发酵饲料中各组分的测定方法

1、发酵饲料中各组分的测定方法一、饲料中概略养分的测定方法（一）饲料中水分的测定方法1.原理: 试样在105±2烘箱内，在大气压下烘干，直至恒重，逸失的重量为水分2.仪器设备实验室用样品粉碎机或研钵。分样筛：孔径0.45毫米（40目）分析天秤：感量0.0001克。电热式恒温烘箱：可控制温度为105±2。称样皿：玻璃或铝质，直径40毫米以上，高25毫米以下。干燥器：用氯化钙（干燥试剂）或变色硅胶作干燥剂。3.试样的选取和制备选取有代表性的试样，其原始样量应在1000g以上用四分法将原始样品缩减至500g，风干后粉碎至40目，再用四分法缩至200g，装入密封容器，放阴凉干燥处保存。

2、如试样是多汁的鲜样，或无法粉碎时应预先干燥处理，称取试样200300g，在105烘箱中烘15分钟，立即降至65，烘干56小时，取出后，在室内空气中冷却4小时，称重，即得风干试样。4.测定步骤（1）洁净称样皿，在105±2烘箱中烘1小时，取出在干燥器中冷却30分钟（称样皿放入烤箱时应开1/3盖，冷却和称重时应盖严），称准至0。0002克，再烘干30分钟，同样冷却，称重，直至两次重量之差小于0。0005克为恒重。（2）用已恒重称样皿称取两份平行样，每份2.0克，样品厚度4毫米以下，准确至0。0002克，不盖称样皿盖（或半盖），在105±2烘箱中烘烘4小时，以温度到达105开始计

3、时，取出盖好称样皿盖，在干燥器中冷却30分钟，称重。（3）再同样烘干1小时，冷却，称重，直至两次称重之重量差小于0.002克。5.测定结果的计算计算公式：水分（%）=（W1W2）/（W1W0）×100%式中：W1105烘干前的试样及称样皿的重量（g）；W2105烘干后试样及称样皿的重量（g）；W0已恒重的称样皿的重量（g）。6.重复性每个试样，应取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果，两个平行样测定值相差不得超过0。2%，否则重做。、7.注意事项（1）如果试样进行过预先干燥处理，应按下式计算原来试样的所含水分总量：原试样总水分（%）=预干燥减重（%）+100预干燥减重（%） &#

4、215;风干试样水分（%）（2）某些含脂肪高的样品，烘干时间长反而增重，乃脂肪氧化所致，应以增重前那次重量为准。（3）含糖分高的易分解或易焦化试样，应使用减压干燥法（70，600mm汞柱以下，烘干5小时）测定水份。（二）饲料中粗蛋白的测定方法 1.测定原理在催化剂（如硫酸铜、硫酸钾、硫酸钠或硒粉）作用下，试样中有机物质被浓硫酸消化分解，使含氮物质（蛋白质，氨态氮等）转化为硫酸铵，而非含氮物质则以二氧化碳、水蒸气、二氧化硫等气态逸出。消化液在强碱作用下蒸馏，释放出氨气，氨气冷凝后被硼酸吸收，并与其结合成硼酸铵，然后以甲基红-溴甲酚绿作混合指示剂，用盐酸标准滴定溶液滴定，求出氮的含量，再乘以一定的

5、换算系数（通常用6.25计算），即得出试样中粗蛋白质的含量。2.试剂和材料未特殊标注的试剂均为分析纯。水至少应为蒸馏水（1）浓硫酸：化学纯。（2）400g/L氢氧化钠溶液：40.0 g氢氧化钠(化学纯)，溶于100.0 mL水中。（3）混合催化剂：取质量比为1:9的五水合硫酸铜(预处理：研磨至粉末状)和无水硫酸钾混合并研磨混匀，装入试剂瓶中密封备用。（4）1 g/L甲基红乙醇溶液：称取0.10g甲基红溶于100 mL乙醇中，棕色瓶中保存3个月。（5）1 g/L溴甲酚绿乙醇溶液：称取0.10g溴甲酚绿溶于100 mL乙醇中，棕色瓶中保存3个月。（6） 硼酸吸收液：溶解2.0g分析纯硼酸于100.

6、0ml容量瓶中，加蒸馏水至100.0ml，摇匀备用。（7） 0.05mol/L盐酸标准滴定溶液：4.2ml盐酸注入1000 mL水中，用无水碳酸钠法标定。（8）蔗糖：分析纯。（9）硫酸铵：基准试剂。3.仪器设备（1）实验室用粉碎机。（2）分样筛：40目（孔径0.42 mm）。（3）分析天平：感量 0.0001 g。（4）消煮炉或六联电炉：6×（8001000）（5）凯氏定氮仪：FOSS Kjeltec 8100。或半微量凯氏定氮仪：如图（6）酸式滴定管：25.0ml或50.0ml（7）凯氏烧瓶：100.0ml（8）烧杯：250.0ml（9）三角瓶：150.0ml（10）容量瓶：100

7、.0ml（11）移液管：10.0ml（12）量筒：10.0ml、25.0ml4.分析步骤 （1）消化 精确城区饲料样本0.50001.0000g，将秤样纸卷成桶状，无损的移入100.0ml洗净、烘干的已编号的凯氏烧瓶中，加入1.01.5g混合催化剂，沿着凯氏烧瓶壁加入10.015.0ml浓硫酸，将凯氏烧瓶放于毒气橱中电炉上消化，为防止消化时液体溅失，可再加两粒玻璃珠，先低温加热防止泡沫浮起，待泡沫消失后，提高加热温度至沸腾。消化时要经常转动凯氏烧瓶，如果有黑色碳粒消化不全，可将凯氏烧瓶内壁上粘附少量黑色碳粒于硫酸中，继续消化至完全澄清透明，无黑色碳粒呈蓝绿色为止，移出电炉，放于沙盘中冷却。（2

8、）转移 将冷却的消化液加少许蒸馏水约20.0ml，摇匀后无损移入100.0ml容量瓶，用蒸馏岁反复冲洗烧瓶并移入容量瓶，冷却到室温后，再用蒸馏水定容至刻度。（3）空白实验 消化的同时另取一个凯氏烧瓶，加入除样品外其他试剂，同样消化至澄清透明，后续操作相同，为空白消化液。（4）蒸馏 安装好半微量凯氏定氮仪，检查冷凝水是否通畅。加热蒸发器内的水，待水沸腾后，调节好蒸汽的压力，反复洗净定氮仪反应室，把装有10.0ml 2.0%硼酸溶液的接受瓶至于冷凝管下方，将冷凝管下端的滴管插入硼酸溶液内，用被测消化液冲洗10.0ml移液管3次，再用此移液管吸取10.0ml样本消化液，由漏斗处诸如反应室，并以少量蒸

9、馏水冲洗漏斗，塞好加液塞，从漏斗中加入40.0%NaOH溶液，轻轻地拨动加液塞，多余NaOH溶液用滴管吸出于盛NaOH溶液烧杯，加少量蒸馏水冲洗漏斗及反应室内壁，开始计时，蒸馏5min，接受瓶离开页面继续蒸馏1分钟。用坩埚钳切断气源，将反应室的残液吸出，反复冲洗反应室数次，移走接受瓶前 用少量蒸馏水冲洗冷凝管尖端。放置下一个测定瓶，继续下一个测定工作，（5）滴定 用0.05mol/L盐酸标准工作溶液滴定吸收液，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。5.计算试样中粗蛋白含量以质量分数表示，数值以%计，按下式进行计算：式中：V1样本消化液滴定时消耗0.05mol/L的HCl标准液的量，mL；V0空白消化液

10、滴定消耗0.05mol/L的HCl标准液的量，mL；V2样品消耗后定容的体积，mL；V3定氮吸收样品消化液的体积，mL；C盐酸标准溶液的浓度，mol/L；W试样质量，g；0.014每毫升1mol/L的HCl标准溶液相当于氮的克数；6.25氮换算成蛋白质的平均系数。6.重复性每个样品取两个平行样进行测定，取其算术平均值，两次滴定用标准液之差不超过0.1ml。粗蛋白%25%时，允许相对偏差为1%；10%粗蛋白%25时，允许相对偏差为2%；粗蛋白%10%时，允许相对偏差为3%。7.注意事项（1）平行测定试样时称样量要尽量一致，以减少误差；称样量要适当，保证滴定时消耗盐酸标准液的体积数不少于15ml。

11、（2）样品要用称量纸包裹好后放入消化管中，催化剂要称量在5.0g左右。缓缓加入硫酸，浸泡样品15 min后将其放在消化炉上。（3）消化炉温在200以下时才可以将盛有样品的消化管放在消化炉上开始消化。（4）试样消化初期应保证冷凝水流量足已带走实验所产生的有毒有害气体，待（5）消化后的试样溶液在放置冷却后会结晶成固体，若结晶成固体后应在电炉上加热溶解后再进行蒸馏操作，否则会在通入蒸汽时反应剧烈，内部压力增高，有试样溶液逸出或炸裂消化管的可能。（6）重新配制盐酸标准溶液后要进行蒸馏器硫酸铵回收率的化学检验。（7）定氮仪开机之后蒸馏试样溶液之前需要进行一次无样测试（清洗），清洗仪器内部管路，排除仪器内

12、部管路的残存的气体；蒸馏结束后同样需要进行一次无样测试（清洗），清洗仪器内部管路。蒸馏过程中长时间使用高浓度的氢氧化钠溶液，在管路内部会形成氢氧化钠固体结晶，轻者加氢氧化钠量不足，严重的会造成管路堵塞无法加氢氧化钠；应对管路进行定期清洗，将氢氧化钠溶液更换为温热的蒸馏水，对其管路清洗即可。（8）蒸馏前应将蒸馏装置的冷凝管末端浸入盛有硼酸吸收液的锥形瓶的液面以下，防止产生的氨气损失；蒸馏完毕应先将锥形瓶取下，然后关闭蒸汽，防止吸收液倒吸。蒸馏过程中应确保体系的密封性，若有泄露实验应重做。（三）饲料中粗脂肪的测定1.实验原理索氏脂肪提取器中用乙醚提取试样，称提取物的重量，除脂肪外还有有机酸，磷脂，

13、脂溶性维生素，叶绿素等，因而测定结果称为粗脂肪或乙醚提取物。2.实验试剂无水乙醚（分析纯）3.仪器设备实验室用样品粉碎机或研钵分样筛：孔径0。45毫米。分析天秤：感量0。0001克。电热恒温水浴锅：室温100。恒温烘箱：50200。索氏脂肪提取仪：100.0ml或150.0ml滤纸或滤纸筒：中速，脱脂。干燥器：用氯化钙（干燥级）或变色硅胶为干燥剂。称样皿：直径80mm以上4.试样的制备选取有代表性的试样，用四分法将试样缩减为500克，粉碎至40目，再用四分法缩减到200克，于密封容器中保存。5.分析步骤（1）索氏脂肪提取器的准备索氏脂肪提取器，应干燥无水，抽提瓶中有沸石数粒，在105±

14、;2烘箱中烘干60分钟，干燥器中冷却30分钟，称重，再烘干30分钟，同样冷却称重，两次重量之差小于0.0008克为恒重，（2）称取试样12克准确至0.0002克，用滤纸包好，放在称量皿中。然后放入105烘箱中，烘干120分钟，拿出来放在干燥器中冷却30min后称重，直至恒重。（3）将恒重的滤纸包由称量皿中取出放入浸提管中，加入乙醚。（4）在6075的水浴上加热，使乙醚回流，控制乙醚回流次数为每小时约10次，共回流约50次，检查抽提管流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点。（5）取出试样，在通风处待乙醚挥发干净后，置于称量皿中放入105±2烘箱中烘干12小时，干燥器中冷却30分钟称重，再

15、烘干30分钟，同样冷却称重，两次重量之差小于0.001克为恒重。（6）乙醚的回收：提取完毕，待浸提管中乙醚流入盛醚瓶后，移去上部冷凝管取出样品包，将冷凝管装好再回流一次，以冲洗浸提管中残留的脂肪，继续蒸馏，当乙醚聚集到虹吸管高度2/3处时，取下装置，收回乙醚，继续回流，直至脂肪瓶中的乙醚全部收完为止。也可以使用脂肪提取仪测定，依仪器操作说明书进行操作。6.测定结果的计算：粗脂肪（%）=(m2m1)×100m式中：m:风干试样的重量，gm1：已恒重的抽提瓶重量,gm2：已恒重的盛有脂肪的抽提瓶的重量,g重复性每个试样取两平行样进行测定，以其算术平均值为结果。粗脂肪含量在10%以上（含1

16、0%）允许相对偏差为3%。粗脂肪含量在10%以下时，允许相对偏差为5%。（四）饲料中粗灰分的测定1.原理饲料中的灰分，即饲料中的矿物质或无机盐，主要是K、Na、Ca、Mg、S、Si、P、Fe以及其他微量元素等。饲料样本经过高温(550)的灼烧以后，其中的有机元素，如N、H、O、C等，均被氧化而逸失，所剩残渣主要是矿物元素氧化物或无机盐类，亦即矿物质，但也会含少量杂质，如砂、土等，所以称为粗灰分。2.仪器设备（1）实验室用样品粉碎机或研钵。（2）高温电炉:20-900。（3）分析天平: 感量0.0001g。（4）六联可调电炉:6×1000W。（5）瓷坩埚: 带盖30ml。（6）干燥器:

17、 内径30cm (变色硅胶做干燥剂)。（7）坩埚钳:长柄45cm短柄25cm。（8）毛笔。3.试剂（1）凡士林：医用。（2）变色硅胶:化学纯。（3）0.5%氯化铁墨水溶液：称取0.5克FeCl3溶于100ml蓝墨水中。4.测定步骤（1）洗净坩锅，用0.5% 氯化铁墨水溶液编号(号码最好一律刻在坩锅和坩锅盖的厂牌房，以便寻找)（2）在650左右高温电炉中灼烧30分钟，待炉温降至200以下时，移入干燥器中冷却30分钟后称重，如此重复操作至两次重量之差不大于0.0005g为恒重。（3）在此坩埚中精称样本2g（准确到0.0002g）（4）在电炉上小火炭化至无烟后，移入高温电炉650左右灼烧2小时，取出

18、后于干燥器中冷却30分钟，称重。再灼烧1小时，同样冷却称重，直至前后两次重量之差小于0.0002g为止。5.测定结算的计算 粗灰分%= （W3-W1）/（W2-W1）×100式中：W样本重(g)W1坩锅(带盖)重(g)W2坩锅(带盖)加样本重(g)W3坩锅(带盖)加灰分重(g)6.注意事项（1）用电炉炭化时应小心，炭化和灰化时应打开坩锅盖少许，以防样本颗粒被逸出的气体带走。（2）取用坩锅钳坩锅时，坩锅钳必须烧热后才能夹取高热坩锅，以防破裂。（3）灰化残渣颜色与样品中含量有关，一般样品灰化完全时为白色，但含铁高的样品常呈红棕色，含锰高的呈淡兰色。如炭灰呈灰色，则表示没灰化完全需继续灼烧

19、。（五）饲料中NDF的测定方法1.原理植物性饲料如一般饲料、牧草的粗纤维经中性洗涤剂（3%十二烷基硫酸钠）分解，则大部分细胞内容物溶解于洗涤剂中，其中包括脂肪、糖、淀粉和蛋白质，统称为中性洗涤剂溶解物（NDS），而不溶解的残渣为中性洗涤纤维（NDF），这部分主要是细胞壁部分，如半纤维素、纤维素、木质素、硅酸盐和极少量的蛋白质。2. 仪器设备（1） 冷凝器或冷凝装置两套（2） 分析天平：感量0.0001g（3） 高脚烧杯：600.0ml，2个（4） 表面皿：直径12.0cm，2个（5） 抽滤装置一套（6） 玻璃坩埚3. 化学试剂（1） 中性洗涤剂（3.0%十二烷基硫酸钠）：准确秤取37.2g乙二

20、胺四乙酸二钠（EDTA，化学纯）和13.6g硼酸钠（化学纯），一同放入1000.0ml烧杯中，加入少量蒸馏水，加热溶解后，再加入30.0g十二烷基硫酸钠（化学纯）和10.0ml乙二醇乙醚（化学纯）；称取23.0g无水磷酸钠（化学纯）置于另一烧杯中，加少量蒸馏水微微加热溶解后，倾入第一烧杯，在容量瓶中稀释至1000.0ml，此溶液pH值6.97.1左右。（2） 十氢化萘C10H18，化学纯（3） 无水硫酸钠4. 测定步骤（1） 准确称取风干样（通过40目筛）1.0g，置于高脚烧杯中。（2） 加入室温的中性洗涤剂100.0ml和数滴十氢化萘（消泡剂）以及0.5g无水硫酸钠，不要求准确。（3） 套上

21、冷凝装置，立即置于电炉上尽快煮沸（1.0min内煮沸），溶液沸腾后调节电炉使其始终保持微沸状态1h。（4） 煮沸完毕后离开热源，冷却热源，冷却10min，将已知重量的玻璃坩埚安装在抽滤瓶上，将残渣全部移入，抽滤，并用热水冲洗、抽滤残渣至无泡沫，将滤液全部滤干。（5） 用20.0ml丙酮冲洗2次，抽滤。（6） 取下玻璃坩埚，在105.0条件下烘干，称至恒重。5. 结果计算NDF百分率的计算公式NDF（%）=（m1-m2）/m*100式中：m1玻璃坩埚和NDF的质量 m2玻璃坩埚的质量 m样本质量（6） 无氮浸出物的计算无氮浸出物（%）=100-水分（%）+粗蛋白质（%）+粗脂肪（%）+粗纤维（%

22、）+粗灰分（%）二、挥发性脂肪酸的测定一般来说，碳原子数在10以下的脂肪酸大部分具有挥发性，并且易溶于水。在它们中间，随着碳原子数的增加，挥发性逐渐下降。典型的挥发酸见附表5。附表5 低级脂肪酸的分子式及沸点名称分子式沸点/名称分子式沸点/甲酸乙酸丙酸HCOOHCH3COOHC2H5COOH100.8117.5140.0丁酸戊酸已酸C3H7COOHC4H9COOHC5H11COOH162.3185.5205.0挥发性脂肪酸易被微生物利用。在有机物的厌氧分解中，挥发性脂肪酸是作为生物代谢的中间或最终产物而存在。在厌氧发酵的液化产酸阶段，这一类低级脂肪酸是这一阶段的主要产物，其中以乙酸为主。在某种

23、条件下，乙酸可以达到该类酸总量的80%。在CH4形成过程中，甲酸和乙酸是形成甲烷的重要前体物。据研究，自然界有机物产生的CH4中大约有70%上由乙酸中的甲基原子团形成的。丙酸、丁酸可以转化成甲酸。有机酸过多往往反映出发酵池的病态。因此可以认为，在微生物厌氧发酵过程中，挥发性脂肪酸不仅是一种不可缺少的营养成分，更重要的意义在于这类有机酸已是沼气发酵研究有机物降解工艺条件优劣的重要参数，在甲烷形成的研究和生产中，它们的含量也是重要的参数。在挥发性脂肪酸的总量测定中，是以乙酸作为基数进行计算，除了要求测定总量外，对甲酸、乙酸等各种低级脂肪酸的分别定量分析也是十分重要的。（一）C2C5挥发性脂肪酸的气

24、相色谱测定法1.测定原理使用色谱仪上的氢火焰检测器测定挥发性脂肪酸含量，其基本原理是：色谱柱分离后馏出的物质被载气载入检测器离子室的喷嘴口，与燃烧气氢气相混合，并以空气助燃气进行燃烧，以此为能源，将组分电离成离子数目相等的正离子和负离子（电子）。在离子室内装有收集极和底电极，因此离子在电场内作定向流动，形成离子流。该离子流被收集极收集后，经过微电流放大器放大输送给记录仪得到信号，此信号的大小代表单位时间内进入检测器火焰的组分含量。2.测定条件试剂设备 乙酸、丙酸、丁酸、戊酸混合标准液的配制。分别吸取乙酸（A.R.，相对密度1.045，含量99%）、丙酸（A.R.，相对密度0.9987，含量99

25、.5%）、丁酸（A.R.，相对密度0.8097，含量99%）、戊酸（A.R.，相对密度0.934，含量100%）各25L于50mL容量瓶中，再加入2.5mL甲酸（A.R.，相对密度1.22，含量88%），最后用蒸馏水定容。其中乙酸、丁酸、戊酸的浓度分别为517L/L、497L/L、401L/L、467L/L。 6mol/ L硫酸的配制：将167mL浓硫酸（相对密度1.84）缓慢倒入833mL蒸馏水中。 甲酸：相对密度1.22，含量88%。 离心机400016000r/min。 气相色谱仪，FID检测器。 样品预处理 用沼气发酵液7mL加入2滴6mol/ L H2SO4使pH值降至3.5左右（用

26、pH试纸粗测），离心2030 min，取上层透明清液3mL，加入0.15 mL浓甲酸，最终pH值为2.0左右（控制在3.0以下）。 主要实验参数 条件一。固定相：GDX103+H3PO4，2%(6080目)；色谱柱：2m×6mm；柱温：180200；气化室温度：240；检测温度：210；进样量：2L；载气流量：N2，50mL/ min；氢气流量：50 mL/ min；空气流量：600700 mL/ min；衰减：×1/8。 条件二。色谱柱：2m×3mm，不锈钢柱，内填国产GDX-401担体，6080目；柱温：210；载气：N2，流率为90mL/ min；空气流率：

27、500 mL/ min；氢气流率：50 mL/ min；气化室温度：240；检测温度：210。 条件三。色谱柱：2m×6mm，装有以2%磷酸饱和的6080目GDX-103担体；柱温：180200；气化室温度：240；检测温度：210；进样量：2L；载气流量：N2，50mL/ min；氢气流量：50 mL/ min；空气流量：600700 mL/ min； 条件四。色谱柱：2m×2mm，玻璃柱，内装有10%的商品固定液FluoradFC431涂布的Supelcoport担体，100200目；柱温：130；气化室温度：220；检测温度：210；载气流量：N2，40mL/ min

28、。 定性与定量 定性。配制模拟标准样品，用已知物质的保留时间对照被测物质的保留时间进行定性。 定量。用已知样校正法进行定量，其方法是配制已知浓度的标准样（与样品组分一致），进行色谱试验，测量标准样各组分的峰高（或峰面积），求出组分i的单位峰高（或峰面积）的组分含量或作出峰高和浓度的标准曲线。当样品组分浓度变化不大时，可采用单位校正法。当样品组分浓度变化很大时，则需预先用校准样作出浓度和峰高或峰面积的标准曲线，观察其标准曲线是不是通过原点的直线，即是否呈线性。若呈线性，就可用单点校正法，按下面的公式计算：待测样品浓度，L/L；待测样品峰高，mm；标准样品浓度，L/L；标准样品峰高，mm；待测样品

29、体积+甲酸体积，mL；待测样品体积，mL。3.方法的精度和注意事项 以GDX103+H3PO42%为固定相，比用GDX101 、PEGS、Porapak.N等作为固定相其保留时间短，且峰形对称。 本法最小检测量为4L/L，相对误差为1.8%，相对标准偏差2.7%（以乙酸计）。 有机酸是一种强极性物质，沸点较高，由于担体对酸的吸附，常常引起酸峰拖尾和鬼峰的出现。因此，取有机酸直接进样测定时，为了抑制酸的吸附，可采取以下措施。 在样品中加入一定量的浓甲酸（相对密度1.22，含量88%），使其甲酸加入量（体积）与样品的体积比为5：100。甲酸是一种一元羧酸，离解常数（2.11×10-4）大

30、于其他任何一元羧酸，当含有甲酸的样品进入固定相时，担体表面的吸附中心位置被甲酸暂时占据，这样便抑制了C2C5酸被担体的吸附。此外，甲酸在FID上响应很低，故对其他组分的应答影响不大。 酸的吸附还发生在接近进样口的地方，由于进样口常积累有碳质沉积物，通常采用蒸馏水清洗进样口，并用1.5%磷酸-丙酮液来浸泡进样口，然后在约150的温度下将进样口烘烤48h。 用1.5%磷酸-丙酮液来浸泡柱口玻璃毛。 在分析高浓度时，一定分析周期内注射水或15%甲酸液来洗涤被柱子吸附的酸。 操作条件恒定以后，在进标准酸样或样品之前，用15%的甲酸液来冲洗柱子34次。 柱子使用寿命大约46个月，一旦发现色谱峰出现拖尾或

31、重复性差，则必须更换柱。 尽管采取了一系列防止吸附的措施，但柱子的吸附问题还是不可能完全解决，特别是对于4000L/L以上高浓度的酸样，如何克服吸附问题还值得更进一步研究。 当检测器的灵敏度显著降低或更换新柱之后，重新做校正曲线。（二）挥发性脂肪酸总量的比色测定法1. 测定原理含挥发性脂肪酸的样液，在加热的条件下，与酸性乙二醇作用生成酯，此酯与羧胺反应，形成氧肟酸。在高铁试剂存在下，氧肟酸转化为高铁氧肟酸的棕红色络合物，其颜色的深浅在一个较大的范围内与反应初始物挥发性脂肪酸的含量成正比，故可用比色法测定。2.测定方法 试剂 1：1硫酸：浓硫酸（相对密度1.84，C.P.）加到同体积蒸馏水中稀释

32、配制。 酸性乙二醇试剂：取30.0mL乙二醇(C.P.)与4.0mL配制的稀硫酸混合。 4.5mol/L的氢氧化钠：称取180g氢氧化钠(C.P.)溶于水中，冷后以蒸馏水稀释至1L。 10%硫酸羟胺溶液：称取硫酸羟胺(C.P.)10.0g，溶于100mL蒸馏水中。 羟胺试剂：量取20.0 mL4.5mol/L的氢氧化钠，与5.0mL10%的硫酸羟胺相混合。 酸性氯化铁试剂：将20.0g分析纯FeCl3 ·6H2O溶于500mL水中，准确加入20.0 mL浓硫酸，并以蒸馏水稀释至1L。 测定程序 乙酸标准液的配制。精确称取乙酸（分析纯，相对密度1.045，含量99.0%）1.010g，

33、以蒸馏水稀释至100mL，此溶液含乙酸10mg/mL。准确吸取10 mg/mL乙酸标准溶液1.0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL、25.0mL、30.0mL，分别置于100.0mL容量瓶内，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得100L/L、500L/L、1000L/L、1500L/L、2000L/L、2500L/L、3000L/L的乙酸标准系列液。 标准曲线的绘制。取相对密度1.045的乙酸（分析纯）试剂，制成50mL/L、100 mL/L、500 mL/L、1000 mL/L、1500 mL/L、2500 mL/L、3000 mL/L的系列标准液，分别吸取0.5 mL分置

34、于试管中（12.5cm×1.5cm），每瓶中准确加入，于沸水浴中加热3min，然后立即以冷水冷却；再加入2.5mL羟胺试剂，充分摇匀，然后，充分振荡混匀，以蒸馏水定容，用721型分光光度计以500nm波长测定其光密度，绘制标准曲线，以横坐标表示浓度值，纵坐标表示光密度值。 样品的测定。以400010000r/min的离心条件，制取沼气发酵样品澄清液，吸取0.5mL样液置于试管中（12.5cm×1.5cm），准确加入1.7 mL酸性乙二醇试剂，充分混合，于沸水浴中加热3min，应避免试管与加热器壁直接接触。然后立即将试管置于冷水中冷却。加入2.5mL羟胺试剂，并混匀，放置1m

35、in，然后全部倒进盛有10mL酸性氯化铁试剂的25mL容量瓶中，用蒸馏水定容，并充分摇匀，静置5min，用分光光度计以500nm波长测定光密度。同样操作做空白试验1份。 计算式中 C样液光密度值相应于标准曲线上挥发酸的含量，mg； V测定样液体积，mL； 测定时液样的稀释倍数。2.5.2.3 注意事项 此方法是挥发性脂肪酸总量的经验测定法，比蒸馏法测定更为简便、快速。除150mg/L以下的低浓度范围外，其测定值相对误差与气相色谱法测定总值的相对误差相近。 此法中的反应是在严格的pH值条件下进行的，最适pH值为1.6±0.1。pH值高于2.0时，色度加剧，pH值低于1.0时，颜色难以稳

36、定，易消失。 酸性己二醇试剂和羟胺试剂宜使用时配，也可在测定中配入。例如，以加入1.5mL己二醇和0.2mL稀硫酸来代替1.7mL酸性己二醇试剂，以0.5mL硫酸羟胺和2.0mL4.5mol/L的氢氧化钠来代替2.5mL羟胺试剂。 如果所做的空白测定含量酸量超过200mg/L时必须用氢氧化钠蒸馏提纯己二醇 。 酸性氯化铁配制好后，应静置过夜，弃去沉淀。 必须严格遵守操作规程，显色反应必须充分摇动。 比色法没挥发性脂肪酸总量，方便快速，对于特定样品（特别是污水污泥体系）的准确度较高，适合于沼气发酵的常规分析。 （三）挥发性脂肪酸（VFA）的测定-碳酸氢盐碱度和VFA分析的联合滴定法 &

37、#160; 挥发性脂肪酸（VFA）是厌氧消化过程的重要中间产物，甲烷菌主要利用VFA形成甲烷，只有少部分甲烷由CO2和H2生成。但CO2和H2的生成也经过高分子有机物形成VFA的中间过程。由此看来，形成甲烷的过程离不开VFA的形成，但是VFA在厌氧反应器中的积累能反映出甲烷菌的不活跃状态或反应器操作条件的恶化，较高的VFA（例如乙酸）浓度对甲烷菌有抑制作用。因此在反应器运行中，出水VFA用作重要的控制指标。在VFA测定中，常进行VFA总量测定，其单位以mmol/L或换算为按乙酸计，以单位mg/L表示。对VFA中各种低级脂肪酸（乙酸、丙酸）的分别定量分析也是重要的，有时常需要知道以COD表示的V

38、FA的量（即VFA以单位mgCOD/L）表示，此时也需要知道VFA中各种有机酸的含量，因此它们换算为COD的换算系数是不同的。VFA包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸以及它们的异构体。在运转良好的高速厌氧反应器中，VFA中乙酸可占有很高的比例，但当反应器运行状态不好时，丙、丁酸浓度会上升。 （1）分析原理厌氧处理中会产生大量的CO2，在反应器条件下（pH68之间），这些CO2主要以HCO3-形成存在。这是厌氧处理中最重要的pH缓冲物，由HCO3-或主要由HCO3-引起的碱度称为碳酸氢盐碱度。HCO3-产生最大缓冲能力的范围约在pH67。如前所述，HCO3-可以通过滴定测定，但测定

39、过程受到其它一些阴离子的干扰，其中发酵液中常含有的VFA的阴离子是影响碳酸氢盐碱度的主要因素。为此，在荷兰发展了碳酸氢盐碱度和VFA同时进行测量的方法。其原理如下：水样先以0.1000mol/L的HCl标准溶液滴定至PH=3，在这一pH值下，所有HCO3-被完全转化为H2CO3，VFA也几乎完全地转化为其非离子形式。此后，已被滴定至pH3的水样在如图所示的带回流冷凝器的烧瓶中煮沸，所有转化为H2CO3的HCO3-将分解为CO2和H2O，其中CO2完全由其中溢出，而VFA则因为有回流冷凝器而保留在水样中。然后水样以0.1000 mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH6.5，在此pH下，所有的VF

40、A和其他弱酸将被转化为其离子形式。由使用的HCl和NaOH标准溶液的量，即可计算出碳酸盐碱度和VFA的浓度。由此得到的结果更易于判断水样在厌氧条件下的缓冲能力。（2）仪器1250ml带磨口烧瓶，250ml烧杯；210ml半微量酸式滴定管；310ml半微量碱式滴定管；4回流冷凝器；5自动电位滴定计；（3）试剂1无二氧化碳水   用于制备标准溶液及稀释用的蒸馏水或去离子水，临用前煮沸15min，冷却至室温。PH值应大于6.0，电导率小于2s/cm。   2酚酞指示液   称取1g酚酞溶于100ml 95%乙醇中，用0.1mol氢氧化钠标准

41、溶液滴定至出现淡红色为止。   3甲基橙指示剂   称取0.1g甲基橙溶于100ml蒸馏水中。   4碳酸钠标准溶液（1/2 Na2CO3=0.0250 mol/L）   称取1.392g(于250烘干4h)的无水碳酸钠(Na2CO3)，溶于少量无二氧化碳水中，移入1000ml容量瓶中，用水稀释至标线，摇匀。贮于聚乙烯瓶中，保存时间不要超过一周。   5盐酸标准溶液（0.0250 mol/L）   用分度吸管吸取2.1 ml浓盐酸(=1.19g/ml)，并用蒸馏水稀释至100

42、0ml,此溶液浓度0.0250 mol/L。其准确浓度按下法标定：   用无分度吸管吸取25.00 ml碳酸钠标准溶液于250 ml锥形瓶中，加无二氧化碳水稀释至约100ml，加入3滴甲基橙指示液，用盐酸标准溶液滴定至由桔黄色刚变成桔红色，记录盐酸标准液用量。按下式计算其准确度： C=0.0250×25.00/V   式中，   c-盐酸标准溶液浓度（mol/L）；   V-盐酸标准溶液用量（ml）。6氢氧化钠标准溶液（0.0250 mol/L）称取60g氢氧化钠，溶于50ml水中，冷却后移入聚

43、乙烯细口瓶中，盖紧瓶盖静置4d以上。然后吸取上层澄清溶液1.4ml，用水稀释至1000ml，此溶液约为001mol/L。其精确浓度可用邻苯二甲酸氢钾标定，标定方法如下：   取基准试剂级邻苯二甲酸氢钾在105-110烘干至恒重。精确称取三份，每份约0.1g（称准至0.0001g），分别置于250ml锥形瓶中，加入100ml水，稍加热使之溶解。然后加入4滴酚酞指示剂，用氢氧化钠标准溶液滴定至淡红色不褪为止。记录下氢氧化钠标准溶液的用量（ml），并按下式计算其浓度：C= =G×103/(204.22×V)  式中，   C-氢氧

44、化钠标准溶浓度（mol/L）；   V-氢氧化钠标准溶用量（ml）；   G-邻苯二甲酸氢钾重量（g）；   204.22-苯二甲酸氢钾(KH4C8H4O4)摩尔质量(g/mol)。（4）操作步骤   按自动电位计说明书安装、校正好电位计，以蒸馏水清洗电极。   用移液管吸取过滤后的水样Vml（其中含有VFA的量不超过3mmol），加入250ml烧杯中。   将样品水温调制（25±2），将盛有此样品的250ml烧杯置于滴定台上，投入长约1.5cm的磁力搅拌棒，打开搅

45、拌开关并调置一定搅拌强度，小心将电极放入烧杯的液面下。   如果此样品水样的pH高于6.5，则准确调节至6.5。   然后在自动电位滴定计上滴定此水样至pH3.0，消耗的0.1000mol/LHCl记作Zml。   将此水样转移至磨口锥形瓶中，加入沸石或玻璃珠少许，安装好回流冷 凝器。打开冷却水，加热至沸腾并维持3min以上，撤离酒精灯并等待2min，将溶液移回250ml烧杯。   以NaOH标准溶液滴定至pH=6.5，消耗的NaOH标准溶液记作Bml。（5）结果计算挥发酸（VFA）（mol/l）=(Z×

46、Ca-B×Cb)×103/V式中，   Ca-标准HCl溶液的浓度（mol/L）；   Cb-标准NaOH溶液的浓度（mol/L）。（四）挥发性脂肪酸（VFA）的测定-Q/YZJ10-03-02-20001、范围本标准适用于工业废水厌氧消化过程中消化液中的挥发酸含量的测定。2、引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T 6682-1992分析实验室用水规格和试验方法（ISO3696-1978）GB1

47、2999-1992水质采样样品保存规定。3、方法提要样品中的乙酸、丙酸、丁酸等挥发性有机物在酸性条件下被蒸馏出来，馏出液经回流以除去CO2、H2S、SO2等气体，趁热以酚酞为指示剂用0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定，结果以乙酸计算。4、试剂和材料除另有说明，本标准使用的试剂和水，均指分析纯试剂和GB/T6682规定的三级水。4.1 25%硫酸溶液取250毫升分析纯浓硫酸加入约700毫升蒸馏水中，然后加水至1升。4.2 酚酞指示剂称取0.5克酚酞，溶于50ml 95%乙醇中，用水稀释至100ml。4.3 0.1N氢氧化钠溶液配制及标定称取60克氢氧化钠溶于50ml水中，转入150ml的聚乙烯瓶

48、中，冷却后，用装有碱石灰管的橡皮塞塞紧，静置24小时以上。吸取上层清液约7.5ml置于1000ml容量瓶中，用无二氧化碳水稀释至标线，摇匀。称取在105-110度干燥过的基准试剂级苯二甲酸氢钾约0.5克（称至0.0001g），置于250ml锥形瓶中，加无二氧化碳水100ml使之溶解，加入4滴酚酞指示剂，用待标定的氢氧化钠标准溶液滴定至浅红色为终点。同时用无二氧化碳水做空白滴定，按下式计算。氢氧化钠标准溶液浓度（mol/L）=M×1000/(V1-V0) ×204.23式中：m称取苯二甲酸氢钾的质量（g）；V0滴定空白时所耗氧氧化钠标准溶液体积（ml）；V1滴定苯二甲酸氢钾时

49、所耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）；204.23苯二甲酸氢钾的摩尔质量（g/mol）。5、仪器和设备5.1 500毫升蒸馏装置；5.2 500亳升磨口三角瓶；5.3 球形冷凝管；5.4 25毫升碱式滴定管。6、取样按国家环保局颁布的环境监测技术规范（地表水和“废水”）部分规定采取有代表性的样品采集后应尽快测定或加少量氢氧化钠固定，置于4下保存。7、分析步骤7.1 蒸馏。取300毫升/V5（或适量水样加蒸馏水稀释至300毫升）水样于500毫升的平底蒸馏瓶中，然后加入25毫升25%的硫酸溶液，再加入数粒玻璃珠，进行蒸馏，接取200毫升蒸馏液。7.2 滴定。在另一电炉上加热煮沸回流30分钟，取下三角

50、烧瓶，加3滴酚酞指示剂，趁热用0.1N的氢氧化钠标准溶液滴定至微红色30秒不褪色为终点。7.3同时按上述步骤用蒸馏水代替水样作空白。8、分析结果计算挥发酸（VFA）（mg/l）= (V3-V4)×N×60×103/V5式中：V3滴定样品时所消耗的NaOH毫升数；V4滴定空白时所耗的NaOH毫升数；V5取样量（ml）；NNaOH溶液的浓度（mol/L）；60乙酸的分子量。9、注意事项9.1 在蒸馏过程中不能使水样直接冲入蒸出液中，若蒸出则需重新取样蒸馏。9.2 当丁、戊酸含量高时，代表性不强，最好用气相色谱法。VAF不能代表乙、丙、丁、戊的各种含量。10、报告10.

51、1 当两次重复测定结果之差不大于算术平均值的10%时，取算术平均值报告、分析结果报告至0.1mg/L。10.2 报告应包括以下内容：a)有关样品的全部资料，例如样品的名称、采样地点、采样日期、采样时间等；b)本标准的代号；c)分析结果；d)测定中观察到的任何异常现象的细节及说明；e)分析人员的姓名及分析日期等。（五）VFA的滴定法分析（1）原理   本法原理是将废水以磷酸酸化后，从中蒸发出挥发性脂肪酸，再以酚酞为指示剂用NaOH溶液滴定馏出液。废水中的氨态氮可能对测定形成干扰，因此应当首先在碱性条件下蒸发出氨态氮，如果要同时测定氨态氮，以硼酸溶液吸收后滴定之。因此此法可用于

52、氨态氮和VFA的联合测定。（2）药品10%NaOH溶液NaOH标准溶液，0.1000mol/l10%磷酸溶液，取70ml密度1.7mg/cm3的磷酸用水稀释至1L。酚酞指示剂，1%的乙酸溶液。（3）测定步骤于蒸馏瓶中放入50200ml待测废水，其VFA含量不超过30mmol。如水样体积不足100ml，可以蒸馏水稀释至100ml。放入几滴酚酞指示剂。加入10%NaOH溶液，使溶解呈碱性，并使NaOH略过量。开始蒸馏 ，至蒸馏瓶中剩余的液体为5060ml为止。用蒸馏水将蒸馏瓶剩余液体稀释至原来的体积，用10ml10%的磷酸酸化，在接受瓶中放入10ml蒸馏水并使接受瓶与蒸馏瓶上的冷凝管连接，导入管应

53、浸入接受瓶的液面以下。蒸馏至瓶中液体为1520ml为止。待蒸馏瓶冷却后，加入50ml蒸馏水再次蒸馏，至剩余1020ml液体为止。为了除去二氧化碳、硫化氢、二氧化硫等干扰物，可向馏出液中通入高纯氮气1015min，然后加入10滴酚酞，用NaOH标准溶液滴定至淡粉色不消失为止。（4） 计算挥发性脂肪酸含量计算如下：VFA=V (NaOH)*C*1000/Vs (mmol/L)式中：V(NaOH)-滴定消耗的NaOH标准溶液的体积，ml; c - 滴定消耗的NaOH标准溶液的准确浓度，mol/L;挥发性脂肪酸(VFA)的测定挥发性脂肪酸是厌氧硝化过程的中间产物，甲烷菌主要利用VFA形成甲烷，只有少部

54、分甲烷由CO2和H2生成。VFA在厌氧反应器中的积累能反映出甲烷菌的不活跃状态或反应器操作条件的恶化，较高的VFA浓度对甲烷菌有抑制作用。VFA包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸及它们的异构体，在运转良好的反应器中，乙酸比例较高，反应器不好时，甲酸、丙酸浓度升高。在VFA测定中，其单位常换算为按乙酸计，以mg/L表示。常用的测定方法有：滴定法和气相色谱分析法一、滴定法测VFA：1、原理将废水酸化后，从中蒸馏出挥发性脂肪酸，再以酚酞为指示剂用氢氧化钠滴定馏出液。废水中的氨态氮先在碱性条件下蒸馏出。2、仪器：50ml碱式滴定管、锥形瓶、带磨口的具支蒸馏烧瓶（500ml）、与烧瓶配套的蛇形冷凝管、橡胶导管、电炉试剂：(1)10%氢氧化钠：10g氢氧化钠溶于水,稀至100ml。(2)10%磷酸溶液：取70ml浓磷酸稀释至1L。(3)酚酞指示剂：称取0.5g酚酞溶于50ml 95%的乙醇中,用水稀释至100ml。(4)氢氧化钠标准溶液(0.1000mol/L)：称取60g氢氧化钠溶于50ml水中，转