血清清蛋白、γ

1、血清清蛋白、 -球蛋白的分离、提纯与鉴定一、实验目的1. 掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法；2. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法；3. 了解柱层析技术。二、实验原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分 离教果。1盐析蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素： 表面的电荷和水化膜 。 当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀 析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重 金属盐法以及生物碱

2、试剂法等。 盐析法的原理是：中性盐如硫酸铵 （NH ）SO4）等对蛋 白质作用破坏了蛋白质表面水化膜，并且中和了部分电荷，从而使蛋白质相互聚集而析 出。由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析 所需的盐浓度也不同，因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。 血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀 ，利用此特 性可把蛋白质分段沉淀下来，即在半饱和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，离 心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解，由此达到分离清蛋白和 白蛋白的目的。2脱盐盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有

3、脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐， 常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝 胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不 能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速 度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以 流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。分段收集蛋白质洗脱液，即可得 到脱盐的蛋白质。3.纯化（离子交换层析）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程 。带正电荷的交 换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实

4、验采用的 DEAE 纤维素是一种阴离子交换剂， 溶液中带负电荷的离子可与其进 行交换结合，带正电荷的点正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白， 利用它们的等电点的不同可进行分离 。血 清中各种蛋白质的 pI 各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷 不同，可以通过 DEAE 离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来。4. 纯度鉴定（电泳）血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于 pH7.4。它们在 pH8.6 的缓冲液中均 解离带负电荷，在电场中向正极移动。 由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的 电荷量不同，因而在醋酸纤维素

5、薄膜上电泳的速度也不同 。因此可以将它们分离为清蛋 白（ Albumin） 、1-球蛋白、 2-球蛋白、 -球蛋白、 -球蛋白 5条区带。三、材料与方法：以流程图示意1.实验材料人血清、葡聚糖凝胶 G-25（Sephadex G-25）层析柱、二乙基氨基乙基 （DEAE）纤维素离子 学习参考交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、 0.3mol/l 的 PH6.5醋酸铵缓冲液、 0.06mol/l 的 PH6.5醋 酸铵缓冲液、 0.02mol/l 的 PH6.5醋酸铵缓冲液、 1.5mol/l 的 NaCl-0.3mol/NH4AC 溶液、 20%磺基水杨酸、 1%BaCl2 溶液、电泳仪、电泳槽。2.

6、实验方法1) 实验流程2) 实验步骤 盐析：中性盐沉淀步骤步骤操作(1)盐析取离心管一个，加入 0.8mol 人或动物血清，边摇边缓慢滴入饱 和硫酸铵溶液 0.8ml ，混匀后室温下放置 10min ，离心 10min (4000r/min)。用滴管小心吸出上清液置于试管中，作为纯化清蛋 白之用(2)溶解向离心管的沉淀加入 0.6mol 蒸馏水，振摇使之溶解，作为纯化沉淀球蛋白用注意：上层清夜尽量全部吸出，但不可吸出沉淀物 脱盐：过凝胶层析柱步骤步骤操作（1）调节层析柱 液面葡萄糖凝胶 G-25层析柱经 0.02mol/L、pH6.5 NH4AC 缓冲液流洗平衡后，取下恒压储液瓶管塞，小心控制

7、柱下端螺旋夹，使层析柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床液面（2）加样品用细长滴管吸取上述经盐析所得的粗制蛋白质溶液，小心而缓慢 的加入凝胶床上面，柱下端用 10ml 刻度离心管接液，拧松柱下 螺旋夹，调节适当流速，使样品进入凝胶床，至液面降到凝胶床 表面为止（3）洗层析柱小心用 0.02mol/L、pH6.5 NH4AC 缓冲液洗涤层析柱内壁，以洗涤粘在柱壁上的蛋白质样品液（4）洗脱待样品液进入凝胶床内，继续用 0.02mol/L、 pH6.5 NH4AC 缓冲液流洗，同时注意流出液量5）检测及收集蛋白质在黑色反应板凹孔内加 2滴 0.92mol/L磺基水杨酸，随时检查 流出液是否含有蛋白质，滴流

8、出液 1 滴黑色反应板凹孔内接触 到磺基水杨酸溶液，若出先白色混浊或沉淀，表示已有蛋白质流 出（当凝胶床体积为 5.5ml 时，流出的液体量约为 2ml 就可能有 蛋白质流出），立即收集流出的蛋白质溶液。收集约 12 滴后， 滴流出液 1滴于预先加有 1滴 0.05mol/L（1%）BaCl 2的黑色反应板 凹孔内，一旦见出现白色沉淀（表示有 SO42-），立即停止收集 收集的蛋白质溶液即可分别过 DEAE 纤维素柱， 进行离子交换层 析（6）层析柱再生平 收集蛋白质溶液后的凝胶层析柱继续用 0.02mol/L pH6.5 NH4AC衡 缓冲液流洗，用 BaCl2 液检测层析柱流出液，当流出液

9、用 BaCl2 检查 SO42-为阴性后，继续洗涤 23ml。凝胶层析柱即可再生平衡，可再次使用注意： a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时，不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。 b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。 C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。d.洗脱是应注意及时收集样品， 切勿使蛋白质峰溶液流失。 e.葡萄糖凝胶价钱昂贵， 要回收再生避免损耗， 严禁倒掉。 球蛋白的纯化：过 DEAE 纤维素阴离子交换层析柱步骤操作（1）调节层析柱换冲液面经处

10、理再生好的 DEAE 纤维素层析柱，取下其恒压储液瓶 管塞。小心控制柱下端螺旋夹， 使柱上缓冲液面刚好下降到 纤维素床表面。柱下端用 10ml 刻度离心管收集液体，以便 了解加样后液体的流出量。（2）加样品将除除盐后收集的球蛋白溶液缓慢加到纤维素柱上， 调节层 析柱下端的螺旋夹使样品进入纤维素柱床， 至液面降到纤维 素柱床表面为止。（3）析层析小心用 1ml 0.02mol/L PH 6.5 的醋酸铵缓冲液洗涤沾在柱壁 上的蛋白质样品液。（4）洗脱待样品进入纤维素柱床内，继续用 0.02mol/L PH 6.5 的醋酸铵缓冲液流洗，。同时注意流出液量（5）检测及收集蛋白质流洗时，随时用 0.9

11、2mol/L 磺基水杨酸检查流出液中是否含 蛋白质（方法同前）当有蛋白质出现时， 立即连续收集三管， 每管10滴，。此不被 DEAE 纤维素吸附的蛋白质即为纯化 的 - 球蛋白，取其中蛋白质浓度最高的一管留作鉴定用。注意： a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时，不要使液面低于 纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。 b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢 加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。 C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸 与检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，特别是收集伽马球蛋白时。

12、 清蛋白的纯化：过 DEAE 纤维素阴离子交换层析柱（1）调节层析柱缓冲液面2）加样品（3）洗层析柱4）洗脱（ 6）纤维素学习层参考析 住的 再此时 DEAE 纤维素层析柱不必再生，可直接用于纯化清蛋白 小心控制住下端螺旋夹，使柱上缓冲液面刚好下降到纤维素床 表面，柱下端用 10ml 刻度离心管收集液体，以便了解加样后 液体流出量 将除盐后收集的清蛋白溶液缓慢加到纤维素柱上，调节层析柱 下端的螺旋夹，使样品进入纤维素柱床，至液面降到纤维素柱 床表面为止将除盐的粗制清蛋白溶液上柱后，改到0.06mol/L 、 pH6.5NH4AC 缓冲液洗脱小心用 1ml 0.06mol/L 、pH6.5 NH

13、4AC 缓冲液洗涤沾在柱壁上的 蛋白质样品液待样品进入纤维素柱床内，继续用 0.06mol/L、pH6.5 NH4AC 缓冲液流洗。同时注意流出液量。流出约 6ml（其中含 -球蛋 白及 -球蛋白）后，将柱上的缓冲液面降至与纤维素表面平齐。 改用 0.3mol/L、pH6.5 NH4AC 缓冲液洗脱5）检测及 用 0.92mol/L（20%）磺基水杨酸检查流出液是否含有蛋白质 （方收集蛋白质 法同前）。由于纯化的清蛋白仍然结合有少量胆色素等物质，故肉眼可见一层浅黄色的成分被 0.3mol/L、pH6.5 NH4AC 缓冲 液洗脱下来，大约改用 0.3mol/L NH4AC 缓冲液洗脱约 2.5

14、ml 时，即可在流出液中试出有蛋白质出现，立即连续收集 2 管， 每管 10 滴，此即为纯化的清蛋白液，留作纯度鉴定用 用过的 DEAE 纤维素层析柱，应重新再生平衡 先用约 6ml 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4AC 溶液流洗，再用注意： a.当层析柱的缓冲页面或样品页面刚好下降到纤维素膜表层时，不要是液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。 b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢 加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。 C.使用时切勿将各时段所用的溶液 浓度搞混。 d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。 纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）步

15、骤操作准备电泳槽准备：将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥 缓冲溶液， 使其在同一水平 a，页面与支架距离 22.5cm，用三层 滤纸或双层纱布搭桥薄膜准备：将醋酸纤维薄膜裁成 2cm乘以 8cm 大小共四段，在薄 膜一段 1.5cm 处用铅笔轻轻画上一条横线为点样线，末端用铅笔 做记号。进入巴比妥溶液中直至浸润完全。用镊子青青取出，粗 面朝上，平放在两层干滤纸中间，轻轻拭去多余的缓冲液。点样薄膜片置于干净的玻璃或滤纸片上，粗面朝上，用玻片或载玻片 一段的截面在盛有样品的直接沾取 23 微升待测品，让后将样品 与薄膜点样先轻轻接触，均匀分布在点样线上，带样品渗入薄膜 后移开，四种样品分

16、别点样。电泳将已点好的样品薄膜放在铺有滤纸盐桥的电泳槽上， 点样面朝下， 点样端至阴极，轻轻拉平薄膜。平衡约 5min，使缓冲液渗透大道 平衡。接好电路，调节电压开始电泳。待各个样品没有变化停止 电泳，并轻轻取出。染色漂洗和鉴定将染色液倒入大培养皿中，电泳完毕后用镊子取出薄膜，直接浸入染色约 5min。后将薄膜取出，漂洗至背景无色，观察电泳情况得出结论四、结果与讨论 ：结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑推 论，并得出结论。1. 实验结果从电泳图谱中可以看出，清蛋白第一管和清蛋白第二管的蛋白质与血清的清蛋白电泳 图谱几乎一致，可以确定管内的蛋白质为清蛋白，同理球蛋白管内的蛋白质

17、为- 球蛋白。2. 实验讨论1) 血清电泳中个别电泳带的两条带之间界限不明显 染色时，醋酸纤维薄膜不是一张一张放入染色液的，在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠，造成薄膜上还未固定的血清蛋白彼此粘连。 染色时间控制不合适。因为时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不宜区 分，或造成条带染色不均； 透明时间控制不合适， 如在透明液中浸泡时间太长则薄膜溶解， 太短则透明度不佳。2) 第一管血清蛋白电泳带参差不齐 薄膜表面吸干时吸的太干或吸的不完全。 因为点样时应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，

18、影响分离效果； 点样不均匀。3) 第一管血清蛋白中含有少量杂质致使电泳图出现偏差。思考题1. 硫酸铵盐析一步 ,为什么是 0.8ml 血清加 0.8ml 饱和硫酸铵 ?血清球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中发生沉淀， 而血清清蛋白在完全饱和硫酸铵溶液 中沉淀，将血清和饱和硫酸铵等体积混合后，其状态相当于在半饱和硫酸铵溶液中，在 此状态下，球蛋白沉淀，而清蛋白不沉淀，因而可以将其分开。2. 为什么实验中 DEAE 纤维素柱分离 -球蛋白后不用再生 ,可直接用于纯化清蛋白 ? 因为 -球蛋白带正电荷， 不与 DEAE 结合，会从层析柱中首先洗脱出来， 所以分离 -球蛋白后可直接用于纯化清蛋白。3. 应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和-球蛋白的纯度 ,根据什么来确定它是清蛋白还是 -球蛋白 ?判定它们纯度的依据是什么 ? 由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄 膜上电泳的速度也不同，实验的得到的电泳带的位置也不相同。在 5 种蛋白中，血清蛋 白的等电点和相对分子质量最小， -球