磁珠法分离纯化DNA原理及其步骤

1、日期：2012-05-22来源：互联网标签：核酸纯化核酸分离磁珠法纯化DNA摘要：磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和蛋白质等其细胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分离与纯化的步骤。欢度大力神杯之夏，参与BRAN竞猜活动，获赠BRAN产品！GeneCopoeia qPCR mix免费试用体验活动开始！磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和 蛋白质等其细 胞中其他物质分离。本文主要概述了磁珠法纯化 DNA原理、核酸分离与纯化的原则、核酸分 离与纯化的步骤。磁珠法纯化DNA原理磁珠法核酸纯化技术采用

2、了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。硅磁(Magnetic Silica Particle) 就是指磁珠微珠表面包裹一层硅 材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料 (如DEAE COOH等，从而达到吸附核酸目的。不同性质的磁 珠微珠所对应的纯化原理是不一致。使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。Omega拥有全面的磁珠法核酸分离 试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有Mag - Bi nd '。核酸

3、分离与纯化的原则核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。在分离核酸时应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性：排除其他分子污染。核酸分离与纯化的步骤大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。1. 细胞裂解：核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。(1) 机械作用：包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎 ，但

4、机械力也可引起核酸链的断裂，因而不适用于高分子量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp> 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般 < 10kb。(2) 化学作用：在一定的p H环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS Triton X-100、Tween 20、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等） 或强离子剂 （异硫氰酸胍、 盐酸胍、肌酸胍 ） 而 获得。而 p H 环境则由加入的强碱 （NaOH） 或缓冲液 （ TE、STE 等） 提供。在

5、一定的 p H 环 境下 , 表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、 蛋白质和多糖沉淀 , 缓冲液中的一些金属离子螯 合剂（ EDTA 等） 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+ 、Ca2+ , 从而抑制核酸酶的活性 ,保护核酸不被降解。（3）酶作用：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶（蛋白酶K植物蛋白酶或链酶蛋白酶）以使细胞破裂 , 核酸释放。 蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质 , 促进核酸的分离。 其中溶菌酶 能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的3 -（1 ,4）键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键，其在65 C及有EDTA尿素（14mol/L） 和去污剂（0. 5

6、 %SDS或 1 %Triton X-100）存在时仍保留酶活性，这有利于提高对高分子量核酸的提取效 率。在实际工作中 , 酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。具体选择哪种或哪几种方 法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。2. 酶处理 ： 在核酸提取过程中 ， 可通过加入适当的酶使不需要的物质降解 ， 以利于核酸 的分离与纯化。如在裂解液中加入蛋白酶 （蛋白酶 K 或链酶蛋白酶 ） 可以降解蛋白质 ，灭活 核酸酶 （DNase 和 RNase） ，DNase 和 RNase 也用于去除不需要的核酸。3. 核酸的分离与纯化 ： 核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等

7、其他生物大分子物质更具亲水性 ， 根据它们理化性质的差异 ， 用选择性沉淀、 层析、密度梯度离心等方 法可将核酸分离、纯化。（1）酚提取/沉淀法：核酸分离的一个经典方法是酚：氯仿抽提法。 细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇 （25 : 24 : 1体积）混合液。依据应用目的 ， 两相经漩涡振荡混匀 （适用于分离小分子量核酸 ） 或简单颠倒混匀 （适用于分离高分子量核酸 ） 后离心分离。 疏水性的蛋白质被分配至有机相 ，核酸则被留于上 层水相。酚是一种有机溶剂 ， 预先要用 STE 缓冲液饱和 ， 因未饱和的酚会吸收水相而带走一 部分核酸。酚也易氧化发黄 ， 而氧化的酚

8、可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联： 故在制备酚饱和液时要加入 82 羟基喹咛 ， 以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪 ， 使更多蛋白质变 性， 从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。核酸盐可被一些有机溶剂沉淀 ， 通过沉淀可浓缩核酸 ， 改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。 典型的例子 是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀 ，在含核酸的水相中加入 p H5. 05. 5 ，终浓度为 0. 3M 的 NaOAc 或 KOAc 后， 钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷， 在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入 22. 5 倍体积的乙醇 ， 经一定时间的孵育 ， 可使核酸有效

9、地沉淀。其他的 一些有机溶剂 异丙醇、聚乙二醇 （ PEG） 等和盐类 （10. 0mol/ L 醋酸铵、 8. 0mol/ L 的 氯化锂、 氯化镁和低浓度的氯化锌等 ） 也用于核酸的沉淀。 不同的离子对一些酶有抑制作用 或可影响核酸的沉淀和溶解 ， 在实际使用时应予以选择。经离心收集 ， 核酸沉淀用 70 %的乙 醇漂洗以除去多余的盐分 ，即可获得纯化的核酸。 （2） 层析法：层析法是利用不同物质某些理 化性质的差异而建立的分离分析方法。 包括吸附层析、 亲和层析、 离子交换层析等方法在内 的层析法。 因分离和纯化同步进行 ， 并且有商品试剂盒供应 ， 而被广泛应用于核酸的纯化。 在 一定

10、的离子环境下 ，核酸可被选择性地吸附到硅土、 硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。另外一些选择性吸附方法以经修饰或包被的磁珠作为固相载体 , 磁珠可通过磁场分离而无需 离心,结合至固相载体的核酸可用低盐缓冲液或水洗脱。该法分离纯化核酸 , 具有质量好、 产量高、成本低、快速、简便、节省人力以及易于实现自动化等优点。玻璃粉或玻璃珠被证实为一种有效的核酸吸附剂。在高盐溶液中 , 核酸可被吸附至玻璃基质上 , 离液盐碘化钠或高氯酸钠可促进DNA 与玻璃基质的结合。 Dederich 等用酸洗玻璃珠分离纯化核酸，获得高产量的质粒 DNA在该方法中，细胞在碱性环境下裂解，裂解液用醋 酸钾缓冲液中和后 ,

11、直接加至含异丙醇的玻璃珠滤板 ,被异丙醇沉淀的质粒 DNA 结合至玻璃 珠， 用 80 %乙醇真空抽洗除去细胞残片和蛋白质沉淀。最后用含RNase A 的 TE 缓冲液洗脱与玻璃珠结合的 DNA ，获得的 DNA 可直接用于测序。Elk in等使用羧化磁珠分离纯化质粒DNA该法在细胞裂解后，离心分离含质粒的水相，再加入羧化的磁粒 ，然后用 PEG/ NaCl 沉淀，使目的 DNA 吸附至磁珠 ，最后磁场分离被吸附 的 DNA ，经乙醇洗涤 ，用水洗脱 ，可获得高产量的适用于毛细管测序的模板DNA。也有用铁粒为固相支持物 ， 经磁场分离而纯化质粒 DNA 的报道。细菌用溶菌酶 2 煮沸法 裂解

12、， 质粒被释放至悬浮液中 ， 加铁珠捕获 ， 用磁场使铁珠分离 ， 经漂洗后用水洗脱质粒 ， 可 获得高产量、测序级的质粒 DNA。亲和层析 是利用待分离物质与它们的特异性配体间所具有的特异性亲和力来分离物质 的一类层析方法。 Chandler 等报道了一种用肽核酸 (PNA) 分离核酸的方法。 PNA 是一类以 N-(2- 氨乙基 )2 甘氨酸结构单元为骨架的 DNA 类似物 ， 可作为纯化皮克 (pg) 级核糖体 DNA ( rDNA) 和核糖体 RNA ( rRNA) 的试剂。在该方法中 ， 以生物素标记的肽核酸 (peptide nucleic acids ，PNAs) 为探针 ， 以

13、包被了抗生蛋白链菌素的磁珠作为固相载体。 PNA 探针在 高盐环境下 ， 与目的核酸 (DNA 或 RNA) 混合，经煮沸、冰浴、温育杂交步骤后 ，直接加入包 被了抗生蛋白链菌素的顺磁性颗粒，经静置捕获PNA核酸杂交体，水洗而获得纯化的核酸。Schluep 等亦基于亲和层析原理 ， 采用一种三螺旋体 DNA 的方式进行质粒 DNA 的分离。 三螺旋体 DNA 由同质嘌呤2同质嘧啶双螺旋链与同质嘧啶单链组成，单链上的T识别A T碱基，对形成T A T三联体，质子化的单链胞嘧啶 (C+ ) 识别G- C碱基对形成 C G- C三联体。 在适当的条件下 ， 三螺旋体的结合具有高特异性和高稳定性。将配

14、体聚嘧啶寡核苷酸链通过 化学方法连接至 Sephacryl S21000 SF颗粒上形成亲和载体。当含目的序列的质粒DNA溶液与其混合时，在酸性环境(p H 4. 55. 5)下,质粒结合至亲和载体颗粒上，溶液中高浓度 的NaCI可稳定三联体形式并减少与蛋白质、 细胞DNA的非特异性结合。经一段时间反应后， 颗粒悬浮液被加至一层析柱 ， 用适当的洗脱液改变 p H 值至碱性环境 ， 可使三联体解聚 ， 质粒 被洗脱。经该法分离质粒 DNA ，质粒产量可达到加入量的 62 %。也有用Schizophyllan ( SPG)制备亲和层析柱分离纯化RNA的报道。SPG是一种3 21 ,32葡聚糖，在

15、低温下，含RNA的流动相通过层析柱,Poly (C) 和poly (A) 与SPG通过氢键和疏水作用形成复合物而被吸附于柱上 , 然后通过改变缓冲液成分 , 将被吸附的 RNA 洗脱。亲和层析应用于核酸分离与纯化的另一个例子是用 oligo ( dT)2 纤维素层析法从真 核细胞总RNA中分离带poly (A) 尾的mRNA在该方法中，短链oligo (dT) 通过其52磷 酸与纤维素的羟基共价结合而连接至纤维素介质上。当样本经过oligo (dT) 柱时 ,mRNA 因其poly (A)可与短链oligo (dT) 形成稳定的RNA2DNA杂合链，而被连接到纤维素介质上，从而与其他 RNA

16、分离。在适当的条件下 (低盐、加热 ) ，poly (A) RNA 可被水洗脱而得以纯 化。离子交换层析 以具有离子交换性能的物质为固定相 ， 其与流动相中的离子能进行可逆 交换 ， 从而能分离离子型化合物。用离子交换层析纯化核酸是因为核酸为高负电荷的线性多 聚阴离子 ， 在低离子强度缓冲液中 ， 利用目的核酸与阴离子交换柱上功能基质间的静电反应 ， 使带负电荷的核酸结合到带正电的基质上 ， 杂质分子被洗脱。然后提高缓冲液的离子强度 ， 将核酸从基质上洗脱 ， 经异丙醇或乙醇沉淀即可获得纯化的核酸。该法适用于大规模核酸的 纯化。 Ferreira 等用含 0. 5 M NaCl 的 TE 缓冲液平衡层析柱 ，加样后用含 1 M NaCl 的 TE 缓冲液洗脱核酸 ， 获得了很好的分离效果。(3)密度梯度离心法：密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链DNA单链DNARNA 和蛋白质具有不同的密度 ， 因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带 ， 该 法适用于大量核酸样本的制备 ，其中氯化铯 2 溴化乙锭梯度平衡离心法被认为是纯化大量