xibaopeiyangzhishi

1、1、 细胞培养基本概念 细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。 在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的细胞

2、系其这一特征可以不明显。 二、细胞培养的环境 细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。 1、无污染环境 培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。 2、恒定的温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5±0.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39时，细胞代谢与温度成

3、正比；人体细胞在39-401小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43以上1小时，细胞全部死亡。 3、气体环境 气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。 二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH为7.2-7.

4、4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。 细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。 4、细胞培养基 培养是既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养

5、基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。 （1）合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。 （2）天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合志培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。常见使用最为5-20%。 三、细胞培养设施和基本条件 1、实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防

6、止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养工作包括：工作液配制、无菌操作（采样）、温育、无菌处理，细胞和用品贮存等。细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。 2、常用设施及设备 （1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。 （2）无菌操作间：一般由更衣间、缓部间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。 （3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物品。

7、 （4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。 （5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。 3、培养器皿 细胞培养以玻璃器皿为主，常准备最需是使用最的三倍。器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。常用的玻璃器皿有下面几种。 （1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常以500ml、250ml、100ml生理盐水瓶或血浆瓶代替。 （2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml

8、等几种。用于外周血培养的常用10ml普通圆瓶。两种培养瓶均要求选用优质玻璃制成。 （3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径30mm、60mm、120mm等几种。 （4）吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。常用1ml和10ml两种。短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。 （5）离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为50ml、30ml、15ml；后者则多为10ml和5ml。 （6）其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器

9、等。 四、培养细胞形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支技物表面生长。如羊水细胞为贴附型细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞生长。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 1、成纤维型细胞 在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3厘米个长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。 2、上皮型细胞 此类型细胞在培养器皿支持物上生长

10、具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有园形核，细胞紧密相连单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。 3、游走型细胞 本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细腻包形态。常见于羊水细胞培养的早期。 五、培养细胞形态分析 培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2

11、个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等，表明细胞代谢不良。 六、培养用品的清洗与消毒 目前我国细胞培养器皿主要仍使用能反复使用的玻璃器皿，清洗的主要目的为清除杂质和微生物，使在器皿内不残留任何影响细胞生长的成份。因而在组织细胞培养中清洗和消毒是一项极为重要的环节。 （一） 清洗 在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。因此对新使用和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同的清洗方法。 1、玻璃器皿的清洗 组织细胞培养中

12、，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、侵酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质。 （1）浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液（5）浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。 （2

13、）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。 （3）浸酸：清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。清洁液去污能力很强。是清洗过程中关键的一环。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于6小时。 清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的下列三种： 重铬酸钾（g） 浓硫酸（ml） 蒸馏水（ml） （A）强清洁液 63 1000 200000 B）次强清洗液 120 200 1000 （

14、C）弱清洁液 100 100 100 清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。 （4）冲洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或洁液的残迹。冲洗最好用洗涤装置。即省力、效果又好。如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每天水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用。 2、胶塞的清洗 细胞培养中所

15、用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟，晾干备用。 3、塑料制品的清洗 塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用2% NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。 （二）消毒 细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌，真菌和病毒等微生物的污染，污染主要是由于

16、操作者的疏忽而引起，常见的原因有操作间或周围空间的不洁，培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底，由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染。消毒方法分为三类： （A） 物理灭菌法（紫外线、湿热、过渣等）。 （B） 化学灭菌法（各种化学消毒剂）。 （C） 抗生素。 （1）紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌，培养室紫外线灯应距地面不超过2.5米，且消毒进物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。 紫外线可产生臭氧，污染空气，试剂及培养

17、液都有不良影响，对人皮肤也有伤害，不宜近照射也进行实验操作。 （2）温热消毒：即高压蒸气消毒，是一种使用最广泛、效果最好的消毒方法。温热消毒时，消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险，保证其内气体的流通。在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始记算消毒时间。消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止消毒及表皮意外事件发生。 常用物品消毒压力及时间： 培养液、橡胶制品、10磅10分钟； 布类、玻璃制品、金属器械、18磅20分钟。 上两种是最常见的物理消毒方

18、法。 （3）化学消毒法：最常见的是70%酒精及1的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。化学消毒法操作简单、方便有效。 （4）抗生素消毒：确切应记成抗生素灭菌，主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。 无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每 次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间 污染。实验完毕后

19、，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间 隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可 以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦 拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操 作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打 开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用， 尽量勿将

20、瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程 中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐 针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/H

21、EPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。实验用品 1. 种类 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌 制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypr

22、opylene (PP) 为不透 明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml 2. 清洗 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.10.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干 净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸

23、包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于 oven 中烘干。 3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170 oC, 4 小时。 3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高 压灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟处理。培养基 1. 液体培养基贮存于4 oC 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 oC 水槽中温热。 2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳， 可以再添加适量glutamine。 3. 粉末培养基配制(以1 升为例)

24、： 3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为 7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成 pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合， 然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生 长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。 3.2. 材料： 3.2.1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要) 3.2.2. 粉末培养基 3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019) 3.2

25、.4. 电磁搅拌器 3.2.5. 无菌血清瓶 3.2.6. 0.1 或0.2 mm无菌过滤膜 3.2.7. pH meter 3.2.8. 真空帮浦 3.2.9. CO2 气体 3.3. 步骤： 3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。 3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。 3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后 溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需

26、用酸碱再调整之。 若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时， pH 会升高0.1-0.2。 3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养 基种类、日期、瓶号等，贮存于4 oC。(血清亦可加入培养基中一起过滤) 3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。 4. 配制培养基之生长测试 4.1. 材料： 4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) 4.1.3. methanol 4.1.4.

27、 glacial acetic acid 4.1.5. 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)4.2. 步骤： 4.2.1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35 mm TC dish) 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。 4.2.2. 接种57 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群 落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。 4.2.3. 去除培养基，加入1 ml Carnoys 固定液(甲醇：冰醋酸 3:1)，室温下静 置10

28、 min。 4.2.4. 去除固定液，水洗二次。 4.2.5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，室温下静置染色2-3 min。 4.2.6. 去除染液，水洗二次。 4.2.7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不 佳，则丢弃之。抗生素 1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素 1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。 1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待 token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。 2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask

29、 时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。 3. 若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。 4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。 5. 抗生素使用种类与浓度： 工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌 penicilli

30、n 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20

31、 yeast and molds血清 1. 血清必须贮存于20 -70 oC，若存放于4 oC，请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将4045 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加 入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。 3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 oC 或70 oC 至4 oC 冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装4045 ml。在溶解过

32、程中须规则摇 晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由20 oC 直接 至37 oC 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 4. heat-inactivation 是指56 oC, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建 议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有： cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine

33、 from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿将血清置于37 oC 太久，若在37 oC 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较 不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。 6. 血清之沈淀物 6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性 及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本 身之品

34、质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上 清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会 阻塞过滤膜。 6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。 有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清 放在37 oC 中欲培养此“微生物“，但在37 oC 环境下，又会使此沈淀物增多，更 会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此 小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批 号的血清。 7. 血清之生长测试

35、 7.1. 材料： 7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 ) 7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish) 7.1.4. methanol 7.1.5. glacial acetic acid 7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013) 7.2. 步骤： 7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS (已

36、测试过) 培养MDCK 细胞于T75 flask 至80 % confluency。 7.2.2. 以trypsin-EDTA 处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM 制成细 胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM 稀释细胞浓度为1×102 活 细胞数/ ml。 7.2.3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同浓度的血 清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血清最终浓度为10 % , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血

37、清同时进行对照组试验。 7.2.4. 37 oC，5 % CO2 培养箱培养5-7 天，期间不需更换培养基，待细胞群落大 到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。 7.2.5. 去除培养基，加入1 ml Carnoys 固定液(甲醇:冰醋酸 3:1)，室温下静 置10 min。 7.2.6. 去除固定液，水洗二次。 7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，室温下静置染色2-3 min。 7.2.8. 去除染液，水洗二次。 7.2.9. 以肉眼计数群落数 7.2.10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no.

38、of colonies / well ) / 100 x 100 % 7.2.11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) x100 % 7.3. 比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长的影响。 7.4. 订购多量同一批号的优良血清，置于70 oC 保存之冷冻细胞活化 1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死 亡。 2. 细胞活化后，约需数日，

39、或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生 单株抗体或是其它蛋白质)。 3. 材料 3.1 37 oC 恒温水槽 3.2 新鲜培养基 3.3 无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶 3.4 液氮或干冰容器 4. 步骤： 4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时 盖子易松掉。 4.3 将新鲜培养基置于37 °C 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无 菌操作台内。 4.4 取出冷冻管，立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全 部融化

40、，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。 4.5 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为 1:101:15)，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作 存活测试。 4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol)，依细胞种类而异， 一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞 悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内，离心1,000 rpm, 5 分钟，移去上清 液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。 4.7 若不需立即去除冷冻保存剂

41、，则在解冻培养后隔日更换培养基。 细胞传代培养 1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞 种类而异。 2. 材料： 2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbeccos phosphate-buffered saline, Ca+/Mg+ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于20 oC，使用前放在37 oC 水槽

42、 回温。 2.3. 新鲜培养基 2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 3. 步骤： 3.1. 附着型胞(adherent cell) 3.1.1. 吸掉旧培养液。 3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。 3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 oC 作用数分钟，于倒 立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA 溶 液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA 作用后，加入适量含血清 之新鲜培养基终止trypsin 作用，离心后再吸掉上清液。) 3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞

43、自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数 次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常 培养条件培养。 3.2. 悬浮型细胞(suspension cell) 3.2.1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 3.2.2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的 培养瓶中，以正常培养条件培养。 3.3. 融合瘤(hybridoma) 3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可 能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基 稀释细胞浓

44、度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。细胞计数与存活测试 1. 原理： 1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。 1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形， 其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方 盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计 数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞 数目。 1.3. 存活测试之步骤为dye ex

45、clusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细 胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细 胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。 2. 材料： 2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.2. Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100

46、ml Ca+/Mg+ free saline 2.3. 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip) 2.4. 计数器(counter) 2.5. 低倍倒立显微镜 2.6. 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) 3. 步骤： 3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于 1.5ml 小离心管中。 3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于 100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染

47、色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin bluish)。 3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue 等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml *每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细 胞。 3.5. 范例： T75 monolayer

48、culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之 细胞数目。 活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59 死细胞数/方格：5, 3, 4, 6 细胞总数= 243 平均细胞数/方格= 60.75 稀释倍数= 2 细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 细胞数/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率：225/24392.6 %细胞冷冻保存 1. 注意事项： 1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log p

49、hase) 且存活率高之状态，约为80 90 致密度。 1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二 日测试是否有抗体之产生。 1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以510 ml 小体积 分装，4 oC 避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽 灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 1.4. 冷冻保存之细胞浓度： 1.4.1. normal human

50、 fibroblast: 13 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 13 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻 浓度太高而在解冻24 小时后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 57 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须 较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 510 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106 cells/ml。 1.5.

51、冷冻保护剂浓度为5 或10 DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保 存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。 1.6. 冷冻方法： 1.6.1. 传统方法: 4 oC 10 分钟-> -20 oC 30 分钟-> -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜) -> 液氮槽vapor phase 长期储存。 1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以1 -3 oC/分钟之速度由室温降至120 oC， 放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。 2. 材料： 2.1. 生长良好之培养细胞 2.2. 新

52、鲜培养基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球计数盘与盖玻片 2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II) 3. 步骤： 3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。 3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10 ，混合均匀，置于室温下待用。 3.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细

53、 胞浓度及冻前存活率。 3.4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混 合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污 染检测。 3.5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 10 分钟 -20 oC 30 分钟 -80 oC 1618 小 时(或隔夜) 液氮槽vapor phase 长期储存。 3.6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序 为: program 7: HB CELL收到细胞的处理方式 细胞活化 1. 收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有

54、解冻情形， 若有请立即通知。细胞 株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于70 °C， 隔夜后， 移到liq N2)。 2. 冷冻细胞解冻程序: 2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比 例， 制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之 血清种类， 若因实验需要， 必须有所不同时， 务必以缓慢比例渐次改变培养 基组成， 确定细胞适应后， 方进行所需之实验。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言

55、差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种 类培养之。 2.3. 将培养基置于37 °C 水槽中回温， 回温后喷以70 % 酒精并擦拭之， 移入无 菌操作台内。取出冷冻管， 立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 水面高度不可 接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全 部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部， 移入无菌操作台内。 2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask 中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基， 混 合均匀，放入37 &

56、#176;C，5 % CO2 培养箱培养。 2.5. 对绝大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活 化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除， 待第二天确定细胞生长或贴附良 好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需 立即去除DMSO 者， 则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中， 离心300 xg (约1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基， 将细胞均匀混合后， 转移至培养瓶中， 再放入37 °C， 5 % CO2 培养箱培养。 收到T25 flask 细胞时， 处理方式为 1. 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。请检查 flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题， 不 要打开盖子，请立即通知细胞实验室。 2. 将原封之T25 flask 静置于37 °C， 5 % CO2 培养箱中，使细胞回温至37 °C， 并 让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出flask 内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依 一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，