酸奶的制作(1)汇编

1、u 微生物概述u 发酵的概念u 酸奶制作u 细胞破碎 一、微生物概述微生物概述砧板上的微生物砧板上的微生物一般人每个喷嚏含一般人每个喷嚏含有约有约 4500-150000个个病菌，而感冒病人病菌，而感冒病人一个喷嚏则含有高一个喷嚏则含有高达达8500万个病菌万个病菌 手手100-1000个个/平方厘米；平方厘米；额头额头1000-100,000个个/平方平方厘米；头皮约厘米；头皮约1000,000个个/平方厘米。平方厘米。皮肤、皮肤、毛发毛发上分上分布的布的细菌细菌卤豆腐卤豆腐毛霉毛霉酸奶酸奶乳酸菌乳酸菌有害真菌有害真菌微生物的概念o 是存在于自然界的一群是存在于自然界的一群肉眼直接看不见肉眼

2、直接看不见，必须，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物（microorganism或或microbe）。微生物的共同特点（小、多、快、强、广） （1）体积小，面积大 （细胞以微米、纳 米来计算） （2）吸收多，转化快 （3）生长旺，繁殖快 如大肠杆菌 （4）适应强，易变异 如感冒病毒 （5）分布广，种类多个体形态需要借助个体形态需要借助光学显微镜或电子显微镜观察光学显微镜或电子显微镜观察电子显微镜电子显微镜微生物的分类 非细胞型微生物非细胞型微生物 原核细胞型微生物原核细胞型

3、微生物 真核细胞型微生物真核细胞型微生物 非细胞型微生物非细胞型微生物o 无典型的细胞结构，无产生能量的酶系统，只能在无典型的细胞结构，无产生能量的酶系统，只能在活细胞内生长增殖。活细胞内生长增殖。o 含一种类型的核酸或遗传物质（含一种类型的核酸或遗传物质（DNA或或RNA）。）。o 是是最小最小的一类微生物。的一类微生物。o 病病 毒毒 15原核细胞型微生物原核细胞型微生物v 有细胞结构，但细胞核呈原始状态，即环状裸有细胞结构，但细胞核呈原始状态，即环状裸DNA团块状，无核膜、核仁。团块状，无核膜、核仁。v 细胞器很不完善，只有细胞器很不完善，只有核糖体核糖体；含；含DNA和和RNA。v 有

4、有6类类：细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌旋体、放线菌17真核细胞型微生物真核细胞型微生物 v 细胞核分化程度高，有核膜和核仁，多种完整细胞核分化程度高，有核膜和核仁，多种完整的细胞器。的细胞器。v 分为单细胞真菌和多细胞真菌。分为单细胞真菌和多细胞真菌。o 真菌真菌 真真 菌菌 19三大型微生物的比较三大型微生物的比较类型类型特点特点种类种类非细胞型非细胞型微生物微生物无完整的细胞结构，只无完整的细胞结构，只在活细胞内增殖在活细胞内增殖病毒病毒原核细胞型原核细胞型微生物微生物仅有原始核，仅有原始核，缺乏完整的细胞器缺乏完整的细胞器细菌、放线菌、

5、细菌、放线菌、衣原体、支原体、立克衣原体、支原体、立克次体、螺旋体次体、螺旋体真核细胞型真核细胞型微生物微生物有典型的细胞核，有典型的细胞核，有完整的细胞器有完整的细胞器真菌真菌微生物与人类的关系微生物与人类的关系o 绝大多数微生物对人类和动植物是有益的、绝大多数微生物对人类和动植物是有益的、而且有些是必需的。而且有些是必需的。o 在人类社会生活的各个方面可见到微生物在人类社会生活的各个方面可见到微生物的参与。的参与。o 微生物制药、微生物冶金、微生物治理环微生物制药、微生物冶金、微生物治理环境、微生物食品等等。境、微生物食品等等。微生物学研究的重要意义（一）在环境中的作用 微生物在生态系统中

6、的地位利用微生物改善环境微生物对环境的有害影响（二）医药（三）食品（四）生物技术（五）科学研究 微生物繁殖快、价值低，没有种族上的异议，是很好的的实验材料分解者微生物消费者动物环境土壤、空气、水生产者植物（包括部分微生物）微生物在生态系统中的地位：分解者，部分生产者微生物学研究的重要意义食品v 有害影响 v 有利影响引起食品酸败（发霉、变质）、 食物中毒（如肉毒芽孢杆菌、黄曲霉毒素等） 以及其他疾病。食品微生物工程：酿酒、面包、酱油、酸奶酸奶等二、发酵的概念二、发酵的概念发酵是是指利用微生物的代谢功能，使有机物分解发酵是是指利用微生物的代谢功能，使有机物分解的生物化学反应过程。的生物化学反应过

7、程。酿酒、酿醋、面团的发酵、沼气的产生、酿酒、酿醋、面团的发酵、沼气的产生、垃圾的垃圾的腐败腐败微生物学的奠基人微生物学的奠基人伟大的巴斯德伟大的巴斯德18571857年巴斯德（法国）证明发酵是由于微生物的作用年巴斯德（法国）证明发酵是由于微生物的作用 生产实际中，人们将通过微生物的培养，生产实际中，人们将通过微生物的培养，大量生产各种代谢产物的过程叫做发酵。大量生产各种代谢产物的过程叫做发酵。 发酵工程的历程发酵工程的历程1，纯种微生物的分离，纯种微生物的分离2，培养技术的建立，培养技术的建立3，密闭式发酵罐，密闭式发酵罐4，发酵工程，发酵工程密闭式发酵罐密闭式发酵罐发酵罐发酵罐（一）酸奶定

8、义及实验原理酸奶酸奶(yogurt)是以牛奶等为原料，经乳酸菌发酵而成的一是以牛奶等为原料，经乳酸菌发酵而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制品。种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制品。基本原理：基本原理：牛奶中的乳糖牛奶中的乳糖乳酸菌发酵乳酸菌发酵乳酸乳酸牛奶中牛奶中酪蛋白酪蛋白变性凝固变性凝固奶液呈奶液呈凝乳凝乳状态状态同时，通过发酵还可形成酸奶同时，通过发酵还可形成酸奶特有的香味和风味（与形成乙特有的香味和风味（与形成乙醛、丁二酮、丙酮和挥发性酸醛、丁二酮、丙酮和挥发性酸等有关）。等有关）。1.按成品的组织状态分类：凝固型、搅拌型、饮料型、冷冻型。2.按发酵的加工工艺分类按发酵

9、的加工工艺分类 浓缩酸乳、冷冻酸乳、充气酸乳、酸乳粉3.按成品口味分类 天然纯酸奶、加糖酸乳、果料酸乳等天然纯酸奶、加糖酸乳、果料酸乳等3. 按菌种种类分类酸乳、双歧杆菌酸乳、嗜酸乳杆菌酸乳、干酪乳杆菌酸乳 等（二）酸奶的分类（二）酸奶的分类本实验主要学习本实验主要学习凝固性酸奶凝固性酸奶的制作方的制作方法。法。（三）酸奶的营养价值（三）酸奶的营养价值o 营养丰富，具有鲜乳所有的营养价值，而且优于鲜乳。营养丰富，具有鲜乳所有的营养价值，而且优于鲜乳。o 调节人体肠道中的微生物菌群平衡，抑制肠道有害菌调节人体肠道中的微生物菌群平衡，抑制肠道有害菌生长。生长。u降低胆固醇水平 u合成某些抗菌素，提

10、高人体抗病能力。 u缓解“乳糖不耐受症”。u有美容、润肤、明目、固齿等作用。（四）酸奶生产用原料主要原料：主要原料： 乳、奶粉、甜味剂、稳定剂、发酵剂、香精、乳、奶粉、甜味剂、稳定剂、发酵剂、香精、果料等。果料等。 1、酸乳的发酵剂菌种o根据联合国粮农组织（联合国粮农组织（FAO）关于酸乳的定义，酸乳中的特征菌为 嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。Streptococcus thermophilusLactobacillus bulgaricus 2、发酵剂的概念与种类1.乳酸菌发酵的发酵剂有三种类型： -乳酸菌纯培养物 -母发酵剂 -生产发酵剂发酵剂（发酵剂（starter）：指生产发酵乳制品时所

11、用）：指生产发酵乳制品时所用的特定微生物培养物。的特定微生物培养物。产粘发酵剂 -产香发酵剂 -加入干酪乳杆菌产粘、产酸程度适宜产香性好、发酵风味柔和保健效果好后酸化（即酸奶的pH值继续下降，以至出现消费者不可接受的过酸味及感官质量下降。 ）3、发酵剂选择标准4、发酵剂的制备培养基（脱脂奶）灭菌培养基（脱脂奶）灭菌将冻干或液体保藏菌种接入脱脂乳活化将冻干或液体保藏菌种接入脱脂乳活化（接种量（接种量12）下一级扩大培养（接种量下一级扩大培养（接种量23）母发酵剂母发酵剂生产发酵剂生产发酵剂纯菌纯菌活化活化扩大繁殖扩大繁殖母发酵剂母发酵剂中间发酵剂中间发酵剂工作发酵剂工作发酵剂将酸奶专用菌种嗜热链

12、球菌和将酸奶专用菌种嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌进行混合培养，保加利亚乳杆菌进行混合培养，经浓缩、真空冷冻干燥制得。经浓缩、真空冷冻干燥制得。可直接加入到热处理的原料乳中可直接加入到热处理的原料乳中进行发酵，而无需对其进行活化、进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其它预处理工作。扩培等其它预处理工作。接种前菌种先用少量灭菌后的水接种前菌种先用少量灭菌后的水分散开再使用。菌种加入量为还分散开再使用。菌种加入量为还原乳量的万分之一。原乳量的万分之一。直投式酸奶发酵剂直投式酸奶发酵剂实验材料实验材料 1菌种：菌种：本实验利用含有保加利亚乳杆菌本实验利用含有保加利亚乳杆菌(Lactobacillus b

13、ulgaricus)和嗜热链球菌和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)活菌的原味酸奶作为种子培养物。活菌的原味酸奶作为种子培养物。2发酵培养基：发酵培养基：160g/L全脂奶粉；全脂奶粉；30-40g/L白砂白砂糖；糖；pH自然。自然。注：全脂奶粉应不含抗生素注：全脂奶粉应不含抗生素3器材：器材： 无菌吸管、酸奶瓶、温度计、玻璃棒无菌吸管、酸奶瓶、温度计、玻璃棒酸奶制备实验酸奶制备实验实验方法实验方法器皿的清洁灭菌配制培养基接种培养品尝清洁卫生1工艺流程：全脂乳粉、白砂糖、水 混合均匀 灭菌(85-90，5-8min)冷却(43-45) 接种（接入10%的原味酸奶

14、） 封口室温发酵12小时 冷藏(25) 成 品2发酵培养基的消毒： 将乳粉、砂糖和水按比例混合均匀，加热至8590保持58min即可杀死病原菌和其它微生物。3接种： 将消毒后的牛乳迅速降温至45以下，在无菌操作台上用吸管接入10的原味酸奶。4封口、发酵： 接种后，封口后送培养箱保温发酵34h或室温发酵12h。5冷却后熟： 经检查，酸奶已达到凝固状态(pH达4243)时，取出置4条件下冷藏24h即得成品。 品尝自己制作的酸奶，判断其感官品质是否达到要求，若达不要求，分析其原因。o 实验流程图见指导材料一、超净工作台原理一、超净工作台原理洁净室内洁净室内 空气空气初效过滤器初效过滤器离心风机离心风

15、机高效过滤器高效过滤器洁净工作台面洁净工作台面洁净工作台结构示意图洁净工作台结构示意图电源控制电源控制风量调节风量调节风压监控风压监控净化系统净化系统二、超净工作台配置及应用二、超净工作台配置及应用初效过滤器初效过滤器洁净工作台面洁净工作台面1、水平流工作台原理图、水平流工作台原理图 初效过滤器初效过滤器 高效过滤器高效过滤器离心风机离心风机洁净室内洁净室内空气空气水平气流水平气流二、超净工作台配置及应用二、超净工作台配置及应用1 1 、水平流工作台介绍水平流工作台介绍初效过滤器高效过滤器空气净化系统防静电亚克力工作台控制系统防静电万向脚轮不锈钢台面节能灯照明灯水平流方向水平流方向 电源插座二

16、、超净工作台配置及应用二、超净工作台配置及应用洁净工作台面洁净工作台面2、垂直流工作台原理、垂直流工作台原理 初效过滤器初效过滤器 高效过滤器高效过滤器离心风机离心风机洁净室内洁净室内空气空气垂直气流垂直气流二、超净工作台配置及应用二、超净工作台配置及应用2 、垂直流工作台介绍垂直流工作台介绍空气净化系统工作台控制系统节能灯照明灯垂直流方向垂直流方向电源插座初效过滤器不锈钢台面防静电万向脚轮防静电亚克力高效过滤器手腕带插座三、超净工作台的使用三、超净工作台的使用使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒

17、。接通电源，提前接通电源，提前5050分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的微生物，微生物，3030分钟后，关闭紫外灯，开启送风机分钟后，关闭紫外灯，开启送风机 工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。毒剂擦拭消毒。最后开启工作台紫外灯，照射消毒最后开启工作台紫外灯，照射消毒

18、3030分钟后，关闭紫外灯，切断电源。分钟后，关闭紫外灯，切断电源。 每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术标准，应调节调压器每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术标准，应调节调压器手柄，改变风机输入电压，使工作台处于最佳状况。手柄，改变风机输入电压，使工作台处于最佳状况。 每月进行一次维护检查，并填写维护记录每月进行一次维护检查，并填写维护记录 。每次使用完毕，立即清洁仪器，悬挂标识，并填写仪器使用记录。每次使用完毕，立即清洁仪器，悬挂标识，并填写仪器使用记录。取样结束后，先用毛刷刷去洁净工作区的杂物和浮尘取样结束后，先用毛刷刷去洁净工作区的杂物和浮尘、用细软

19、布擦拭工作台表面、用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁布擦干；要经常用纱布沾上酒精将紫外线杀污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁布擦干；要经常用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面擦干净菌灯表面擦干净, ,保持表面清洁保持表面清洁, ,否则会影响杀菌能力；设备内外表面应该光亮整洁，否则会影响杀菌能力；设备内外表面应该光亮整洁，没有污迹。没有污迹。 高压灭菌锅高压灭菌锅四、细胞破碎四、细胞破碎1、 超声波法n定义利用超频率声波（15-25kHz）在液体介质中传播所产生的剪切力而达到细胞破碎的过程n工作原理：空穴现象n特点：o适用对象一般o仅实验室中应用o细胞完全破碎1)需冷却，噪音细

20、胞破碎方法细胞破碎方法机械破碎法机械破碎法p超声波振荡器以可分超声波振荡器以可分为槽式和为槽式和探头直接插入探头直接插入介质介质两种型式，一般破两种型式，一般破碎效果后者比前者好。碎效果后者比前者好。超声波破碎的机理超声波破碎的机理细胞破碎v一般认为在超声波作用下液体发生空穴化作用一般认为在超声波作用下液体发生空穴化作用（ cavitation)cavitation)v空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。力，使细胞破碎。v超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。

21、的声频、声能有关。空穴效应空穴效应o 当超声波作用于液体时，会使液体当超声波作用于液体时，会使液体内部压力发生变化，产生压力或拉力，当拉内部压力发生变化，产生压力或拉力，当拉力达到一定强度，可以使液体分子断裂，产力达到一定强度，可以使液体分子断裂，产生近于真空的空穴，引起空化效应（也称生近于真空的空穴，引起空化效应（也称空空穴效应穴效应）。）。电声超声波发生器电声超声波发生器超声波破碎仪 超声波破碎法应用注意事项超声波破碎法应用注意事项o超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。操作简单，液量损伤少。操作简单，液量损伤少。o

22、超声波破碎法的有效能量利用率极低，处理量少超声波破碎法的有效能量利用率极低，处理量少o操作过程产生大量的热，因此需在冰水或有外部冷却的容器中操作过程产生大量的热，因此需在冰水或有外部冷却的容器中进行。进行。o超声处理中产生的自由基使一些敏感物质变性失活。超声处理中产生的自由基使一些敏感物质变性失活。由于对冷却的要求相当苛刻，不易放大，主要用于实验室规模由于对冷却的要求相当苛刻，不易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。的细胞破碎。 方法方法技术技术原理原理效果效果成本成本举例举例机械法机械法匀浆法（片型）匀浆法（片型）细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌器劈碎适中适中适中适中动物组织及动动物组织及动物细胞

23、物细胞研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中便宜便宜超声波法超声波法用超声波的空穴作用超声波的空穴作用使细胞破碎用使细胞破碎适中适中昂贵昂贵细胞悬浮液小细胞悬浮液小规模处理规模处理匀浆法（孔型）匀浆法（孔型）须使细胞通过的小须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪孔，使细胞受到剪切力而破碎切力而破碎剧烈剧烈适中适中细胞悬浮液大细胞悬浮液大规模处理规模处理珠磨破碎法珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁珠捣碎珠捣碎剧烈剧烈便宜便宜细胞悬浮液和细胞悬浮液和植物细胞的大植物细胞的大规模处理规模处理细胞机械破碎法细胞机械破碎法1、 化学（渗透）法化学（渗透）法n定定 义义采用某些化学试剂改变

24、细胞壁和膜的通采用某些化学试剂改变细胞壁和膜的通透性，使内含物有选择性地释放出来的过程透性，使内含物有选择性地释放出来的过程 n原原 理：理：z酸碱酸碱z有机溶剂有机溶剂z表面活性剂表面活性剂1)1) 螯合剂螯合剂 细胞破碎方法细胞破碎方法非非机械破碎法机械破碎法（1）作用机理）作用机理o通过改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗通过改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来，这种处理方法称为渗透法。透出来，这种处理方法称为渗透法。（2）常用的化学试剂）常用的化学试剂v 有机溶剂（如苯，甲苯）、抗生素、表面活性有机溶剂（如苯，甲苯）、抗生素、表面活性（SDS、Triton X

25、-100)、金属螯合剂（、金属螯合剂（EDTA)、 变性剂（盐酸胍、脲）等。变性剂（盐酸胍、脲）等。化学渗透法的选择取决于化学试剂的类型、化学渗透法的选择取决于化学试剂的类型、细胞壁和膜的结构与类型细胞壁和膜的结构与类型不同的细胞采用不同的试剂处理不同的细胞采用不同的试剂处理化学渗透法化学渗透法细胞破碎酸碱酸碱v酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L 6mol/L HClHCl。v碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且较便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了而且较便宜。碱加入细胞悬

26、浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括使磷脂皂化。多种反应，包括使磷脂皂化。v碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。分从细胞内渗漏出来。有机溶剂有机溶剂o有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 o采用有机溶剂有机溶剂，例如丙酮、甲苯丙酮、甲苯等使细胞脱水细胞脱水。如将菌体悬浮液慢慢倒入10倍体积预冷至20的丙酮中搅拌丙酮中搅拌，丙酮除能脱水外，还能溶解除去膜上部分脂肪溶解除去膜上部分脂肪，增大细胞壁的通透性。oEDTA螯合剂：可用于处理螯合剂：可用于处理G-，该区域通透性增

27、加该区域通透性增加G-的外层膜结构的外层膜结构二价阳离子二价阳离子Ca 2+、Mg 2+与脂多与脂多糖和蛋白质的结合糖和蛋白质的结合EDTA大量脂多糖分子脱落大量脂多糖分子脱落外层膜出现洞穴外层膜出现洞穴内层膜的磷脂来填补内层膜的磷脂来填补Ca 2+、Mg 2+被螯合被螯合表面活性剂表面活性剂o天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等 o合成的表面活性剂合成的表面活性剂p离子型离子型如十二烷基硫酸钠（如十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；十六烷基三，阴离子型）；十六烷基三甲基溴化铵（阳离子型）甲基溴化铵（阳离子型）p非离子型非离子型如如Triton X-100和吐温（和

28、吐温（Tween）等）等 表面活性剂表面活性剂Triton X-100非离子型清洁剂非离子型清洁剂o 其作用部位主要是内膜的双磷脂层。其作用部位主要是内膜的双磷脂层。 o 对疏水性物质有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，对疏水性物质有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂， o Triton X-100常与其它试剂混合使用。常与其它试剂混合使用。o 变性剂：常用的是盐酸胍、脲。变性剂：常用的是盐酸胍、脲。n 一般认为胍能与水中氢键作用削弱溶质分子的疏水一般认为胍能与水中氢键作用削弱溶质分子的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液（盐酸胍能从作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液（盐酸胍能从大肠杆菌膜碎片中溶

29、解蛋白）。大肠杆菌膜碎片中溶解蛋白）。n 盐酸胍不仅能改变细胞通透性，而且能溶解不溶性盐酸胍不仅能改变细胞通透性，而且能溶解不溶性重组蛋白（包含体），并在其它试剂配合下，使其二重组蛋白（包含体），并在其它试剂配合下，使其二硫键断裂，变性解离为亚单位。除去变性剂和杂蛋白硫键断裂，变性解离为亚单位。除去变性剂和杂蛋白后，在一定条件下恢复肽链或肽链间的二硫键，再折后，在一定条件下恢复肽链或肽链间的二硫键，再折叠复性成有活性的蛋白质结构。叠复性成有活性的蛋白质结构。 目前实验室应用较多的是变性剂盐酸胍和脲处理目前实验室应用较多的是变性剂盐酸胍和脲处理E. coli基因工基因工程菌，渗透出重组蛋白质。程

30、菌，渗透出重组蛋白质。复合试剂复合试剂o根据不同试剂的作用机理，将介质试剂合理搭配使用，能有效根据不同试剂的作用机理，将介质试剂合理搭配使用，能有效的提高胞内物质的释放率。的提高胞内物质的释放率。如：如：单独用单独用0.1M的胍处理的胍处理E. coli，可释放可释放1的胞内蛋白，用的胞内蛋白，用0.5% Triton X-100可释放可释放4胞内蛋白，二者结合使用，胞内蛋白，二者结合使用，在同样时间内可使在同样时间内可使53的胞内蛋白释放。的胞内蛋白释放。一般认为胍溶解细胞外一般认为胍溶解细胞外膜，使内膜暴露于膜，使内膜暴露于Triton X-100中，双磷中，双磷脂层遭受损失，结果大脂层遭

31、受损失，结果大大改变细胞通透性。大改变细胞通透性。原理原理细胞细胞类型类型变性变性剂剂清洁清洁剂剂溶剂溶剂酶酶抗生抗生素素生物生物试剂试剂螯合螯合剂剂G-xxxxxxG+xxx酵母酵母xxxxxx植物植物细胞细胞xxxx巨嗜巨嗜细胞细胞xxxx不同细胞化学渗透的处理方法不同细胞化学渗透的处理方法 化学渗透法的优缺点（与机械法比较）化学渗透法的优缺点（与机械法比较）1)优点优点对产物释放有一定的选择性。对产物释放有一定的选择性。o化学试剂处理使一些分子量小的溶质（如肽和小分子的酶化学试剂处理使一些分子量小的溶质（如肽和小分子的酶蛋白）透过，而分子量大的物质（如核酸）则被阻滞在胞蛋白）透过，而分子

32、量大的物质（如核酸）则被阻滞在胞内内o控制条件可有选择的释出位于细胞不同部位的产物。控制条件可有选择的释出位于细胞不同部位的产物。细胞外形保持完整，碎片少，有利于后分离。细胞外形保持完整，碎片少，有利于后分离。核酸释出量少，浆液粘度低，便于进一步提取。核酸释出量少，浆液粘度低，便于进一步提取。2)缺点缺点时间长，效率低。时间长，效率低。o一般胞内物释放率不超过一般胞内物释放率不超过5050，处理试剂，处理试剂2h2h以上，往往还需要添加以上，往往还需要添加还原剂（如巯基乙醇）作保护，以防活性损伤太多。还原剂（如巯基乙醇）作保护，以防活性损伤太多。o通常为提高收率而采用较高的实际浓度，如一般用通

33、常为提高收率而采用较高的实际浓度，如一般用6M6M的盐酸胍或的盐酸胍或8M8M的脲来处理的脲来处理E.coliE.coli. .化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物，并影响最终产物纯度。如表面活性剂存在常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，纯度。如表面活性剂存在常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，因此必须注意除去。因此必须注意除去。通用性差，某种试剂只用于某些特定类型的细胞。通用性差，某种试剂只用于某些特定类型的细胞。o化学法化学法容易引起活性物质失活破坏容易引起活性物质失活破坏，因此应根据生化物质的稳定性，因此应根据生化物

34、质的稳定性来选择合适的化学试剂和操作条件。来选择合适的化学试剂和操作条件。2、 酶解法酶解法n定义利用酶促反应分解细胞壁上的键而达到细胞破碎的过程n原理z 外源性酶解溶菌酶、糖苷酶（-1,4、 1,6）、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、蛋白水解酶、-淀粉酶、纤维素酶、脂酶等1) 内源性酶解（自溶）温度、pH、时间、缓冲液浓度、激活剂等o溶菌酶溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子糖蛋白分子的一一l，4糖苷键糖苷键，使脂多糖解离使脂多糖解离，经溶菌酶溶菌酶处理处理后的细胞移至低渗溶液低渗溶液中使细使细胞破裂胞破裂。n溶菌酶适用于革兰氏阳性菌细溶菌酶适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解。对于革兰氏

35、阴性胞壁的分解。对于革兰氏阴性菌需辅以菌需辅以EDTA。n真核细胞的细胞壁需采用不同真核细胞的细胞壁需采用不同的酶。的酶。蜗牛酶适于酵母细胞的处理蜗牛酶适于酵母细胞的处理自溶作用自溶作用o通过调节温度、通过调节温度、pH或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自身的酶或添加有机溶剂，诱使细胞产生溶解自身的酶的方法也是一种酶溶法，称为自溶。的方法也是一种酶溶法，称为自溶。o自溶作用自溶作用是酶解的另一种方法o微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合结构能水解细胞壁上聚合结构的酶的酶，以便使生长过程进行下去生长过程进行下去。o改变微生物的环境改变微生物的环境，可以诱发诱发产生过剩的这种酶过剩

36、的这种酶或激发产生激发产生其它的自溶酶自溶酶，以达到自溶目的。o应用应用：用酶溶法剥离细胞壁，将原生质体进行融合，细胞工：用酶溶法剥离细胞壁，将原生质体进行融合，细胞工程常用的方法。程常用的方法。o酶溶法处理细胞存在的问题酶溶法处理细胞存在的问题：存在酶产物的抑制问题，使胞内物质释放率降低。存在酶产物的抑制问题，使胞内物质释放率降低。酶价高，限制了大规模应用。目前仅用于实验室规模。酶价高，限制了大规模应用。目前仅用于实验室规模。通用性差，不同的菌株用不同的酶。通用性差，不同的菌株用不同的酶。3、 渗透压法p 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法渗透压冲击是较温和的一种破碎方法p将细胞放在高渗透压的

37、介质高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。p渗透压冲击的方法渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶或者细胞壁预先用酶处理处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。 细胞破碎方法细胞破碎方法非非机械破碎法机械破碎法4、 冻融法o处理方法：处理方法：o 将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复进行多次此操作，使将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复进行多次此操作，使细胞受到破坏。细胞受到破坏。o特点：特点：o 融化法对于存在于细胞质内、靠近细胞膜的胞内产物释放较为融化法对于存在于细胞质内、靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效。有效。 溶质靠分子扩散释放出来，速度缓慢。因此，冻结溶质靠分子扩散释放出来，速度缓慢。因此，冻结融化法在融