀释液将 以一定倍数（200倍）稀释并充入计数池，在显微镜下计数一定区域的红细胞数量，经换算求出每升血液中的红细胞数量、【器材】1. 试管、试管架。2. 2ml吸管、吸耳球。3. 微量吸管、胶乳吸头、干脱脂棉。4. 玻璃棒。5. 改良Neubauer计数板、盖玻片、绸布。6. 显微镜。【试剂】红细胞稀释液：无水硫酸钠2.5g，氯化汞0.5g，氯化钠1.0g，加蒸馏水至200ml。溶解后加20g/L伊红溶液1滴，过滤后使用。

12、【标本】EDTA-K2抗凝静脉血或末梢血。【操作】1.加稀释液 取小试管1支，加入红细胞稀释液2ml。2.采血及加血 用清洁干燥微量吸管采集末梢血或抗凝血10ul，擦去管外余血，轻轻加至红细胞 底部，再轻吸上层清液漱洗管23次，以洗净管腔内德残留血液，立即混匀。3.充池 充分混匀后用微量吸管或玻璃棒将红细胞悬液充入计数池，室温下平放23min，待细胞下沉后于显微镜下计数。4. 计数 用高倍镜依次计数中央大方格内4角和正中5个方格内的红细胞数。5. 计算 红细胞数/L=N××10×201×106N×1010=×1012【参考值】【注意事

13、项】1.器材 均须清洁干燥。盖玻片、计数板、微量吸管应符合质量要求。2.试剂 红细胞稀释液应等渗、新鲜、无杂质。3.标本 推荐EDTA-K2抗凝剂，浓度为1.52.2mg/ml血液。4.稀释液及稀释倍数。（1）稀释液要过滤，以免杂质、微粒被误认为细胞。（2）如无上述稀释液时，也可用新鲜配制的等渗盐水代替。 (3)下列原因可造成稀释倍数不准确：稀释液和（或）血液加样量不准确；吸血时吸管内有气泡；未擦去吸管外余血；血液加入稀释液后，吸管带出部分稀释血液；稀释液放置时间过长，蒸发浓缩。（4）红细胞数量明显增高时可适当加大稀释倍数；反之，则适当减少稀释倍数，稀释倍数可通过改变稀释液加样量和（或）血液加

14、样量进行适度调节。5.采血（1）不能过分挤压采血部位，针刺深度必须适当。采血应顺利、准确，采血部位不得有水肿、发绀、冻疮、炎症等。采血速度不应过慢，否则容易造成血内有凝块，导致细胞减少或计数分布不均。如出现凝块，则应重新采血，并应充分混匀血液和抗凝剂，且在充池前再次混匀。（2）被检者应从直立位换成坐位15min后才采血。坐位采血较仰卧位15min后采血的红细胞计数值高5%10%；剧烈运动后迅速采血可使红细胞计数增加计数增加约10%；静脉压迫时间超过2min会使红细胞计数平均增高10%。6 充池 将细胞悬液注入改良Nebubauer 计数板的过程称为充池。充池前应将细胞悬液充分混匀，但要防止因剧

15、烈震荡而破坏红细胞。将细胞悬液充入计数池时要一次完成，不能产生满溢、气泡或充池不足的现象。7. 计数（1）大小方格脮压线细胞的计数遵循数上不数下、数左不数右的原则，避免多数或漏数。（2）红细胞在计数池中若分布不均要重新充池计数。在参考范围数值内，2次红细胞计数相差不得超过5%。（3）血细胞在充入计数室后呈随机分布或称Poisson 分布（S=），造成分布误差或计数域误差。根据cv= 1/m ×100%推断，欲将红细胞计数误差控制在变异百分数5%以内，至少需要在计数室中计数400个红细胞，因此要求计数5个中方格的红细胞。（4） 经红细胞稀释液处理后，白细胞和红细胞同时存在，通常红细胞计数时已包含白细胞。在一般情况下，外周血中白细胞数