猪球虫与球虫病研究进展

1、猪球虫与球虫病研究进展sunshine猪球虫与球虫病研究进展蔡建平、谢明权、覃宗华(广东省农业科学院兽医研究所，广东广州510640)猪球虫病是由猪等电球虫(isospara suis)和某些艾美耳属(eimcria)球虫寄生于哺乳 期及新近断奶的仔猪小肠上皮细胞所引起的以腹泻为主要临床症状的原虫病，在成年猪 群，虽冇球虫寄牛:，但一般不引起临床表现，多呈带虫现象，而成为木病的传染原，尤其 是母猪带虫，常'引起一窝仔猪同时或先后发病，或引起死亡，引起较大的经济损失。近年 來，该病在欧、美、澳、东南亚国家和地区流行严重，引起兽医寄生虫学考的充分关注， 在病原学、流行病学、免疫学等方而取得

2、了不少进展。1病原生物学1.1猪球虫的种类猪球虫最早报道于1878年，由zurn和rivalta首先发现，但未作具体的描述和分类命 名1。douwes (1921)也曾描述过从猪粪便中分离的肠球虫，但未予命名；次年该氏描 述并命名了猪的蒂氏艾美耳球虫(e. debliecki) lo自此z后寄生虫工作者先后报道并 命名了 15种艾美耳球虫和2种等抱球虫(pelllerdy, 1974)1，但其中至少有5种艾美耳球虫和1种等砲球虫的有效性值得怀疑，仍有待研究 2。目前根据不同国家和地区猪球虫病的流行病学调杳结果，人多数学考比较认可猪球 虫的有效种计有艾美耳属8种和等抱属1种,即粗糙艾美耳球虫(e

3、. scabra),光滑艾美 耳球虫(e. poll ta)，极细艾美耳球虫(eperminuta),蒂氏艾美耳球虫(e. debliecki),猪 艾美耳球虫(e. suis),种猪艾美耳球虫(e. porci)、有刺艾美耳球虫(e. spinosa), 新蒂氏艾美耳球虫(e. neodebliecki)和猪等砲球虫(1. suis)2o据snith称，在欧洲，上述猪球虫中比较常见的是isuis、e. debliecki >e. scabra3。而据daugschies等对大多数文献报道的分析，上述各种球虫除e. neodebliecki外,在欧洲都很普遍,尤其是i. suis,常在种

4、猪场的仔猪群中引起疾病 流行4；但koudela等在捷克的调查认为，e. neodebl iecki这一山种广泛存在，且有较 强致病力，可引起临床型腹泻5。由于猪艾美耳球虫生活史的潜隐期和他子化时间较 氏，种内形态变异较大，等砲属和艾美耳属的非孑包子化卵囊形态种间差异不大等特点，出 现这些差并并不奇怪。12猪球虫的生活史迄今为止，在猪球虫中，仅只有i. suis、e. debliecki、e. scabra、e. spinosa和 e. neodebliecki 5种的生活史得到实验研究，对其它4种艾美耳球虫的生活史过程还不详细了解。一般而言，猪艾美耳球虫的潜隐期多在10-14日间，排卵囊持续

5、期(明显期)也 长达6-10 el在2. 5%重锯酸钾溶液中于25°c抱子化时一般也需10天以上。据调查, 从新鲜猪粪便中分离的7种艾美耳球虫卵囊(未发现e. neodebliecki)在1. 25%的重銘酸 钾溶液中于30°c通氧孵化，12天时冇97%的卵囊完成砲子化。但猪等砲球虫的潜隐期较 短，为4-6天，明显期为3-13天，卵囊的体外孑包子化时间为3-5天。现以 e. neodebliecki的生活史为例说明猪艾美耳球虫的生活史5。e. neodebliecki的卵囊为椭圆形或卵圆形，卵囊壁双层，无色，外层光滑，无微孔。他 子化卵囊大小为19. 8x15. 2 (17

6、-24x14-18)刚，无卵囊残体,有极粒。抱子囊长卵圆形, 有明显的斯氏体和砲了囊残体，砲了囊大小为sunshinesunshine13. 1x6. 1 (12-14x5-7) mm。在2. 5%重锯酸钾中于25°c孑包子化需时10-12天，而在20°c 时则需16犬才能完成孑包子化。其内工性发育是距回盲口 50-300cm处的中后段空肠肠绒毛 上皮细胞内进行的。口服感染e. neodebliecki 25x104砲子化卵囊后5天时，首先在后段 空肠的组织切片中，于肠隐窝处的肠细胞内出现未成熟的单核裂殖体，呈球形，位于宿主 细胞核上方的顶端胞质中，大小为1.5-3 mm,

7、每个细胞内可达5个裂殖体，至第7天时， 对见到球形的成熟裂殖体，沿周边分布有10-18个核，至第8天裂殖体增殖至最人，含 12-20个新月形的裂殖子，此时刮取肠粘膜涂片进行显微镜检查，可见到大小为8. 1x1.0- 1.5如的裂殖子。至第9天，开始出现未成熟的大配子体(3-5刚)，第10天时，裂殖生 殖仍在进行，但已冇合子形成，此时的组织切片上可见到8%的耒成熟的裂殖体，13%的未 成熟的大配子体，59%的成熟大配子体，16%的正在发育的小配子体和4%卵張。在he染色 切片上，成熟人配子的特征是胞质屮含水量多量嗜伊红颗粒。在成熟的小配子体屮小配子 呈现周边分布，中央冇一 8t0阳大小的残体。1

8、1t2天时仍冇少量冇性期虫体，至14天 时在肠切片上再也未见内生性各阶段虫体。感染后10天时，粪便中对查到卵囊，排卵囊 持续期6-8天，排卵囊高峰期为感染后第10天(48 065±21 789 0pg)和11天(34 445±32 026 0pg)。临床症状显示期为第8-11天。尽管在这一研究中只发现一代裂殖 体，但所见到的裂殖体很可能是第二代裂殖体，因为感染后第5-6天时球形单核的裂殖体 大量出现，表明此z前应存在第一代裂殖生殖，只不过出于数量较少，而在组织节片或粘 膜涂片上未能发现而已。1.3猪球虫分类的一些进展猪球虫的分类也主要是依据卵囊的形态人小及结构、潜隐期和砲了

9、化时间、寄生部位等 特性來进行。但这种分类方法对研究者的个人经验及技能有很人依赖，h猪艾美耳球虫和 等胞球虫及各种艾美耳球虫间的未砲子化卵囊差异很小，需进行较长时间的砲子化后才能 进行分类，使猪艾美耳球虫的分类比较因难，近年來，借助于计算机辅助的数值分类法和 以pcr法为基础的分子生物学分类法己开始用于猪球虫的流行病学调查，取得一定进展。根据已报道的猪的7种艾美耳球虫(不包括e. neodebliecki)卵囊形态特征， daugschio等6将卵囊色泽和卵囊形态数值化，在色泽凶子(cf)中，设定卵囊壁无色者 数值为t。黄色者为1,褐色考为5,黑褐色为&在形状因子(sf)屮将亚球形，球

10、形， 椭圆形或圆形设为-1,卵圆形或不对称形设为1,以德国莱卡公司的计算机辅助图像分析 系统用莱卡显微镜1000倍下测处卵囊和孑包子囊的长、宽值，首先根据卵囊壁外层的光滑 度及有无微孔存在将混合种卵囊分为3组后，再根据卵囊长度(1。)形状因子(sf)色泽 因子(cf)泡子囊长度(is)、沦子囊宽度(ws)、泡子囊形状指数(sp=ls/ws),用excel7. 0和windowsspss软件进行分析和数值分类，以u检验法进行统计处理（种间差民 显著的p值应小于0.05）,并与传统的分类方法进行比较。结果表明，用该法nengl対该 次调查中粪便中存在的所有7种艾美耳球虫卵囊进行准确分类。根据数据库

11、中卵囊壁外层 的光滑度将猪粪便中的混合卵囊分成的3组中，第1组卵囊壁粗糙，包括e. perminuta.e. polita> e. scabra 3种再依拯lo、sf和cf等参数进行数值分类，可将这3种球虫准 确分类至种。e. perminuta总能准确分类（100%）,而对e. polita e. scabra则有1%- 3%的错误分类率。第2组卵囊具有黄色或褐色粗糙卵喪壁并带有明显针刺样构造，此时不 需要其它参数，对直接分类至单一种e. spinosa,第3组卵囊的壁光滑，包括e. deblieckix esuis、e. porci,需先行抱子化后再根据sf、cf、lo和抱子囊形状指

12、数 进彳亍数值分类，结果100%的e. debliecki可准确分类，e. suis s unshinesuns h i n e和e.porci的准确率也达93%。在这一分类方法的实际应用中，对这7种球虫子的准确 率总体达到98.9%。稍后plite等又在此基础上进行了改进，使整个分类过程实现半口动 化，达到了方便、快速、准确，用少量卵囊即可进行球虫种流行病学调查的目的6。这种以形态为基础，借助于计算机技术进行的数值分类方法，虽然可避免传统分类方法 的一些缺陷，但仍较为费时，需拍摄许多幅单-卵張的照片，11对光滑型卵張的球虫子种需 用先行他子化，具实用性受到一定限制。近來，ruttkowski

13、7等根据球虫18s rdna序列 中高度保守区序列设计了两个引物（api和19）进行pcr扩增，结果在所研究的3种球虫 （e. polita> e.porci、e. scabra）扩增出长度分别为 1 318 bp （前两种）和 1 316 bp （后考）的dna片段，三考间的相互差异仅为2%,与i. suis的相应扩增产物分别有87% （e. polita）和86% （e. scabra和e.porci）相吻合。经对扩增关产物测序,发现其种间 序列变异主要在680-770bp和1 070-1 100bpz间，以此间序列为基础分别构建成了 e. polita、e. pore is e.

14、scabra 和 t. suis 的特异性正向引物（20-23bp） , pcr 扩增后, 在e. porci形成330bp的扩增产物，而在其它3种则产生560bp的产物。在针对这4种球 虫特异性引物中,除e. scabra和scab-1与e. porci有交叉反应外，其余引物者都有是种 特异性的，能根据从猪粪便中的新鲜卵囊（无需抱子化）所提取的dna将球虫方便地鉴定 至种。理论上计算，仅需250个艾美耳球虫了卵囊和25个等砲球虫卵龚即可进行准确分 类;且该法可用于对卵囊或砲子囊结构已冇损伤或氏时间保存的陈旧性卵囊进行精确分 类。而在猪等砲球虫子，同样以18s rdna的pcr产物进行多态性分

15、析和聚类分析后发现， 有斯氏体或无斯氏体的不同种等抱球虫差异较大，在无斯氏体的等砲球虫18s rdna与肉 他子虫科成员间同源性更大-些，而有斯氏体者则与艾美耳科由源性较人，因此有人建议 在系统分类上，i. suis （无斯氏体）应归于肉孑包子虫科（sarcocystidae） 18 o2致病性和流行病学1. 1猪艾美耳球虫过去，一般认为l.suis的致病力较强，常可引起哺乳仔猪的严重腹泻，而艾美耳球虫 的致病菌力较弱。但近年来的流行病学调查和试验研究都表明，猪的艾美耳球虫病实际上 普遍存在，即使是在亚临床状态，其损失也可能是很大的。猪的数种艾美耳球虫（如 e. polita、e. scabr

16、a、e. debl iecki> e. suis> e. spinosa 和 e. neodebliecki 都可在乳猪和断奶后仔猪引起发热、腹泻、体重降低、食欲下降等症状5 ,9, 10,11,12, 13, 14o以 25x104e. neodebliecki砲子化卵囊接种18只30日龄仔猪,结果在感染后8-11天间出现 严重腹泻，粪便呈现粘液状带泡沫，褐色或绿色，常粘附于会阴部，12天时粪便呈现糊 状，并在13-14天时逐渐恢复至正常。在8-11天时剖检实验猪冇明显的肉眼病变，表现 为在中后段空肠有卡它性或局灶伪膜性炎症，粘膜表而有斑点状岀血和纤维性坏死斑块， 肠系膜淋巴结水

17、肿性增人；显微镜下对见肠绒毛萎缩，肠上皮细胞灶性坏死，在绒毛顶端 有纤维索性坏死物，并可在上皮细胞内见到人量成熟的裂殖体，裂殖子等内生性阶段虫 体。猪的艾美耳球虫病一般发生断奶前后的仔猪。但对其流行病学的研究仍很少。2. 2猪等砲球虫i.suis是引起猪球虫病的主耍病源，且常为原发性，发生于产房内的哺乳期或新断奶的 仔猪。在世界各国，其发生率约占仔猪腹泻性疾病中的15%20%： 16 o拯欧洲国家的流行 病学调杳有83%100%的猪场有i.suis感染17,在美国每年导致的经济损失高达1亿美 元以上。i. suis主要寄生于猪小肠，偶可寄生于盲肠s unshinesunshine及结肠，其屮以

18、空肠或肠尤为常见，以5x10卵囊试验接种1-3 h龄仔猪可引起严重腹 泻，接种7x1043x105卵龚则引起仔猪死亡。腹泻以糊状粪便开始，2-3天后转为水 样，常昱现黄色或灰口色但无血便，有强烈的酸奶味。以2x10 5感染3日龄仔猪后2-4 天开始发生腹泻，并一直持续至感染后10或11 x; 4.5x时即在粪便中出现卵張，第7 天时为排卵囊高峰；在整个病程中分别于5-7天和12天时出现两次排卵囊高峰，说明有 -次循环感染出现。显微镜下可见肠绒毛萎缩、融合、肠隐窝增生，并有坏死性肠炎的病 理表现，在肠上皮细胞内可见到双核形并以内出芽生殖的1型裂殖体和多核的ii型裂殖体 。仔猪出生后对立刻感染i.

19、suiso由于猪等抱球虫生活史短暂，5-7 s龄吋仔猪生活环境 中即有人量卵囊，因而等抱球虫病常发生于7-14 h龄的乳猪18o但新近的调查表明更 大日龄的仔猪也可发生。sayd等证实10-19日龄仔猪的t. suis检出率更高；哺乳期仔猪 和常规断奶后的仔猪卵變检出率也无明显差异19。在一次更人范围的调查小20, moyer发现在大型机械化养猪场，3-4周龄的仔猪感染最高。在历时一年的连续采样检查 中发现5个种猪场（母猪群155-238只）的264窝仔猪（按总产仔猪窝数的10%抽样）中 总体累加感染率为53. 8% （在不同的猪场分别为20%-81. 5%）,至哺乳末期,腹泻病发生 率最高，

20、可占采样禹数的66. 3%,有63. 4%的腹泻仔猪粪检等砲球虫卵龚阳性粪检阳性的 猪有78.2%发生临床型球虫病;夏季（66.3%）和秋季（61.0%）的发生率明显高于冬季 （37.9%）和春季（47.9%）,且常与致病性大肠杆菌和兰氏类圆线虫（strongyloides ransomi）混合感染。不同的断奶方式对断奶仔猪的i. suis感染率似有影响，早期断奶的 仔猪在断奶后6-7周育成期间3次采样检查，感染率从37.5%下降至20. 2%再至4. 1%,与 此同时腹泻发生率则从36. 5%降至11. 0%再至3. 3%；而常规断奶的仔猪则从17. 2%上升至 21.9%再稍降至21.0%

21、,腹泻发生率则分别为34.4%、33. 0%和57%。有自动除粪系统的仔 猪栏中仔猪感染率较低，网孔型地板栏舍内仔猪的感染率明显小于平实型地板栏舍的仔 猪。产房污染是仔猪感染的主要來源，并可造成在同一产房内的一窝窝仔猪的连续感染 21,22。极少量的残存卵囊即足以导致这种连续感染22, 窝仔猪中只要一只感染, 很快引起全禽仔猪同群感染，较短的潜隐期和他子化时间及仔猪栏内较高的温度（对达35°c）,使i.suis生活史很易完成，可能是感染在同窝仔猪间迅速扩散的主要因素。但 大多数研究认为母猪帯山対其仔猪等他球虫病发生的流行病学意义不大。3免疫対猪球虫病的免疫机理研究还非常少。但一些临床表现说明仔猪能対球虫感染产牛:免疫 力。sturt等实验证明仔猪试验或自然感染i.suis后对再感染有很强的抵抗力，不但无临 床症状，且很少甚至无卵囊排;lh 口龄仔猪口服4x105砲子化卵龚后出现水样腹泻，甚 至引起死亡；但给19 h龄仔猪同样剂量的卵囊则只引起轻微临床表现，说明仔猪对 i.suis感染有年龄免疫现象。仔猪出个后3-4周内，肠相关淋巴组织的结构和功能是逐渐 发育成熟的，随着年龄的增长，肠道局部抗球虫免疫的特异性细胞介导免疫反应的细胞和 体液因子逐渐发挥作用，且非特异性免疫因子可能比特异性免疫因子冇更重耍的作用。4诊断和防治猪球虫病发生