HPLC法测定喉咽清口服液中齐墩果酸的含量7

1、HPLC法测定喉咽清口服液中齐墩果酸的含量喉咽清口服液是由土牛膝、马兰草、车前草、天名精四味中药提取制 成的中药口服液，为湖南时代阳光药业股份有限公司自主研制开发的国家 级新药，是全国独家产品，其中土牛膝为该制剂的君药，别名倒扣草，收 载于湖南省中药材标准 2009 年版，为觅科植物土牛膝 Achyranthes aspera Linnaeus 的干燥根及根茎，性平、微苦、凉，具清热解毒、利咽 化痰、抗菌消炎、镇静止痛之功效，临床常用于白喉、扁桃体炎、急慢性 咽喉炎、感冒发烧、麻疹肺炎、痈疽疖肿、蛇咬伤、类风湿关节炎等的治 疗 1-4 。据文献报道，喉炎清口服液联合利巴韦林气雾剂治疗儿童急性

2、咽炎效果显著 5 。土牛膝所含化学成分主要为三萜皂苷（苷元为齐墩果 酸，如齐墩果酸吡喃鼠李糖基吡喃半乳糖苷、齐墩果酸-28-0- B -D-吡喃葡萄糖苷）、生物碱（如甜菜碱）、昆虫变态激素（如 B -蜕皮甾酮）以及 多糖6 。制剂收载于中国药典 2010 年版一部，含量测定采用双波长 薄层色谱扫描的方法，测定土牛膝水解后得到的齐墩果酸的含量，该方法 专属性不好，操作复杂。本研究拟用 HPLC法测定齐墩果酸的含量，为该 制剂的质量控制提供参考。1 仪器与试药1.1 仪器岛津LC-10AT高效液相色谱仪，SPD-10AVP紫外可见检测器，岛津 Cs-930型双波长薄层扫描仪（日本岛津公司）；N20

3、00双通道色谱工作站 （浙江大学智能信息工程研究所）；定量毛细管（美国 Drunmand公司）； 电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；HH系列恒温水浴锅（江苏金坛中大 仪器厂）。1.2 对照品与试药齐墩果酸对照品（中国食品药品检定研究所，批号： 111733-201205 ， 供含量测定用） ；喉咽清口服液由企业提供（批号分别为 20120922、 20121005、20121015、 20121113 、 20130117、20130401、 20130412、 20130620、 20130660、 20130901）。1.3 试剂硅胶G （青岛海洋化工厂）；甲醇、乙腈为色谱纯；浓盐酸、硫

4、酸为分 析纯；乙醇为分析纯；水为超纯水。2 方法与结果2.1 供试品溶液的制备精密量取喉咽清口服液 25 mL至50 mL量瓶中，加无水乙醇至刻度， 摇匀，冰箱放置 3 h 后取出，放至室温，加乙醇至刻度，摇匀，滤过，精 密量取续滤液25 mL、盐酸3 mL,置锥形瓶中加热回流1 h，冷却，转移 至分液漏斗中，用石油醚（6090C）振摇提取6次，每次20 mL，合并 石油醚液，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，定量转移至10 mL量瓶中，冷却，加甲醇至刻度，摇匀，滤膜过滤，取续滤液即得 7 。2.2 对照品溶液的制备取齐墩果酸对照品9.86 mg，精密称定，置于10 mL的量瓶中，用甲 醇溶解并稀

5、释至刻度，摇匀，即得齐墩果酸对照品储备液，浓度为 0.986 mg/mL精密吸取上述对照品储备液适量， 用甲醇稀释成浓度为0.493 mg/mL的对照品溶液，即得2.3 阴性干扰试验取除土牛膝外的其他药材，按工艺方法制备，并按供试品溶液制备方 法制得阴性样品溶液。2.4 色谱条件与系统适应性 8-9色谱柱：Ultimate XB-C18 (4.6 mmx 250 mm 5 口 m);流动相：乙 腈-水(90 : 10);紫外检测波长：210 nm10;流速：1.0 mL/min;柱温： 30C；进样量：10卩L。按齐墩果酸峰计算，理论板数应不低于2000o此条件下待测组分与其他组分达到有效分离

6、;阴性无干扰。对照品、 喉咽清口服液供试品及阴性样品色谱图见图 1o2.5 线性关系的考察精密吸取齐墩果酸对照品储备液( 0.986 mg/mL) 1、2、4、6、8、10 u L,按照前述色谱条件分别进样测定，记录各进样量下的色谱峰面积， 以峰面积积分值Y对进样量X(u g)进行线性回归，得齐墩果酸的线性回 归方程为：Y=2.42 x 103X+5.31X 104, r = 0.9997 ，齐墩果酸在 0.986 9.860蛙 线性范围内与峰面积呈良好线性关系。2.6 精密度试验精密吸取同一供试品溶液(批号：20130620)，按照前述色谱条件，连续进样6次测定，记录各次峰面积。结果得齐墩果

7、酸峰面积的RSD为0.96%，表明本方法精密度良好。2.7 稳定性试验取同一批号样品(批号：20130620)，按照“ 2.1 ”项下操作制备供试品溶液，按照前述色谱条件，分别于0、2、4、8、10 h 精密吸取该供试品溶液10 uL进样测定，记录各次峰面积，计算得齐墩果酸峰面积的RSD为0.44%，表明供试品溶液在 10 h 内稳定。2.8 重复性试验取同一批号样品（批号： 20130620）6 份，按照“ 2.2 ”项下方法平行制备 6份供试品溶液，精密吸取各份溶液 10 uL， 注入液相色谱仪，按外标法计算齐墩果酸的含量。 6 份样品中齐墩果酸的 平均含量为0.242 mg/mL, RS

8、D为1.92%,表明方法的重复性良好。2.9 加样回收试验精密量取已知含量的同一批号（批号： 20130620）样品 6份，每份 10 mL醇沉准备酸水解时，再精密加入齐墩果酸对照品适量，按照“2.2 ”项下操作分别平行制备 6份供试品溶液。精密吸取各溶液10 u L,按照前述色谱条件分别进样测定，记录色谱峰面积，计算回收率，结果见表 1 。2.10 样品测定取 10 样品进行含量测定，按“ 2.1 ”项下操作，进样，计算齐墩果酸 的含量，结果见表 2。2.11 薄层扫描色谱法 112.11.1色谱条件 展幵剂为环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（20 : 5 : 8）;显色剂为10%硫酸乙醇溶液；扫

9、描波长 入S=520 nm，入R=700 nm2.11.2供试品溶液的制备 精密量取本品25 mL，用水饱和的正丁醇振摇提取6次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加乙醇30 mL、盐酸 3 mL 使溶解，加热回流提取 1 h ，提取液回收乙醇至无醇味，加水 30 mL，用石油醚（6090C）振摇提取6次，每次20 mL合并石油醚液， 置水浴上蒸干，残渣加无水乙醇微热使溶解，定量转移至5mL量瓶中， 冷却，加无水乙醇刻度，摇匀，作为供试品溶液。2.11.3 对照品溶液的制备 方法与“ 2.2 ”项下同。2.11.4 线性关系考察 精密吸取齐墩果酸对照品储备液（ 0.986 mg/mL 2

10、、4、6、8、10 L点于同一硅胶 G薄层板上，展幵，晾干，喷 以10%硫酸乙醇溶液，在105C加热至斑点显色清晰，晾干，在薄层板上 覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，按照上述色谱条件进行扫描， 测定峰面积积分值。以齐墩果酸含量X （卩g）为横坐标，以吸收度积分值Y为纵坐标，计算回归方程 Y=4572.1X-508.7，r = 0.9991 ，线性范围为:1.97 9.86 小 g。2.11.5样品测定 分别吸取各供试品溶液 3、6卩L、对照品溶液2、 4卩L,分别交叉点于同一硅胶 G薄层板上，展幵、扫描，测量供试品与 对照品吸收度积分值，测定，计算，即得。色谱图见图 2。2、 4、 6、

11、 8:供试品； 1、 3、 5、 7、 9:对照品3 讨论3.1 样品处理方法的选择原标准是采用正丁醇振摇提取口服液中的齐墩果烷类三萜皂苷成分， 操作繁琐，而且冬天气温低，样品溶液容易乳化难以分层，为操作带来不 便，本研究改为醇沉除去杂质保留有效成分，简化了操作。考察了试验过 程中硫酸、盐酸酸水解时间 12 ，结果盐酸水解 1 h 较完全。3.2 流动相的筛选本实验对甲醇 -水、甲醇 -0.1% 醋酸、乙腈 -水这三种流动相系统进行 了比较筛选，结果发现以甲醇 -水系统无论怎样调节两者比例均未得良好峰形的峰，而换用乙腈 - 水流动相即可得到满意的色谱峰形，齐墩果酸与 其他杂质峰的分离度也较高。

12、3.3 紫外测定波长的选择采用二极管阵列检测器在 190380 nm范围内分别扫描齐墩果酸峰的 紫外吸收，齐墩果酸在 204 nm 波长处有最大吸收，但由于甲醇的截止波 长为205 nm,选用此波长来检测时溶剂有吸收，对测定造成干扰，故选用 210 nm 作为测定波长，以保证测定结果的准确性。3.4 样品含量结果分析 采用高效液相色谱法和薄层扫描法两种方法，对企业提供的 10批喉 咽清口服液进行齐墩果酸含量测定，结果同一厂家不同批次间的含量差异 不明显，但是两种方法测定的结果差异很大。 中国药典（ 201 0年版）采 用双波长薄层色谱扫描的方法，测定口服液中土牛膝水解后得到的齐墩果 酸的含量，薄层扫描方法专属性不好，结果可受薄层板吸附剂的性能及薄 层质量、斑点分离情况、显色情况等多种因素的影响 13-15 ，测定结果 的重复性不是很好； 齐墩果酸在加入显色剂后， 要尽可能在半小时内测定， 以免误差