表达水稻矮缩病毒外壳蛋白P8基因的转基因水稻具有对该病毒中度的抗性

1、表达水稻矮缩病毒外壳蛋白P8基因的转基因水稻具有对该病毒中度的抗性 摘要：对表达水稻矮缩病毒外壳蛋白P8基因的转基因水稻进行了遗传研究，结果表明S8基因在转基因株系T0-2的T1及T2代中稳定遗传并表达。病毒抗性试验结果表明，T1及T2代转基因水稻对病毒表现出中度的抗性，这说明病毒抗性性状可以稳定遗传。这是关于水稻矮缩病毒的病原引起抗性的首次报道。关键词：水稻；水稻矮缩病毒；外壳蛋白基因；病毒抗性提取之前我们已经获得的转基因水稻植株水稻（Oryza sativa L.） 含S8因编码的水稻矮缩病毒（RDV）的外鞘蛋白通过粒子轰击。在这项研究中，证实了在S8基因已 稳定遗传和表达的自交T1和初级

2、T2后代 获转基因水稻植株行T0-2。抗病毒实验表明，T1和T2 转基因植株表现出抗RDV感染，说明传动平稳的电阻的特性。这项研究是关于病原体衍生的第一次报告 抗水稻矮缩病毒，phytoreovirus的一员。 介绍水稻矮缩病毒（ RDV ），这是病原体引起水稻矮缩病，确实埃韦勒损坏水稻生产在东南亚的区域。它是一个构件家庭属phytoreovirus的呼肠孤病毒和由两个叶蝉发送pecies ，黑尾叶蝉和Recilla dorssalis （ Boccardo和米尔恩，1984）。RDV基因组由12个双链RNA片段（ S1到S12）的。S1，S2 ，S3， S7和S8的编码结构蛋白，而S4，S6

3、 ， S9，S10 ， S11和S12编码非结构蛋白（ Xu等，1998; Zhang等， 1997） 。近日， Pns6被鉴定为一种病毒移动蛋白和Pns10作为RNA沉默抑制RDV的（ Li等人， 2004年，曹等人， 2005） 。 P2蛋白被确定为互动，体内与在赤霉素的酶（GA）的生物合成途径以及这一相互作用导致GA减退积累和对矮化表型表现出byRDV感染的水稻植物（ Zhu等，2005）。第八大段（ S8 ）编码外层外壳蛋白（铃木和菅原， 1991） 。 外壳蛋白介导的抗性（ CPMR ） ，一种策略是指病毒电阻通过在转基因植物病毒外壳蛋白的表达介导的，是一个来源于病原体的抵抗力（ ;

4、威尔逊，1993 Lomonnossoff ， 1995）的例子。由于CP的转基因烟草具有显著抵抗的第一次报告烟草花叶病毒的感染（鲍威尔- Abel等，1986）， CPMR已被广泛地应用于一个广阔植物品种和一些病毒成员表现出不同程度的成功的。大部分CPMR的例子都涉及病毒的单链RNA的基因组和双子叶植物物种（格鲁梅特，1995）。在水稻中，最重要的一个的情况下谷类植物为主要食物来源，为人类特别是对人的发展中国家，病毒外壳蛋白基因的抗病毒转基因植物制作了防治水稻条纹叶枯病， tenuivirus的成员（ Hayakwa等， 1992） 。 RDV外层外壳蛋白的转化被提及的报告Matsumura

5、等。没有进一步的分析（松村和田林， 1995） 。最近Sivamani等。 （ 1999）报道CP-介导的保护对水稻东格鲁球状病毒（ RTSV ）在转基因水稻植株。之前我们已经报道 水稻与S8的基因编码的大米的外壳蛋白转化矮缩病毒通过粒子轰击（ Zheng等， 1997） 。在这里，我们提出在S8中的转基因和抗RDV在T1的特性数据和T2代。材料和方法植物材料。转基因水稻植株行T0-2表达RDV S8的基因 通过粒子轰击（Zheng等，1997），并获得自交得到的种子。 T1和T2代的苗在随后的研究中使用。PCR分析和Southern杂交。总DNA进行从叶中提取 转化的和未转化的水稻植物的根据

6、默里组织和 汤普森（1980）。对于分离分析，聚合酶链反应是 以阐明S8序列中的T1和T2子代的存在 原代转基因水稻品系T0-2。用于PCR的引物和条件 人所描述的郑等人一样。 （1997）。对于南方的分析，基因组DNA用XhoI消化并用探针含有1.4kb的片段 S8编码区所描述的郑等人。 （1997）。在T1和T1的后代RDV外层外壳蛋白的Western blot分析。总 蛋白质被同时从转基因植物和非转化的植物中提取和 使用兔多克隆引发抗血清进行Western印迹 RDV，所描述的郑等人。 （1997）。病毒耐药检测。已被允许访问72小时叶蝉 到RDV感染的植物被用于接种。 1012天龄的稻

7、 苗接种单株3带毒成虫，并保持在 腾笼换24小时的访问期间。叶蝉，然后取出，将植物 转移到防虫笼和维护温室。外观 症状是经过12-28天拿下。结果在S8基因T1和T1后代的分离分在我们以前的研究中，转基因水稻植株T0-2表达RDV外层被毛 蛋白质获得与自交T1后代显示出1:1的分离比 在S8转基因（Zheng等，1997）。那么它的T1工厂，T1-1，一名被选为 产生T2后代，并进行了进一步的分析。从T1-1 T2幼苗总DNA，通过PCR使用引物分析 具体到RDV S8基因的编码区。 20人中，有30 T2苗木显示 阳性，说明具有3:1（2分离比协议 试验），尽管1:1的 率被发现在T1代（Z

8、heng等，1997）。T1和T2后代，这是积极的PCR分析，进一步进行 Southern分析来检测S8基因整合在T1和T2代。如 如图1所示，所有的T 1（图1A）和T2后代（图1B）显示出 同样的集成模式为T0，表明S8基因T1的稳定遗传和 T2。图。1。T1的（A）和T2（B）从转基因水稻品系后代基因组DNA凝胶印迹分析 T0-2。从初级转化T0-2（泳道T0）中分离基因组DNA，5种不同的T1 在后代（车道上1-4），T1转化T1-1（泳道T1-1），4种不同的T2后代（泳道1-4 B）和非转化的对照植物（NC）分别用XhoI消化和杂交用 RDV S8基因的1.4kb的片段。分子量标记

9、（以KB为单位）都在左侧。 在S8基因在T1和T2代的表达 由T1和T2植物的叶中提取总蛋白经受 西方墨点法使用抗血清提出对RDV。在S8编码的产品 在所有包含在S8的转基因（图2）的T1和T2子代进行检测。 连同46kDa带，S8的主要产物编码的蛋白，42kDa蛋白 带也被观察。该频带被确定为一个翻译后 该46kDa蛋白的裂解产物（Mao等人，1998）。图。 2。Western印迹法检测在T1（A）和T2（B）的后代RDV S8编码产物的 从转基因T0-2水稻品系。答：从初级提取的蛋白质（每通道为15g） 转化T0-2（泳道T0），T1子代（泳道1-4），未转化的对照植株（NC）和 从RD

10、V感染水稻（PC）。从T1 B.提取的蛋白质（每通道为15g）（泳道 T1-1），T 2子代（泳道1-4），未转化的对照植株（NC）和从RDV感染的水稻 厂（PC）。病毒抗性测定在T1和T2代由于RDV由叶蝉感染水稻植株只有通过传输，饲喂RDV感染的带毒植物叶蝉被用作载体RDV在接种病毒耐药检测。与空载体，转基因水稻相同的品种为S8的转基因植物，作为对照。 1012天旧的T1，T2和控制苗接种和症状进行评分12-28接种后几天。与对照植物中，T1和T2代转基因相比植物表现出延迟的和较不严重的症状，和植物的数量表示疾病症状也减少了。病毒耐药检测接种28天后的结果详列于表1 。这些数据表明，该百分

11、比植物示出在T1和T2转基因植物中的疾病症状的是低于对照植物和统计学的，这种差异是显著性（P <0.05）。这是表明，转基因植物表达RDV外层外壳蛋白表现出对RDV感染和抗性性状阻力适中水平已稳定地从T1到T2代传输。 表1中。病毒耐药检测在T1和T2转基因水稻植物呈现在接种植株总数疾病症状的数量。 A，B，C是不同的笼接种由带毒叶蝉。讨论我们在本研究中，产生抗病毒水稻品种的方法是 基于对病原体衍生的阻力的概念（PDR），其已被用于 许多报告通过对病毒衍生的表达来设计抗病毒 在转基因植物（Baulcombe，1996）的基因或基因组的片段。在这项研究中， 来源于病原体的抗性最早是在水稻矮

12、缩病毒，成员报道 phytoreovirus。与此同时，我们证明了外壳蛋白介导的抗 病毒感染是适用于phytoreovirus的双链RNA病毒。 病毒抗性试验的结果清楚地表明，有显著水平 保护转基因植物相比，与对照植物。尽管如此， 抗性程度的可变性存在。这是因为媒介昆虫 用于接种，并在这类型的挑战，病毒的剂量传送到 由叶蝉不同的植物是可变的。此外，不同的生理 条件和CP在接种时的表达水平也可影响 病毒的抵抗力。这种变异是在病毒耐药检测也观察 到CP转基因水稻的水稻条纹病毒（RSV）（Hayakawa等人，1992），并在 阻力测定水稻东格鲁球状病毒CP基因植物（RTSV） （Sivamani等

13、人，1999），这两种病毒是通过昆虫媒介和昆虫载体上发射被用于具有挑战性。我们的研究结果表明，表达RDV CP基因在转基因水稻 植物赋予阻力下对水稻矮缩病中等水平 温室条件。和抗性性状已被稳定地传送到 下一代。这些转基因水稻抗性性状的田间表现 需要的植物的转基因水稻植物中的使用前要分析 今后的育种计划水稻矮缩病的控制。致谢。我们要感谢T.大村博士的慷慨抗血清的礼物 对RDV P8。这项工作是由教育部（20020001038），以YL支持， 中国自然科学基金项目（39870027），国家重点基础研究（973合同编号 62000016204），中国 - 加拿大生物技术和欧洲联盟（合同编号ERB C

14、II*-CT94-0088）的3x3合作项目。参考文献Baucombe DC（1996）：病原体衍生于病毒的耐药机制 转基因植物。植物细胞8，1833年至1844年Boccardo G，米尔恩RG（1984）：植物呼肠孤病毒组。植物的CM/ AAB说明 病毒，294号XS，周平，张猛，朱顺丰，钟XH，萧Q，丁乙，李瑛（2005年）： 从植物双链鉴定的RNA沉默抑制的 RNA病毒。病毒学杂志。 79，13018-13027格鲁梅特R（1995）：作物抗病毒基因工程。 HortScience30， 早川，朱Y，伊藤K，木村Y，木村Y，伊泽T，岛本须K，鸟山明S （1992）：基因工程水稻抗水稻条纹叶枯病，一个 昆虫传播的病毒。 PROC。 NATL。 ACAD。科学。美国89，9865-98