啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定

1、浙江工业大学药学院生物化学实验论文 2013 年12 月 13日啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的OD540值，得各提取液的酶活力与回收率。（4），蔗

2、糖酶蛋白质含量的测定及活力计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳；

3、正文：文献综述蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖 ，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45-50，最适ph为4.0-4.5. 实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会1 蔗糖酶的提取及初步提纯1.1实验原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提

4、取，使蔗糖酶得到初步的提纯。1.2 试剂与器材1.2.1试剂 啤酒酵母；醋酸钠（AR）；甲苯（AR）；4mol/L醋酸；95%乙醇（<-20）；0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。称取121.1g Tris溶于1500ml的蒸馏水中，用4 mol/L HCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水稀释到2L，即为0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液：将0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液稀释10倍即得。注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。1.2.2器材 锥形瓶2

5、50ml（×1），50ml（×1）；量筒10ml（×1）25ml（×1）;烧杯100 ml（×1），1000 ml（×1）；具塞试管10 ml（×3）；吸球、玻棒、滴管、pH试纸；培养箱；恒温水浴箱；磁力搅拌器，搅拌子；高速冷冻离心机。1.3操作方法 1 酵母的自溶 ：在弱碱中培养60小时； 2 初提取液A：取出酵母自溶液体，经两次离心得初提液A； 3 热提取液B：水浴提取液A，并使PH为4.5，离心得热提取液B4 乙醇沉淀提取液C：将B冷却并加入乙醇持续搅拌，不少于30min，离心得提取液C1.4结果与分析1.4.1结果表

6、2-1提取液颜色状态体积（ml）A黄色液体17.0B浅黄色液体18.0C淡黄色液体8.27 VA总=VA=17.0ml VB总=VB·VA/(VA-3)=18.0ml VC总=Vc·VA/(VA-3) ·VB/(VB-3)=Vc·VB总/(VB-3)=8.27ml 1.4.2分析 提取液A、B、C颜色不断便签是因为杂质不断消除。这次的数据与其他小组无太大差距，这不会影响后续实验。1.4.3结论VA总=17.0ml ； VB总=218.0ml ； VC总=8.27ml。1.5注意事项第一次离心后取液体时要小心；水浴时的温度不要超过50。同时在保温过程中不断

7、摇动锥形瓶。冰浴时要迅速操作；冰浴操作过程中慢慢加入缓冲液并搅拌使固体充分溶解，减少损失；1.6认识与体会 实验操作无明显错误，操作仍能精确，但需锻炼；离心操作前需平衡，否则会损坏离心机；蔗糖酶在50°C以上失活。2 蔗糖酶的纯化Q Sepharose-柱层析法2.1实验原理离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以一定pH和离子强度的溶液为流动相，流动相和固定相之间发生可逆的离子交换反应，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时，降低pH值或提

8、高离子强度均可使之洗脱下来，用含阴离子（如Cl-)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加Cl-浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。2.2试剂与器材2.2.2.1试剂 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；1mol/LNaCl的 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；0.5mol/LNaOH；Q Sepharose，长期保存需置于20%乙醇中，4保存。注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。2.2.2.2器材 层析柱；梯度混合器

9、;磁力搅拌器，搅拌子；紫外分光光度计；点滴板；尿糖试纸、擦镜纸；止水夹；烧杯、试管。 2.3操作方法 1离子交换柱的填充：将层析柱垂直固定，加水，排除气泡，再加少量水，装入离子交换剂，至柱高5cm，交换柱上端保留少许水（不得干柱）。 2缓冲液盐度梯度发生器的安装：在低浓度一段装入搅拌子。且要形成梯度。3柱的平衡：将柱子与恒流泵连通，用25ml Tris-HCl pH7.3缓冲液进行冲洗平衡完成后，交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。4加样：缓慢加样，不能把柱面冲到导致柱面不平，这是实验成功的关键之一5洗脱：为防止液面低于交换剂表面，加入了5ml缓冲液。6测OD值：在紫外分光计光度计上测出每管在

10、280nm处的紫外吸光度OD值。得到各管的OD值如下： 表2-2试管号OD280值试管号OD280值10.322140.120 20.447150.109 30.060160.083 40.054170.077 50.065 180.069 60.031190.126 70.028 200.30580.016 210.900 90.037 221.014100.048 230.673 110.061 240.281120.231 25130130.2847酶活力测试用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小，由以上OD值，取1、2、5、12、13、14、20、21、22、23管进行测试。 酶活

11、力测试方法：在点滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待测洗脱液，用玻璃棒搅匀，放置5min，浸入葡萄糖试纸，1s后取出，60s比较颜色深浅。将其合并成一管，VD=5.22ml2.4结果与分析2.4.1结果 VD =5.22ml VD总=VD·VC总/V样=5.6×6.1/0.5=86.34ml。由数据得表如下： 图2-1 Q Sepharose-柱层析法提纯酶数据处理表2.4.2分析 柱的高度与冲洗的流速、梅的浓度及柱的带电量大小会影响样品在柱内的移动快慢； 酶活力不是特别的强，也许是前面柱下端渗出液体导致蔗糖酶流失； 适当增加柱的高度与降低冲洗液的流速能提高分离效率； 在使用Q

12、-Sepharose纯化方法之前还有过DEAE-纤维素层析方法和DEAE Sepharose层析方法，但比较这几种方法，用Q-Sepharose纯化方法有如下特点： (1) 提高实验效果。琼脂糖凝胶离子交换介质比纤维素介质载量高,分离纯化蔗糖酶穿透峰小,分辨率高,回收率高。蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离,提高纯度,真正体现离子交换色谱蛋白质纯化上的优越性,增强实验的意义。（2） 缩短实验时间。梯度洗脱时间由原来的100min缩短到现在的50min,减少不必要的实验重复,实验过程比较紧凑。（3） 节约实验支出。离子交换介质DEAE-纤维素由于流速慢,柱床高度会随缓冲液浓度及pH改变,不能承受0.

13、1M以上NaOH清洗,重生效果差,寿命短。琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性。且其化学稳定性极高,不易破碎,可以承受1MNaOH的清洗,重生效果好,可以使用数百至上千次,因而降低了成本。2.4.3结论VD 5.22mlVD总 =86.34ml。2.5注意事项在整个柱操作过程中，要严格防止液面低于交换剂的表面。当液面低 于交换剂表面时，空气进入交换剂内，形成气泡，而影响分离效果；加样不可太快，以免搅浑交换剂的表面，而使分离不纯；恒流泵的流速要控制好，要速度有利于液体滴下来，同时防止液体下滴过快而引起干柱。是绝对不能干柱；盐度梯度发生器内气泡要除尽；2.6认识与体会在本实验中，由于操作失

14、误，导致柱内气压太大，加样时在柱的下端有液体流出，影响了本实验的准确性，使得D的酶浓度不高，影响后续实验，提纯也不好。 3 蔗糖酶活力的测定3.1实验原理本实验用DNS法测还原糖的含量，进而计算酶的活力。蔗糖水解产生的葡萄糖和果糖均是还原性糖，可以在氢氧化钠和丙三醇的作用下与2,3,5-二硝基水杨酸反应，生成的棕红色氨基化合物在540nm波长处有最大吸收。在一定范围内还原糖的量与其吸光值呈线性关系，于是做出葡萄糖标准曲线以后，就可以利用比色法可测出样品中的还原糖含量。酶活力是指某种酶在最适PH、温度等条件下催化底物水解的能力，通常以一段时间后底物的减少量或产物的生成量多少来表示。酶活力单位数（

15、U）：在一定条件下，3min内能水解蔗糖成还原糖1mg所需的酶量，称为1个活力单位数。总活力单位数=（V测体积测出的葡萄糖克数/V测）*(试管溶液总体积/2)*V总*nV总为各种提取液在提取过程中的总体积。酶回收率=（各提取液的总酶活/处提取液A的总酶活）*100%3.2试剂与器材3.2.1试剂3,5-二硝基水杨酸（1）甲液：溶解6.9g结晶酚于15.0ml10%氢氧化钠溶液中并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。（2）乙液：称取255g酒石酸钾钠加到330ml10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液。将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用，在

16、室温放置710天后使用。葡萄糖标准溶液（0.2mg/ml） 准确称取20mg分析纯葡萄糖（预先在105干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量移入100ml的容量瓶中，定容。5%蔗糖、；0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液 溶解10.83g醋酸钠于水中，加近260ml的1 mol/L醋酸调pH到4.6，稀释至2L； 5%蔗糖 用0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液配置； 2mol/L NaOH 溶解0.80g氢氧化钠于10ml水中。3.2.2器材 电炉；恒温水浴;紫外分光光度计；试管、吸管；3.3操作方法 1葡萄糖标准曲线的制作 取6支试管，分别按表3-1加入各种试剂。将各管内液体混合均匀，

17、在沸水浴加热5min。取出后立即用冷水冷却到室温，于540nm波长处测OD值，以葡萄糖的毫克数为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。表2-3 葡萄糖标准曲线的制作试管号012345葡萄糖00.801.001.201.401.60蒸馏水3.002.202.001.801.601.40DNS1.501.501.501.501.501.50总体积4.504.504.504.504.504.50OD0.0000.2340.4060.5570.7460.9142酶活力测定将前个实验所得四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释：初提取液A（1：200）；热提取液B(1:200)；乙醇提取液C（1：200）；柱分

18、离液D（1：20）。取8支试管，按表3-2加入各种试剂。表2-4 酶的催化反应项目A（1：200）B(1:200)C（1：200）D（1：20）加样A对A样B对B样C对C样D对D样酶液/ml2.002.002.002.002.002.002.002.002N NaOH0.500.500.500.5035预热10min，同时预热5%蔗糖5%蔗糖2.002.002.002.002.002.002.002.00立即摇匀，准确计时，反应3min2N NaOH0.500.50.500.50总体积/ml4.504.504.504.54.504.504.504.50取反应液A 0.15ml，B 0.25ml

19、，C 0.10ml，D 0.90ml进行DNS反应，测定540nm处OD值。得到ODA=0.348 ODB=0.288 ODC=0.456 ODD=0.5083.4结果与分析3.4.1结果 绘制葡萄糖标准曲线 图2-2总活力单位数=mg/V测·4.5/2·V总·n酶的回收率=（各提取液的总酶活/初提取液A的总酶活）·100%本次试验最终结果：表2-5项目初提液A热提取液B乙醇提取液C柱分离液DV测/ml0.150.250.100.90mg0.1870.1730.2130.225V总/ml17.119.49.097.8总活力单位数/U9613.626051

20、.648618.401100.25回收率/%10062.9589.6511.443.4.2分析（1）、理论中A、B、C、D的回收率应该是越来越低的，但这里确实C>B，可能是因为C中蔗糖酶浓度高于B或反应时间控制不好；（2）、蔗糖酶标曲在01.-0.7之间呈线性关系，低于01或高出0.7都要重新做过；.3.5注意做葡萄糖标准曲线时，加完各种试剂后要充分摇匀。要求测得的OD值在0.10.7测定酶活力时，要准确反应3min，这个反应时间应该精确把握，不要多1秒也不要少1秒测得在线性范围外的OD值，需重新配液显色反应。由于某些原因我们这一组用的是另一组的试剂，所以数据不符合前面的实验；3.6认识

21、与体会 （1）、还原糖的测定方法有菲林试剂热滴法、3,5-二硝基水杨酸法、nelson试剂法； （2）、在这种定量且精确地实验中要严格控制一些因素，比如在这个实验中必须严格控制反应时间； 4 蔗糖酶的蛋白质含量测定及比活力计算4.1实验原理比活力是指单位质量（mg）蛋白质中酶的含量（U），常用来表示酶的纯度。比活力=酶的含量（U）/蛋白质含量（mg）测定蛋白质含量的方法有福林-酚试剂法、微量凯式定氮法、紫外吸收法、考马斯亮法等，本实验采用的是福林-酚试剂法，或称Lowry法，蛋白质与Folin-酚A试剂（碱性）在碱性条件下形成铜-蛋白质复合物，然后加入Folin-酚B（酸性），铜-蛋白质复合物

22、将其还原形成深蓝色钼蓝和钨蓝化合物。因为Folin-酚B中的磷钼酸-磷钨酸可被蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸还原生成蓝色化合物。蛋白质浓度增高，产物颜色加深，这一蓝色溶液在750nm和660nm有较强的吸光值。故可用比色法测定已知浓度的标准蛋白质溶液的OD值，然后据此测出未知样品的蛋白质浓度5。4.2试剂与器材4.2.1 试剂试剂A（碱性铜试剂） 取Na2CO3（AR）10g和 NaOH（AR）2g，加蒸馏水30ml，微热溶解：另取酒石酸钠 （Na2C2H3O32H2O，AR）0.1g和CuSO45H2O（AR）0.05g，再加入30ml蒸馏水微热溶解，冷却后将上述两溶液混合，再用水稀释至100

23、ml，即为试剂A。该试剂为含10% Na2CO3，0.1%酒石酸钠和0.05%硫酸铜的0.5mol/L NaOH溶液。保存于塑料试剂瓶中，24至少可使用1个月。溶解于500毫升蒸馏水中。；试剂B（酚试剂） 在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升

24、，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1mol/L左右。标准浓度牛血清白蛋白溶液（200g/ml） 精确称取结晶牛血清蛋白或酪蛋白，必要时预先经微量凯氏定氮法测蛋白质含量，根据其纯度精确称重配成。牛血清白蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。；4.2.2器材分光光度计（使用直径为10nm的比色皿）；刻度吸管0.5ml（×1），2ml（×1），5ml（×1）;试管1.5 cm×15cm（×8）；具塞试管10 ml（×3）； 恒温水浴箱（55）；4.3

25、操作方法 1标准曲线的制作 表2-6 标准曲线的配置加样表管号012345BSA00.20.40.60.81.0水4.54.34.13.93.73.5试剂A1.01.01.01.01.01.0静置10min（立即充分混匀）试剂B0.30.30.30.30.30.3静置10min（立即充分混匀）试剂B0.20.20.20.20.20.2混匀55水域5min,测A660OD6600.0000.2370.2160.3440.4810.6230.739由于在振荡时，管1有洒出，因此做了两次。2.未知蛋白浓度的测定按A（1：100）、B（1：100）、C（1：20）、D（不稀释）进行稀释，A稀释液去0.

26、4ml，B、C、D稀释液各取5ml测定OD660(所得数据如上表所示)。 【注意】Folin-酚B试剂在酸性条件下稳定，而Folin-酚A试剂在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。当Folin-酚B试剂加入后，应迅速摇匀（加一管，摇一管），使还原反应产生在试剂被破坏之前。4.4结果与分析4.4.1结果表2-7实验结果数据记录表标准牛血清蛋白（ml)标准牛血清蛋白(g)OD6600.2400.216/0.2370.4800.3440.61200.4810.81600.62312000.739样品A1B1C1D1OD6600.3900.2760.3470.118（小） 图 2-3表2-

27、8实验处理结果总汇表总体积/ml总酶活/u总蛋白/mg比活力/u/mg蛋白回收率/%酶活回收率/%纯化倍数/倍初提取液A17.09613.62316.2030.401001001.00热提取液B18.06051.64210.2428.7866.4962.950.95乙醇提取液C8.278618.4016.53521.385.2389.6517.15柱分离液D86.341100.250.373014.360.1211.4499.16 4.4.2分析（1）、此次方法的优点是操作简单，灵敏度高；缺点是蛋白质浓度和光密度线性关系不够严格，而且不同的蛋白质会因Tyr和Trp的含量不同，造成显色程度有差异

28、；（2）、此实验中由于蔗糖酶不断提纯，虽然也不断损失，但比活力还是应该上升的，但这次实验中比活力A>B，是因为上次实验我们组的酶活力没测，这次用的是上次做的那个组的酶活力；（3）、测D的OD值时是0.118，不在线性范围内，但由于D试剂不够用，不重做，本来应该将D的取样量提高重做；4.5注意试剂A加完后，立即充分混匀，静置10min。再向各管加B后放置10min，再加第二次。 每次加A、B后应立即迅速充分混合。4.6认识与体会 （1）、folin-酚法之所以比双缩尿试剂法灵敏是因为此法显色原理与后者相同，只是加入了第二种试剂-folin-酚B试剂，以此增加显色量，从而提高了灵敏度； （2

29、）、做实验时要谨慎仔细，尽量避免不必要误差，在本实验中，我在振荡试管时有时会将溶液振出，虽然量不多，但由于此法灵敏度高也会造成相当的误差，在振荡方面仍需练习；5微量凯氏测总蛋白5.1实验原理 凯氏定氮法由Kieldahl于1833年首创，是一种元素分析方法。根据取样量分类，可以分为常量和微量。 而不同蛋白质中含氮量平均16%，凯式定氮仪测定含氮量，然后乘以蛋白质换算系数6.25，得到蛋白质含量。N / 16% = N × 6.25 = 蛋白质含量实验共需消化、蒸馏、滴定3个步骤，其中消化是为了将有机氮转化为无机氮 ，然后在碱性条件下蒸馏，让无机氮转化成氨气出来，用硼酸试剂吸收，最后用

30、盐酸滴定。滴定指示剂在碱性条件下是绿色，当溶液由绿色-灰色-红色时可认为是滴定完全。 NH2CH2COOH + H2SO4 2 CO2 + 3 SO2 + H2O + NH3 2 NH3 + H2 SO4 （NH4）2 SO4 （NH4）2 SO4 + Na OH Na 2 SO4 + 2 H2O + 2 NH3 2 NH3 + 4 H3BO3 （NH4）2B4O7 + 5H2O （NH4）2B4 O7 + 2 HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO35.2试剂与仪器2.5.2.1试剂 蛋白样品：2g牛血清白蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至100ml；浓硫酸；硫酸钾3份与硫酸铜

31、1份（质量分数）混合研磨成粉末；30%NaOH溶液:30g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml； 2%硼酸溶液：2 g溶于蒸馏水，稀释至100ml； 混合指示剂：01甲基红酒精溶液和 01甲基蓝酒精溶液临时按2:1的比例混合。或01甲基红酒精溶液和 01溴甲酚绿酒精溶液临时按1:5的比例混合5.2.2器材 改良式凯氏定氮仪；克氏烧瓶50ml（×2）;移液管；锥形瓶50ml（×3）；吸球、玻棒、滴管、量筒；5.3操作方法 1消化凯氏瓶内加入A 0.1ml、B 0.2ml、C 0.25ml和2ml硫酸，半匙催化剂，消化至淡绿色，定容至50ml。2.洗涤定氮仪实际操作时，观察到随

32、着锥形瓶内水量增多，指示剂变棕红色。第三次洗涤后，指示剂不变色。3蒸馏实际操作时，在加反应液后，反应室内液体变成棕黑色，液体反应剧烈。指示剂有红色变成棕色，最后变成绿色。4滴定用0.01N HCl将锥形瓶中的指示剂滴定至淡紫色，记录消耗HCl的量。5.4结果与分析5.4.1结果 表2-9次数12HCl消耗量/ml0.850.82HCl消耗量（同组）/ml0.750.77样品含氮量=(A-B) ×N=11mg/ml 样品含蛋白质量=1251mg5.4.2分析（1）、上次用folin-酚法测得的提取液B的蛋白质是210.42mg，而此次测得为1251mg，影响原因可能有：A、folin-

33、酚法以Tyr和Trp为中心测，实际蛋白质有其他氨基酸且不一定符合比列；B、凯氏定氮法中不能否定其含有其他含氮物质；C、收集氨气过程中带入了水蒸气对硼酸PH影响较大；D、蒸汽洗涤时间不够长也可以大致实验结果偏大；E、最后滴定过程中，滴定操作的标准与否也对实验的结果影响较大； （2）、本次试验与上次实验测定的结果由较大的出入，其影响结果的主要因素有：1.收集氨气过程中带入了水蒸气对硼酸PH影响较大；2.蒸汽洗涤时间不够长也可以大致实验结果偏大；3.最后滴定过程中，滴定操作的标准与否也对实验的结果影响较大； 5.4.3结论 样品含氮量=11mg/ml 样品含蛋白质量=1251mg5.5注意 （1）、

34、消化时，样品勿粘于烧瓶壁上； （2）、定氮仪的橡皮管、塞都需处理； （3）、蒸馏时火不能太猛；5.6认识与体会：1、常量凯氏定氮法测总蛋白氮时可用强酸，微量凯氏定氮法测总蛋白氮必须用弱酸。2、folin-酚法与凯氏定氮法比较： （1）、folin-酚法：操作简单，灵敏度高，但操作需严格计时、干扰多； （2）、凯氏定氮法：费时间，灵敏度比前者低，但干扰少，用于蛋白质的测定准确6 SAS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量6.1实验原理电泳是指溶液中带点粒子在外加电场的作用下，向相反电极方向移动的现象。蛋白质的电泳迁移率主要取决于它在某PH下所带的净电荷量、分子大小（即分子量）和形状的差异性。聚丙烯

35、酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（Ap）和加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。凝胶孔径大小可通过改变Acr和Bis浓度来调节。浓度越大，孔径越小，颗粒穿过网孔的阻力越大，反之亦然。网孔大小根据所分离物的分子量的大小来选择。本实验选择分离胶浓度12%。聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续的和不连续的凝胶电泳两类。不连续凝胶电泳有三大效应：（1）浓缩效应：两层凝胶的孔径不同（孔径的不连续性）； 缓冲液与凝胶离子成分和pH不同（缓冲系统的不连续性）（2）分子筛效应：颗粒小，圆球形的样品分子，移动较快；颗粒大，形

36、状不规则的分子阻力较大，移动较慢。（3）电荷效应：大部分蛋白质在pH8.3带负电，电荷多迁移快SDS即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子表面活性剂。它可以破坏蛋白质分子之间的非共价键，形成带大量负电荷的蛋白质-SDS复合物，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然电荷的差异；引起蛋白质分子构象的改变。6.2试剂与器材6.2.1试剂 30%丙烯酰胺贮液: 称丙烯酰胺（AR）29.2g、甲叉双丙烯酰胺0.8g，先用80ml双蒸馏水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸馏水稀释至100ml，过滤。用棕色瓶中，4保存一个月。10%的TEMED；10%过硫酸铵（AP）：现用现配。；

37、分离胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：取Tris 9.08g溶解在40ml双蒸水中，用 4mol/L盐酸调节至pH8.8，用双蒸水定容至50mL， 4保存；浓缩胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH6.8）：取Tris 6.06g溶解在40ml双蒸水中，用 4mol/L盐酸调节至pH6.8，用双蒸水定容至50mL，4保存；2×SDS-样品缓冲液：1ml浓缩胶缓冲液贮液（1mol/L Tris-HCl，pH6.8）+4ml10%SDS+1ml巯基乙醇+2mL甘油0.5ml0.1%(质量浓度)溴酚蓝，加双蒸水定容至10mL，4保存。SDS-电

38、极缓冲液贮存液（0.025mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3）: 取Tris 15.1g和94g甘氨酸溶解在900ml双蒸水中，加入50ml 10%(质量分数)SDS贮存液，加双蒸水定容至1000mL则成5×SDS-电极缓冲液。 10%SDS：25gSDS用双蒸水定容至250mL，室温保存。 染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入90mL 50%甲醇溶液和10mL 冰乙酸，用滤纸过滤。6.2.2器材 垂直板型电泳槽；玻璃板; 大培养皿；烧杯；吸量管；滴管6.3 操作方法 1分离酸制备 装配制胶工具，按表比例配制分离胶，小心加满水，待聚合好

39、后，倾去水，用滤纸片吸干胶面。 2.浓缩胶制备 按表配置浓缩胶，迅速混匀，倒在分离胶上层，插上梳子，待聚合好后，拔出梳子，用滤纸片去除齿孔中的气泡。 3.加样 取100L样品与100L样品缓冲液混合，沸水浴3-5min，取20L各样品加入齿孔中，加一孔Marker，将电极缓冲液倒入电泳槽。4.电泳 调节电流，电泳至溴酚蓝距酸前沿1.5cm左右，停止电泳。5.染色和脱色小心取出凝胶，置于平皿中，加染色液中过夜，用脱色液脱色，换两次脱色液，至背景透明。6计算样品相对分子质量。6.4结果与分析6.4.1 结果 表2-10蛋白质分子迁移距离/cm染料迁移距离/cm相对迁移率标准蛋白分子量标准蛋白分子量的对数2.944.40.668 144004.1583624921.30 0.295310004.4913616941.19 0.270430004.6334684560.720.1646