Chapter 9 常见HPLC问题的故障排除_1

1、2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 2 发现问题发现问题 定位问题定位问题 纠正问题纠正问题 防止问题的再发生防止问题的再发生 2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 3 色谱问题潜在的来源 性能监测 反压 谱带展宽 色谱问题故障排除 峰形问题 保留时间问题 额外的峰 基线问题 系统维护与保存 溶剂注意事项 色谱柱保存2009 Waters Corporation | COMPANY CONF

2、IDENTIAL 4合理的逻辑判断合理的逻辑判断 将会节省解决问题的时间将会节省解决问题的时间 流动相流动相 进样器进样器 在线过滤器在线过滤器 色谱柱色谱柱 检测器检测器 样品样品 泵泵 保护柱保护柱 连接管线及接头连接管线及接头 积分仪积分仪/记录仪记录仪/软件软件2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 5简化问题简化问题 评估对试验室效率的影响评估对试验室效率的影响 观察色谱图观察色谱图 尝试分类问题尝试分类问题 最先对最容易的部分进行故障排除最先对最容易的部分进行故障排除 问题机械问题机械问题化学问题化学问题色谱柱色谱柱保护柱保护柱

3、流动相流动相样品样品/样品瓶问题样品瓶问题 泵泵 进样器进样器 检测器检测器 数据采集数据采集谱带展宽谱带展宽连接管路连接管路色谱柱色谱柱样品瓶样品瓶2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 6 反压 谱带展宽2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 7 怎样在优异的分离度下得到良好的峰形?怎样得到好的分离以及尖锐的峰形？ 好的峰形谱带 好的分离 (良好的机械和化学性能) 检测器检测器 池池Waters c 19982009 Waters Corporation | COMPANY CONF

4、IDENTIAL 8 设置一个标准物质和一组参考的参数 使用样品优化试验，定义一系列的条件 使用与成产商一样的测试 使用自己的方法2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 9 使用与生产商一致的测试 优点o 结果可比较 缺点o 只能检查色谱柱的柱效，保留与不对称因子o 需要特定的色谱柱流动相与测试化合物 使用自己的方法 监测至少一个峰 特定峰对的理论塔板数（N），不对称因子（As），保留（k），选择性（）2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 10 反压太高? 除去色谱柱，压力是否正常？o

5、 更换/冲洗色谱柱 从系统的末段，系统地除去管路/模块，压力是否正常？o 更换管路/维修模块 反压太低/压力波动？ 流速正确否？ 泵内有空气 流动相脱气 检查渗漏2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 112009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 122009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 13 柱外谱带展宽效应 进样体积 进样器 管路连接o 进样器到色谱柱o 色谱柱到检测器 螺丝和锥箍 检测器体积2009 Waters Corpora

6、tion | COMPANY CONFIDENTIAL 14 观察到的谱带展宽tot 是所有对谱带展宽效应有贡献的总和o 色谱柱o 柱外EC 仪器组件2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 15 测定步骤 从系统中取下色谱柱 将进样器与检测器直接连接o 流速 1.0ml/mino 检测器灵敏度 0.5-1.0AUFSo 检测器时间常数 0.2s或者更小 将柱效测定样品用流动相稀释10倍，进样量2ul2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 16 典型的LC系统的谱带展宽应该在100ul20

7、ul 微柱系统应 25ul使用使用5sigma法测量峰高法测量峰高4.4%处的峰宽：处的峰宽：谱带展宽（谱带展宽（L）= 1000峰宽（峰宽（PW，seconds）/602009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 17仪器仪器A：谱带展宽较小谱带展宽较小（70L）测出的塔板数较高测出的塔板数较高（12,000）仪器仪器B：谱带展宽较大（谱带展宽较大（120L）测出的塔板数较低（测出的塔板数较低（8,000）相同的色谱柱2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 18 .009.020.040注意

8、连接管路的不同内径注意连接管路的不同内径2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 19.009.020.040样品谱带在管路内部扩散样品谱带在管路内部扩散 注意注意: 较长的管路制造了更多的谱带展宽较长的管路制造了更多的谱带展宽2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 20谱带展宽谱带展宽连接适当连接不妥由于色谱柱连接不当引起的谱带展宽，机械问题连接不妥，造成漏液2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 212009 Waters Corp

9、oration | COMPANY CONFIDENTIAL 22额外的谱带额外的谱带扩展体积扩展体积 2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 23良好的色谱图差的色谱图注意：峰高变低，峰展宽，峰拖尾，尤其是最后一个峰2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 24 峰形问题 保留问题 额外的峰 基线问题2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 25 在线过滤器/保护柱污染 色谱柱受损 次级相互作用 色谱柱超载 质量超载 体积超载 其他的柱

10、外效应 采样速率 检测器时间常数/滤波常数2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 26 机械问题 管路与接头 色谱柱塌陷 在线过滤器污染 进样器问题 化学问题 样品溶剂问题 化学问题 硅羟基活性 色谱柱超载 共同洗脱 来自于前一次进样的峰所有的峰都受影响了吗？是 否2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 27 在线过滤器污染新的滤芯，压力800psi污染的滤芯，压力2500psi2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 28 所有的峰都

11、有变化 色谱柱 连接 更换筛板 再生或者更换色谱柱 色谱柱被破坏 pH8, 硅胶基质溶解双峰 前沿峰2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 29色谱柱填料塌陷色谱柱填料塌陷装填良好的色谱柱装填良好的色谱柱2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 30 样品与键合相的疏水相互作用疏水相互作用及与带电位点的离子交换作用 碱性化合物碱性化合物碱性化合物碱性化合物O-SiO-SiO- O-SiO-SiO- O-SiO- O-SiO-SiO-SiO- O-SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-

12、SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+流动相的pH 90非浸润表面 10,000次进样 保护柱应当被认为是延长分析色谱柱使用寿命的一种划算的牺牲 保护柱的填料应该与分析色谱柱一致 实际上，设计、装填良好的保护柱将改善分析色谱柱的分离效率2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 62 以磺酸类药物为样品，色谱柱使用保护柱的使用寿命范围 A：使用Symmetry C8 Sentry 保护柱的初次进样 B：同一根Sentry 保护柱进样950次后 C：在分析柱上换上全新的Sentry 保

13、护柱的第951次进样2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 63 保护色谱柱的其他技术 在进样器与色谱柱之间的在线过滤器 样品的过滤（不能防护密封圈的脱落物） 通过固相提取（SPE）净化样品2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 64 短期内（72 hrs）可以储存在流动相中 较长的时期要储存在出厂的溶剂中 色谱柱应保存在生产厂商推荐的溶剂中 对于键合相色谱柱，使用有机溶剂（例如甲醇或者乙腈）。使用非水相溶剂使水解的趋势最小化 某些键合相（CN）在极性有机流动相内会变得不稳定。储存在水或

14、者缓冲液中即可。对于CN键合相，乙腈是最糟糕的流动相。2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 65 在色谱柱入口处，微生物生长及其残骸的例子填料色谱柱筛板2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 66用20倍柱体积的HPLC级溶剂清洗,将柱温升高到35-55会增加清洗的效率极性样品非极性样品蛋白样品1.水1.异丙醇或合适比例的水溶液1.重复进样少量DMSO(二甲基亚砜)2.甲醇2.四氢呋喃2.梯度洗脱,从10%到90%的B液3.四氢呋喃3.二氯甲烷A=0.1%TFA水溶液B=0.1%TFA

15、乙腈溶液4.甲醇4.正己烷3.梯度清洗,从10%到90%的B液.A=水,B=乙腈5.水5.异丙醇,接着用合适比例的异丙醇/水混合溶液4.流动相6.流动相6.流动相2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 67极性样品1. 水2. 甲醇3. THF4. 甲醇5. 水6. 流动相非极性样品1. 氯仿2. 甲醇3. 二氯甲烷4. 庚烷或者异辛烷5. 异丙醇6. 流动相硅胶基质色谱柱：极性键合相2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 68 时刻监视反压。 测定系统的谱带展宽。 设置一个标准的试验条

16、件。 使用故障排除的步骤系统地工作，以找出问题。 记录问题和解决方案供日后参考。2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 69 观察二张色谱图。从相同的HPLC系统中得到色谱图的不同应归于： 在进样器前漏液 柱温的增加 柱温的降低 检测器的流动池渗漏2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 70 此色谱图是来源于示差检测器的。基线上小的负峰应归于： 污染的流动相 在分析过程中组分的分解 泵的脉动 检测器噪音2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENT

17、IAL 71 来自于同一HPLC系统的色谱图。色谱图上显示出的问题是什么引起的？ 从第一张图到第二张图，流速降低了 流动相组成不同 色谱柱丧失了柱效 这二个组分具有二种平衡模式2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 72 来源于示差检测器的色谱图。基线漂移可能的起因是： 检测器流动池（参比池或者样品池一侧）的空气 温度的改变 流动相平衡不完全 流动相的污染2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL 73 紫外检测器254nm采集得到的色谱图。负峰（峰2）应归于： 来源于前一次进样的物质被洗脱 流动相的吸收值比化合物2的吸收值高 示差折光的影响 化合物2的浓度低2009 Waters Corporati