花粉培养方法

1、植物花粉培养植物花粉培养花粉培养花粉培养 花粉培养花粉培养(pollen culture):也叫小孢子培养也叫小孢子培养(microspore culture),是从花药中分离出花粉粒是从花药中分离出花粉粒,使之使之成为分散的或游离的状态成为分散的或游离的状态,通过培养使花粉粒脱分通过培养使花粉粒脱分化化,进而发育成完整植株的过程进而发育成完整植株的过程.始于始于1953年。年。 特点：特点：1、可排除花药培养中花丝、药壁等体细胞的干扰；、可排除花药培养中花丝、药壁等体细胞的干扰；2、一个花药中花粉数目巨大，可减少试验用材料；、一个花药中花粉数目巨大，可减少试验用材料；3、花粉除数量多，还具有

2、单细胞、单倍性和较高同、花粉除数量多，还具有单细胞、单倍性和较高同步性特点。步性特点。花粉培养花粉培养选幼年树花蕾选幼年树花蕾取下花蕾（镜检）取下花蕾（镜检）预培养数天预培养数天取花药取花药接种接种分离分离花粉花粉 通过药壁吸收、贮存和转通过药壁吸收、贮存和转 化培养基中的外源物质化培养基中的外源物质 药壁向花粉提供营养物质；药壁向花粉提供营养物质； 低温预处低温预处理理消毒消毒过滤离心过滤离心再生再生培养材料的选取与制备培养材料的选取与制备（一）材料选择（一）材料选择（二）预处理（二）预处理（三）外植体制备及接种（三）外植体制备及接种（一）材料选择（一）材料选择1. 花粉发育时期的选择花粉发

3、育时期的选择 并不是任何发育时期的花粉都可直接诱导产生愈并不是任何发育时期的花粉都可直接诱导产生愈伤组织或胚状体，选择发育到特定时期花粉的材料进伤组织或胚状体，选择发育到特定时期花粉的材料进行培养是成功的关键。行培养是成功的关键。2.确定取材时间确定取材时间 选择大致处于所需要花粉发育时期的花蕾。由于选择大致处于所需要花粉发育时期的花蕾。由于花粉发育时期和植株的某些外部形态特征之间的大致花粉发育时期和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此利用这些外部标志，选择符合条件的花相关性，因此利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。2.

4、 生理状态的选择生理状态的选择 花药和花粉供体植株的生理状态，对花药和花粉供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导率也有直接影响。比花粉愈伤组织的诱导率也有直接影响。比如大田栽培还是温室栽培植株的花药；是如大田栽培还是温室栽培植株的花药；是主茎穗还是分蘖穗的花药。水稻、小麦、主茎穗还是分蘖穗的花药。水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比分蘖穗花药大麦等禾本科植物，主茎穗比分蘖穗花药愈伤组织的诱导率明显地提高。愈伤组织的诱导率明显地提高。 选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝的选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝的花蕾发育良好，数量大，发育同步。花蕾发育良好，数量大，发育同步。 操作过程

5、中不应使花药受到损伤，若受损伤，则操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈伤组织。伤组织。低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率 以以1-51-5预低温处理小麦小穗，能提高花粉愈伤组织预低温处理小麦小穗，能提高花粉愈伤组织的产量。例：在的产量。例：在44下冷冻石刁柏花蕾，预处理下冷冻石刁柏花蕾，预处理4 4天、天、8 8天天和和1212天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高2.42.4倍、倍、1.91.9和和1.51.5倍。倍。各种植物要

6、求预处理的温度和时间不同。各种植物要求预处理的温度和时间不同。（二）预处理（二）预处理（三）外植体制备及接种（三）外植体制备及接种 花粉培养中的表面灭菌通常先用花粉培养中的表面灭菌通常先用7070乙醇乙醇浸润花蕾浸润花蕾30S30S左右，然后在饱和漂白粉溶液左右，然后在饱和漂白粉溶液（上清液）中浸泡（上清液）中浸泡101020min 20min ，或在，或在0.10.1氯化汞溶液中处理氯化汞溶液中处理5 51010分钟，之后用无菌分钟，之后用无菌水漂洗水漂洗3 35 5次。次。花粉粒的游离花粉粒的游离分离花粉粒，应达到以下标准分离花粉粒，应达到以下标准a：成活率较高，发育齐整：成活率较高，发育

7、齐整 b：达到一定的数量：达到一定的数量 c：无菌，无杂质：无菌，无杂质常用的分离方法有：常用的分离方法有：A是自然散粉法是自然散粉法a 固体培养固体培养把花药从未开的花中在无菌条件下，直接插接在无菌培养基上，当花把花药从未开的花中在无菌条件下，直接插接在无菌培养基上，当花药自动裂开时，花粉散落在培养基上，移走花药，使花粉继续培养生药自动裂开时，花粉散落在培养基上，移走花药，使花粉继续培养生长。长。 b、液体培养、液体培养这一方法可以和预培养结合进行，一般是将消毒后的花药接种在液体这一方法可以和预培养结合进行，一般是将消毒后的花药接种在液体培养基中，在一定的温度条件下进行振荡培养，让花粉从花药

8、中自行培养基中，在一定的温度条件下进行振荡培养，让花粉从花药中自行散落到培养基中，过筛再除去花药壁等，离心收集花粉将其重新培养散落到培养基中，过筛再除去花药壁等，离心收集花粉将其重新培养在新鲜培养基上。在新鲜培养基上。 B、机械分离花粉粒、机械分离花粉粒 a：挤压法。：挤压法。 此方法是将花药消毒后，加入少量的分离溶液，用镊子或小玻璃棒将此方法是将花药消毒后，加入少量的分离溶液，用镊子或小玻璃棒将花粉从花药中挤压出来，通过不锈钢网或尼龙网筛去组织碎片，收集花粉从花药中挤压出来，通过不锈钢网或尼龙网筛去组织碎片，收集悬浮液，然后用悬浮液，然后用30蔗糖离心收取悬浮在蔗糖溶液上层的完整花粉粒，蔗糖

9、离心收取悬浮在蔗糖溶液上层的完整花粉粒，再用培养基洗涤几次后用于培养。再用培养基洗涤几次后用于培养。 注意注意 （a）挤压时用力要适当而且均匀（）挤压时用力要适当而且均匀（b）选用合适的筛网孔径）选用合适的筛网孔径（c）分离液的渗透压要合适）分离液的渗透压要合适b、搅拌器或超速旋切机法 将小花放在含有一定培养液的微量搅拌器中，在高速条件下搅拌一将小花放在含有一定培养液的微量搅拌器中，在高速条件下搅拌一定时间，匀浆用筛网过滤，滤液在定时间，匀浆用筛网过滤，滤液在1000g离心，用培养液洗涤数次，离心，用培养液洗涤数次，用用percoll（包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒）（包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒）

10、 密度梯度离心收集花粉密度梯度离心收集花粉微室培养微室培养平培养：花粉在固体培养基中进行培养，使其形平培养：花粉在固体培养基中进行培养，使其形 1.1.成花粉胚状体，最终分化为植株。成花粉胚状体，最终分化为植株。2.2.液体培养液体培养: : 悬浮培养，通气性差。悬浮培养，通气性差。3.3.双层培养：上双层培养：上- -液体液体+ +下下- -固体固体4.4.看护培养：花粉看护培养：花粉- -滤纸滤纸- -固体培养基固体培养基5.5.微室培养：微室培养：6.6.条件培养：在花药培养基中加入失活的花药提取物。条件培养：在花药培养基中加入失活的花药提取物。花粉培养的方式：花粉培养的方式：基本培养基

11、基本培养基植物种类不同对培养基的要求不同。如：植物种类不同对培养基的要求不同。如：培养基中高浓度的培养基中高浓度的NHNH4 4+ +显著抑制花粉愈伤组织形成。显著抑制花粉愈伤组织形成。铁对花粉胚发育很重要。铁对花粉胚发育很重要。培养基培养基分化培养：根据培养目的，调节植物激素分化培养：根据培养目的，调节植物激素分化培养：降低生长素分化培养：降低生长素, ,提高提高细胞分裂素细胞分裂素-有利于芽的形成有利于芽的形成壮苗培养：同时下降，有利于胚状体的正常生长。壮苗培养：同时下降，有利于胚状体的正常生长。植物激素的种类和浓度植物激素的种类和浓度必须结合植物种类和器官发生方式来考虑必须结合植物种类和

12、器官发生方式来考虑细胞分裂素和细胞分裂素和CMCM促进花粉分化成胚状体，生长素类尤其促进花粉分化成胚状体，生长素类尤其是是2,4-D2,4-D促进愈伤组织形成，但促进愈伤组织形成，但2,4-D2,4-D抑制愈伤组织分化抑制愈伤组织分化成胚状体。成胚状体。花药离体培养中维持培养基渗透压主要依赖于糖，启动小花药离体培养中维持培养基渗透压主要依赖于糖，启动小孢子细胞脱分化对糖的要求，单子叶植物比双子叶植物高。孢子细胞脱分化对糖的要求，单子叶植物比双子叶植物高。 石刁柏花药培养中，对多细胞花粉粒的诱导效果石刁柏花药培养中，对多细胞花粉粒的诱导效果3w8w蔗糖种类和浓度的筛选蔗糖种类和浓度的筛选添加物添

13、加物 玉米汁、马铃薯汁、酵母提取液、氨基酸玉米汁、马铃薯汁、酵母提取液、氨基酸等对提高花粉愈伤组织和胚状体诱导率、促进等对提高花粉愈伤组织和胚状体诱导率、促进其生长有良好效果。其生长有良好效果。 活性炭能促进胚状体发育，提高花粉植株产活性炭能促进胚状体发育，提高花粉植株产量。主要是吸附培养基中抑制生长的有害物质。量。主要是吸附培养基中抑制生长的有害物质。 1) 1) 花药培养形成单倍体植株。但花药中花药培养形成单倍体植株。但花药中的药壁、药隔等为二倍体组织也可能被诱的药壁、药隔等为二倍体组织也可能被诱导发育成植株。导发育成植株。 2 2）经染色体组型分析，花药培养中发现）经染色体组型分析，花药

14、培养中发现有非单倍体植株的存在。有非单倍体植株的存在。 3 3）激素对倍性变化有很大影响。）激素对倍性变化有很大影响。花粉植株的倍性花粉植株的倍性诱导单倍体植株的倍性诱导单倍体植株的倍性 通过胚状体产生的花粉植株，几乎都是单倍体。而经通过胚状体产生的花粉植株，几乎都是单倍体。而经过愈伤组织产的花粉植株中不少是二倍体。愈伤组织过愈伤组织产的花粉植株中不少是二倍体。愈伤组织继代培养时间愈长，二倍体的比例愈高。继代培养时间愈长，二倍体的比例愈高。单倍体的鉴定方法单倍体的鉴定方法 鉴定花粉植株染色体倍性的方法有：鉴定花粉植株染色体倍性的方法有：1. 形态鉴定形态鉴定2. 结实性鉴定结实性鉴定3. 染色

15、体数目鉴定染色体数目鉴定4. 遗传标记鉴定。遗传标记鉴定。 花粉植株的形态发生方式花粉植株的形态发生方式A、器官发生方式、器官发生方式 花粉花粉-多细胞花粉粒多细胞花粉粒-细胞团（愈伤组织）细胞团（愈伤组织）-继代培养继代培养- -单倍体植株。单倍体植株。 花粉粒经均等分裂或不均等分裂，形成多细胞花粉粒，突破花花粉粒经均等分裂或不均等分裂，形成多细胞花粉粒，突破花粉壁形成不规则，松散的细胞团，即花粉愈伤组织。愈伤组织继续粉壁形成不规则，松散的细胞团，即花粉愈伤组织。愈伤组织继续培养，再生成单倍体植株。如甘蓝、水稻等。培养，再生成单倍体植株。如甘蓝、水稻等。B、类胚体发生方式、类胚体发生方式 花

16、粉花粉-多细胞花粉粒多细胞花粉粒-进一步培养进一步培养-胚胚状状体体-释放释放-植物体。植物体。 花粉粒经均等分裂或不均等分裂，形成多细胞花粉粒，经进一花粉粒经均等分裂或不均等分裂，形成多细胞花粉粒，经进一步培养以胚状体形式释放出来，最后形成植物体。如曼佗罗、烟草步培养以胚状体形式释放出来，最后形成植物体。如曼佗罗、烟草等。等。花粉植株再生花粉植株再生 1. 在离体培养条件下，小孢子发生脱分化，在离体培养条件下，小孢子发生脱分化，改变原来的发育途径，通过器官发生型和改变原来的发育途径，通过器官发生型和胚状体发生型再生成完整植株。胚状体发生型再生成完整植株。 2. 离体小孢子发育途径（离体小孢子

17、发育途径（A、B、C)A途径：花粉孢子体第一次有丝分裂，起源于花粉的营养细胞途径：花粉孢子体第一次有丝分裂，起源于花粉的营养细胞(营养核营养核)、即发生、即发生在已经经过第一次配子体有丝分裂的花粉中，分裂是非均等的。花粉孢子体第在已经经过第一次配子体有丝分裂的花粉中，分裂是非均等的。花粉孢子体第一次有丝分裂后的衍生细胞，再经过几次有丝分裂，形成多细胞花粉粒，进一一次有丝分裂后的衍生细胞，再经过几次有丝分裂，形成多细胞花粉粒，进一步发育成多细胞团，撑破花粉壁，形成胚状体。步发育成多细胞团，撑破花粉壁，形成胚状体。小孢子细胞途径小孢子细胞途径A A发育示意图发育示意图小孢子细胞途径小孢子细胞途径B B发育示意图发育示意图B途径：花粉孢子体第一次有丝分裂，发生在单核小孢子中，即发生在雄配于体第一次途径：花粉孢子体第一次有丝分裂，发生在单核小孢子中，即发生在雄配于体第一次有丝分裂之前，分裂是均等的并接着发生细胞壁将小孢子分隔成两个大致相等的营养型有丝分裂之前，分裂是均等的并接着发生细胞壁将小孢子分隔成两个大致相等的营养型细胞。这两个细胞再经过几次分裂后，形成多细胞花粉，撑破花粉壁以胚状体或愈伤组细胞。这两个细胞再经过几次分裂后，形成多细胞花粉，撑破花粉壁以胚状体或愈伤组织形式释放出来。花粉孢子体第一次分裂后的细胞分裂又有三种情况。织形式释放出来。花粉孢子体第一次分裂后的细胞分