凝胶电泳及Westernblot检测技术ppt课件

1、 SDS-PAGE凝胶电泳及凝胶电泳及Western blot 检测技术检测技术SDS-PAGE凝凝胶电胶电泳泳实验原理实验原理实验步骤实验步骤本卷须知本卷须知电印迹电印迹SDS-PAGESDS-PAGE的优点的优点SDS-PAGESDS-PAGE的缺陷的缺陷实验常见问题及处置实验常见问题及处置小技巧小技巧实验原理实验原理l背景背景l根本原理根本原理l分类分类l分别范围分别范围l实验中各成分作用实验中各成分作用背景背景l1967年由Shapiro建立。l1969年由Weber和Osborn进一步完善。l 他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中参与离子去污剂SDS以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于

2、亚基分子量的大小,电荷要素可以忽视.丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)过硫酸胺过硫酸胺(AP)(AP)激活作用激活作用激活作用激活作用共聚合共聚合根本原理之一根本原理之一l阴离子去污剂阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共之间及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白量变性而改动其原有价键，使蛋白量变性而改动其原有的构象，并同蛋白质分子充分结合的构象，并同蛋白质分子充分结合构成带负电荷的蛋白质构成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。复合物。l强复原剂巯基乙醇如今常用二巯强

3、复原剂巯基乙醇如今常用二巯基苏糖醇，基苏糖醇，DTT翻开蛋白质分子翻开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。内的二硫键使这种结合更加充分。根本原理之二根本原理之二l结合了结合了SDSSDS的蛋白质在水溶液中的外形类似于长椭的蛋白质在水溶液中的外形类似于长椭圆棒，不同的蛋白质圆棒，不同的蛋白质-SDS-SDS复合物其椭圆棒的短轴复合物其椭圆棒的短轴长度恒定，而长轴的长度那么与蛋白质分子量的长度恒定，而长轴的长度那么与蛋白质分子量的大小成正比。大小成正比。l这样的蛋白质这样的蛋白质-SDS-SDS复合物在电场作用下，其迁移复合物在电场作用下，其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及外形等要素的率便不

4、再受蛋白质原有的净电荷及外形等要素的影响，而主要取决于其分子量大小这一要素。根影响，而主要取决于其分子量大小这一要素。根据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。分开。分类分类 PAGE根据其有无浓缩效应，分为延续系统和不延续系统两大类. 延续系统电泳体系中,缓冲液pH值及凝胶浓度一样，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不延续系统不延续系统l不延续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不延续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因此其分别条带明晰度及分辨率均较前者佳。浓缩胶浓缩胶l浓缩胶的作

5、用是有堆积作用，凝胶浓度较小，浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。区带。l当样品液和浓缩胶选当样品液和浓缩胶选Tris/HClTris/HCl缓冲液，电级液缓冲液，电级液选选Tris/Tris/甘氨酸。电泳开场后，甘氨酸。电泳开场后，HClHCl解离成氯离解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一同向正极挪动，其中氯离质带负电荷，因此一同向正极挪动，其中氯离子最

6、快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。浓缩胶浓缩胶l电泳开场时氯离子泳动率最大，超越蛋白，因此在后面构成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因此产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速挪动，构成以稳定的界面，使蛋白聚集在挪动界面附近，浓缩成一中间层。l Gly- Pro- Cl-+分别胶分别胶l孔径较小孔径较小, ,经过选择适宜的凝胶浓度经过选择适宜的凝胶浓度, ,可以使样品很好的分别可以使样品很好的分别. .当样品当样品进入分别胶进入分别胶,pH,pH,凝胶孔径改动凝胶孔径改动, ,使慢离子的泳动率变大使慢离子的泳动率变大, ,超越蛋白超越蛋白, ,高高强

7、度电厂消逝强度电厂消逝. .因此蛋白在均一的因此蛋白在均一的pH,pH,和电场强度下经过分别胶和电场强度下经过分别胶. .假设假设蛋白质分子量不同蛋白质分子量不同, ,经过分别胶遭到的阻力不同，泳动率也不同经过分别胶遭到的阻力不同，泳动率也不同, ,因此因此可以根据蛋白的分子量不同而分开可以根据蛋白的分子量不同而分开. .l Pro1- Pro2 Gly- Cl-Pro1- Pro2 Gly- Cl-+ 积层胶分别胶 凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分别胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便构成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不延续性。在浓缩胶中 HCl几

8、乎全部解离为Cl-，但只需极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点普通在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极挪动。其有效泳动率依次为Cl-蛋白质H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO- 称为慢离子。浓缩效应浓缩效应电泳开场后，快离子在前，在它后面构成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速挪动。在快离子和慢离子之间构成一个稳定而不断向阳极挪动的界面。由于蛋白质的有效挪动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢

9、离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。 样品进入分别胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加快，很快超越蛋白质，高电压梯度随即消逝。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而构成一条条区带。分别胶内的电荷分别胶内的电荷效应效应 与与SDSSDS结合的蛋白质的构型也发生变化，结合的蛋白质的构型也发生变化，在水溶液中在水溶液中SDS-SDS-蛋白质复合物都具有类似蛋白质复合物都具有类似的外形，使得的外形，使得SDS-PAGESDS-PAGE电泳的泳动率不再电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与外形的影响。因此，受蛋

10、白质原有电荷与外形的影响。因此，各种各种SDS-SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。动率只反映了蛋白质分子量的不同。 但在SDS-PAGE电泳中，由于SDS这种阴离子外表活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超越了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别； 此外，由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位留意SDS结合蛋白质的前提条件是有复原剂DTT，就能更好结合，这是由于SDS破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。lSDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分别范围取决于用于灌胶的聚丙烯

11、酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺构成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所添加，并构成SDS蛋白质复合物必需经过的小孔。这些小孔的孔径随 “甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺 比率的添加而变小，比率接近 1：20 时孔径到达最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺为1：29 配制，实验阐明它能分别大小相差只需3% 的蛋白质。分别范围分别范围l凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用用5 515%15%的丙烯酰胺

12、所灌制凝胶的线性分别范围的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分别范围如下表：如下表：丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度% %线性分别范围线性分别范围kDkD1512431016687.536945.057212双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为 1：29电转移电转移 经过电泳分别后蛋白质在凝胶中难于进展进一步分析 如氨基酸序列分析、氨基酸组成分析等，需将它们转移至有一定韧性并且化学惰性的高分子支持物上,目前最常用的是PVDF(聚偏氟乙烯)一类膜，其中Perkin-Elmer公司提供的ProBlott膜具有吸附蛋白质才干强的特性，特别适宜于氨基酸组成分析和序列分析。 下面引见两种电印迹方法。水浴式

13、电印迹方法水浴式电印迹方法l采用采用Bio-Rad公司的公司的Mini-Protean III系列系列l1将转移膜剪成和凝胶一样大小。将转移膜剪成和凝胶一样大小。l2将将PVDF膜在膜在100%甲醇中均匀润湿约甲醇中均匀润湿约2-3秒，再在水中漂洗秒，再在水中漂洗2-3min，然后在转移缓冲，然后在转移缓冲液中平衡至少液中平衡至少15min。l3电泳终了后，将凝胶在转移缓冲液中平衡电泳终了后，将凝胶在转移缓冲液中平衡 5min。l4将凝胶置于也在缓冲液中浸泡过的将凝胶置于也在缓冲液中浸泡过的Whatman 3mm滤纸上，然后将滤纸上，然后将PVDF膜覆于膜覆于凝胶上，再盖上一张浸湿的滤纸防止在

14、每一凝胶上，再盖上一张浸湿的滤纸防止在每一层间留有气泡，最后将它们一同夹入转移盒层间留有气泡，最后将它们一同夹入转移盒中。中。l5根据需求转移的蛋白质的分子量设定恒定根据需求转移的蛋白质的分子量设定恒定任务电流及转移时间，普通分子量任务电流及转移时间，普通分子量20 KD的蛋的蛋白质从白质从0.5mm厚的凝胶上转移可设电压厚的凝胶上转移可设电压50V，时间约需时间约需10-30min，分子量大的蛋白质转移需，分子量大的蛋白质转移需求的时间相应添加，但是在实验中可以发现，求的时间相应添加，但是在实验中可以发现，蛋白质的分子量蛋白质的分子量100KD时，即使转移时，即使转移45-60min 膜上吸

15、附的蛋白质的量仍不理想。另外，膜上吸附的蛋白质的量仍不理想。另外，假设用假设用Tris-甘氨酸缓冲液，电压为甘氨酸缓冲液，电压为40V，需，需1-4 h。l6转移终了后将膜去下在超纯水中漂洗转移终了后将膜去下在超纯水中漂洗23次，每次次，每次5min，以洗去膜上沾有的在电泳和电印迹过程中运用，以洗去膜上沾有的在电泳和电印迹过程中运用的缓冲液。的缓冲液。l假设用做氨基酸分析：转移缓冲液首选假设用做氨基酸分析：转移缓冲液首选 CAPS，这是，这是由于由于CAPS对以后的氨基酸组成分析、蛋白质序列测定对以后的氨基酸组成分析、蛋白质序列测定影响小，另外影响小，另外CAPS在在pH 11时有很好的缓冲才

16、干，并时有很好的缓冲才干，并保证绝大多数蛋白质都带负电荷向正极挪动。保证绝大多数蛋白质都带负电荷向正极挪动。lWestern blot：通常用：通常用Tris-甘氨酸系统也可以进展电印甘氨酸系统也可以进展电印迹，但转移终了后需对膜漂洗更完全以去除能够沾附迹，但转移终了后需对膜漂洗更完全以去除能够沾附的缓冲液离子及其他杂质。的缓冲液离子及其他杂质。半干式转移半干式转移Semi-dry transfer 1、将膜和滤纸剪成和凝胶一样大小。 2、预备转移缓冲液。 阳极缓冲液阳极缓冲液：0.3M Tris,10%甲醇，甲醇， pH10.4;阳极缓冲液阳极缓冲液：25mM Tris,10%甲醇，甲醇，p

17、H10.4;阴极缓冲液：阴极缓冲液：25mM Tris, 40mM 6-氨基己酸，氨基己酸，10%甲醇，甲醇，pH9.4(也可以用也可以用40mM甘氨酸替代甘氨酸替代)。水浴式转移用的水浴式转移用的CAPS缓冲液：也可用于半干式转移，但缓冲液：也可用于半干式转移，但转移效率不及上述系统，尤其当蛋白含量甚少时，希望转移效率不及上述系统，尤其当蛋白含量甚少时，希望蛋白质尽量多地转移至膜上以便下一步分析。蛋白质尽量多地转移至膜上以便下一步分析。我们实验室：我们实验室：25mM Tris 192mM甘氨酸甘氨酸, 无无SDSl 3、将PVDF膜在100%甲醇中润湿2-3 s，再用超纯水漂洗2-3min

18、，然后在阳极缓冲液中平衡至少15min。l 4、电泳终了后将凝胶在阴极缓冲液中平衡5min。l5在转移槽的阳极板上按以下顺序放置：在阳在转移槽的阳极板上按以下顺序放置：在阳极缓冲液极缓冲液中浸过的中浸过的Whatman 3mm滤纸，滤纸，PVDF膜，凝胶，在阴缓冲液中浸过的膜，凝胶，在阴缓冲液中浸过的Whatman 3mm滤纸。滤纸。l6根据需转移蛋白质的特性设置适宜的电流及根据需转移蛋白质的特性设置适宜的电流及时间，普通原那么为时间，普通原那么为1.8mA/cm2, 1 h。由于半干。由于半干式转移不易散热，电印迹宜在式转移不易散热，电印迹宜在4环境中进展环境中进展冰柜或冰库中。冰柜或冰库中

19、。l7转移终了后，将膜在超纯水中漂洗转移终了后，将膜在超纯水中漂洗23次，次，每次每次5min，除去，除去Tris和甘氨酸。然后将膜置于和甘氨酸。然后将膜置于滤纸上将其自然晾干后，再在滤纸上将其自然晾干后，再在20%甲醇溶液略甲醇溶液略微润湿一下即可在白光如日光灯下看到灰微润湿一下即可在白光如日光灯下看到灰白色的蛋白质带印迹，因此可省去染色步骤，白色的蛋白质带印迹，因此可省去染色步骤，切下此印迹进一步分析。但是当电泳前样品中切下此印迹进一步分析。但是当电泳前样品中含有较多的杂蛋白及盐时，用此法不易分辨，含有较多的杂蛋白及盐时，用此法不易分辨，仍需染色。仍需染色。实验中各成分作用实验中各成分作用

20、l聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺lSDSl甘氨酸甘氨酸l上样缓冲液上样缓冲液l固定液固定液l染色剂染色剂l 被激活的单体和未被激活的单体反响开场了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地经过bis的作用进展交叉互联成为网状构造，最终多聚物聚合成凝胶状，而其孔径大小等特征由聚合条件及单体浓度决议。十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS)l SDS是阴离子型外表活性剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，再与PAGE技术结合，那么谱带差别更加明显、明晰，并可测定蛋白质分子量。l SDS带有大量负电荷，当其与蛋带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超越白质结合时，所带的负电荷大大超

21、越了蛋白质原有的负电荷，因此消除或了蛋白质原有的负电荷，因此消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差别，使蛋白质均带有一样密度的负差别，使蛋白质均带有一样密度的负电荷，因此可利用分子量的差别将各电荷，因此可利用分子量的差别将各种蛋白质分开。种蛋白质分开。 当蛋白质的分子量在15,000200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。 符合如下方程式：Lg MW =b m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数。 因此经过知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子

22、量。 样品和浓缩胶中的氯离子构成挪动界面的先导样品和浓缩胶中的氯离子构成挪动界面的先导边境边境, ,而甘氨酸分子那么组成尾随边境，在挪动界面而甘氨酸分子那么组成尾随边境，在挪动界面的两边境之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域的两边境之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, , 它推进样品中的蛋白质前移并在分别胶前沿积聚。它推进样品中的蛋白质前移并在分别胶前沿积聚。甘氨酸甘氨酸l 此处此处pH值较高，值较高， 有利于甘氨酸的离子化，有利于甘氨酸的离子化，所构成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随所构成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分别胶泳动。从挪动界面中解氯离子之后，沿分别胶泳动。

23、从挪动界面中解脱后，脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和蛋白质复合物成一电位和pH值均匀值均匀的区带泳动穿过分别胶，并被筛分而依各自的的区带泳动穿过分别胶，并被筛分而依各自的大小得到分别。大小得到分别。上样缓冲液上样缓冲液为什么要上样缓冲液？为什么要上样缓冲液？蛋白上样缓冲液蛋白上样缓冲液(SDS-PAGEloadingbuffer)是一种以溴酚蓝为染料，是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。蛋白电泳样品上样。本产品分为复原型和非复原型两种，复原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的本产品

24、分为复原型和非复原型两种，复原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键断裂，使经过二硫键衔接的各亚单位彼此分别，在电泳凝胶链内二硫键和链间二硫键断裂，使经过二硫键衔接的各亚单位彼此分别，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和运用时请务必注明，仔细区分。上显现多个蛋白条带，选购和运用时请务必注明，仔细区分。l本卷须知本卷须知l 分为复原型和非复原型两种，分为复原型和非复原型两种，复原型上样缓冲液中含一定量的复原型上样缓冲液中含一定量的DTT或巯基乙醇，有细微刺激性气或巯基乙醇，有细微刺激性气味，较易区分；味，较易区分；l 含巯基的试剂有一定的毒性，含巯基的试剂有一定的毒性，为了您的

25、平安和安康，请穿实验服为了您的平安和安康，请穿实验服并戴一次性手套操作。并戴一次性手套操作。运用阐明运用阐明 1. 1.按每按每4 l4 l蛋白样品参与蛋白样品参与1l1l蛋白上样缓冲液蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)(5X)。 2.2.100100或沸水浴加热或沸水浴加热3 35min5min，以充分变性蛋，以充分变性蛋白。白。 3.3.冷却到室温后离心数秒钟假设长时间离心冷却到室温后离心数秒钟假设长时间离心会导致甘油分层，需求重新混匀，混均后再离会导致甘油分层，需求重新混匀，混均后再离30 30 s s，取上清直接上样到，取上清

26、直接上样到SDS-PAGESDS-PAGE胶加样孔内即可。胶加样孔内即可。 4.4.通常电泳时染料到达胶的底端附近通常电泳时染料到达胶的底端附近0.5 0.5 1cm)1cm)即可停顿电泳。即可停顿电泳。 添加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，普通上样缓冲液中参与一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以添加样品的比重。 上样缓冲液中的甘油非常重要，起添加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中分散出来到电泳缓冲液中。 指示剂检测电泳的行进过程，普通参与泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。 单纯的固定液普通难以到达这些要求，因此在实单纯的固定液普通难以到达这些要求，因此在实验中运用两种混和的固定液。验中运用

27、两种混和的固定液。CarnoyCarnoy固定液甲醇固定液甲醇: :冰乙酸冰乙酸=3:l=3:l每次运用前需暂时配制，长时间放置影每次运用前需暂时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间响固定效果，固定时间15min15min至至24 h24 h，冰箱、室温均，冰箱、室温均可。可。 甲醇甲醇/冰醋酸固定液冰醋酸固定液甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差白，但对核蛋白固定效果较差( (亲亲和力小且易自溶和力小且易自溶) )。冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即构成冰

28、晶，所以又称为冰醋酸。构成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用常用0.30.30.50.5的浓度作为固定的浓度作为固定液。冰醋酸对资料有膨胀作用，液。冰醋酸对资料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。氯仿混合。 染色剂染色剂l 考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色l常用染色方法常用染色方法 银染法银染法l 金属离子染色法金属离子染色法5电泳操作 将聚合好的凝胶板安顿于电泳槽中，上样，选择适当的电压进展电泳。 垂直板垂直板电泳安装电泳安装加样加样样品迁样品迁移方向移方向程度式电泳安装程度式电泳安装电泳缓冲液电泳缓冲液凝胶凝胶 程度电泳安装程度电泳安装电泳过程中分子迁移

29、的规律，小分子走在前头，电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分别大小分别电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子夹在两块玻璃夹在两块玻璃板之间的凝胶板之间的凝胶 电泳电泳缓冲液缓冲液 电泳电泳缓冲液缓冲液 加在槽中的经加在槽中的经SDS处置的样品处置的样品分子量小分子量小分子量大分子量大电源电源染色和脱色染色和脱色 电泳终了需经过染色和脱色评定其结果的优劣，此外根据不同的研讨目的，也可将凝胶直接进展放射自显影及电印迹。电泳后的凝

30、胶经考马斯亮蓝染色、电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片脱色后的凝胶照片.结果处置结果处置 l1 1丈量并计算分子量如今曾经很少用到丈量并计算分子量如今曾经很少用到l蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经3737种蛋白的测定得到种蛋白的测定得到以下的关系式以下的关系式l Mw Mw K(10 K(10bm) (1)bm) (1)l lgMw = lgK lgMw = lgKbm = K1bm = K1bm (2)bm (2)l 其中其中MWMW是蛋白质分子量；是蛋白质分子量；K K和和K1K1为常数为常数l b b为斜率，为斜率，m

31、m是电泳迁移率，实践运用的是相对迁移率是电泳迁移率，实践运用的是相对迁移率mRmR。lmR=dpr/dBPB mR=dpr/dBPB l2 2灰度扫描和分析灰度扫描和分析规范蛋白分子量规范蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝胶浓度下，在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以经线性关系，所以可以经过规范曲线求未知多肽过规范曲线求未知多肽链分子量。链分子量。 相对迁移率相对迁移率实验本卷须知实验本卷须知 1. 构成凝胶的试剂要有足够的纯度：丙烯酰胺是构成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏将直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺能

32、够混有的影响凝胶构成的杂质有：丙烯酰胺、线性多聚丙烯酰胺、金属离子等。2. 留意不能随意倾倒单体溶液，应参与过量的催化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再弃置。l3. TEMED中混有氧化试剂后其本身中混有氧化试剂后其本身极易被氧化而失去催化才干，另外极易被氧化而失去催化才干，另外TEMED的氧化产物呈黄色，以此可的氧化产物呈黄色，以此可以鉴定以鉴定TEMED的质量。假设无法获的质量。假设无法获得无色透明的得无色透明的TEMED，只能适当添，只能适当添加用量以保证聚胶速度。加用量以保证聚胶速度。l4. 过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化才干，因于水

33、后很快降解失去催化才干，因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。保管固体过硫酸铵应密闭枯燥。性。保管固体过硫酸铵应密闭枯燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另外在配制凝胶溶液时过硫酸铵不易外在配制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量，否那么会使蛋白质在电泳过过量，否那么会使蛋白质在电泳过程中被氧化程中被氧化(主要指天然无变性剂凝主要指天然无变性剂凝胶胶)。l5. 激活剂的用量激活剂的用量: 激活剂的浓度适激活剂的浓度适当与否不仅可以决议凝胶聚合的速当与否不仅可以决议凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。添加过度，也将影响凝胶的质量。添加过硫酸铵或硫酸铵或

34、TEMED的用量，将使丙的用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱而失去应有的柔性。二者多得脆弱而失去应有的柔性。二者多至一定程度时，聚合链长度过短，至一定程度时，聚合链长度过短，将不会构成肉眼可见的凝胶，这些将不会构成肉眼可见的凝胶，这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合前高一些。较聚合前高一些。 6. 温度的影响聚胶的最正确温度为2325 ，需求留意灌胶前单体溶液(通常置于4冰箱)及玻璃板或管(有时从烘箱取出)也要平衡至此温度。由于溶液在抽真空时仍维持较低温度，需待其升至室温后再脱气，另外升温后脱去氧气的速度较低温时快。

35、 7. 氧气的影响氧气会与被激活的单体自在基作用氧气的影响氧气会与被激活的单体自在基作用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体溶抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体溶液脱气。假设省去这一步骤，凝胶仍能聚合但液脱气。假设省去这一步骤，凝胶仍能聚合但需更多的激活剂，并且不能保证很好的反复性，需更多的激活剂，并且不能保证很好的反复性，充分去除氧气可以用尽量少的激活剂得到最正充分去除氧气可以用尽量少的激活剂得到最正确聚合效果。通常在较好的真空度确聚合效果。通常在较好的真空度(125torr)脱脱气至少气至少15 min 。 8.凝胶添加剂：凝胶中经常参与凝胶添加剂：凝胶中经常参与SDS、尿素、尿素、

36、TritonX-100等添加剂。等添加剂。SDS参与后不会对参与后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿素会使凝胶孔径凝胶的聚合产生影响，但尿素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来分别小分子蛋白质或变小，这一特性可用来分别小分子蛋白质或多肽。多肽。 9. 聚胶时间：虽然运用过硫酸铵TEMED催化后灌胶1520 min即可察看到凝胶的构成，但至少需90 min才干保证95以上的单链聚合生长短以及具有适宜的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间需更长，但它普通用于等电聚焦即根据蛋白质的电荷性质进展分别，对孔径大小要求不高，因此不用等很长时间(完全聚合需8 h)。10. 单体的浓度：是指单体总分量(丙烯酰胺+bis)在

37、溶液中的百分比(wv)，可选择的范围为330，单体浓度添加后聚合速度将加快，因此可适当减少催化剂的用量。 11. SDS与蛋白质的结合按质量成比例即：1.4g SDS/g蛋白质，蛋白质含量不可以超标，否那么SDS结合量缺乏。l12. 用用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必需同时作定蛋白质相对分子量时，必需同时作规范曲线。不能利用这次的规范曲线规范曲线。不能利用这次的规范曲线作为下次用。并且作为下次用。并且SDS-PAGE测定分测定分子量有子量有10误差，不可完全信任。误差，不可完全信任。l13. 有的蛋白质如：电荷异常或构有的蛋白质如：电荷异常或构造异

38、常的蛋白质；带有较大辅基的蛋造异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质不能采用该法测相对分子量。白质不能采用该法测相对分子量。14. 有些蛋白质由亚基如血红蛋白有些蛋白质由亚基如血红蛋白或两条以上肽链或两条以上肽链-胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶组成的，它们在巯基乙醇和组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。或是单条肽链的相对分子量。 常见问题及处置方法常见问题及处置方法 纹理和拖尾景象 由于

39、样品溶解不佳引起的，抑制的方法可以在加样前离心，添加一些增溶辅助试剂如尿素。蛋白带过宽，与临近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量。电泳时间比正常要长电泳时间比正常要长能够由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的能够由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的pH选择错误。选择错误。 指示剂成浅笑符号指示剂前沿呈现向上的指示剂成浅笑符号指示剂前沿呈现向上的曲线形：阐明凝胶的不均匀冷却，中间部分曲线形：阐明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率。冷却不好，导致分子有不同的迁移率。5.凝胶时间不对凝胶时间不对 通常胶在通常胶在30min内凝聚假设凝聚得太慢，能内凝聚假设凝聚得太慢，能够

40、是够是TEMED，APS剂不够或者失效剂不够或者失效l6.出现出现“皱眉两边向下中间鼓起皱眉两边向下中间鼓起l主要出如今蛋白质垂直电泳槽中，普通是主要出如今蛋白质垂直电泳槽中，普通是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处置方两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处置方法：可在两板间参与适量缓冲液，以排除气泡。法：可在两板间参与适量缓冲液，以排除气泡。l7.7.出现出现“鬼带鬼带 如何处置？如何处置？l “ “鬼带就是在跑大分子构鬼带就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出如今象复杂的蛋白质分子时，常会出如今泳道顶端有时在浓缩胶中的一些泳道顶端有时在浓缩胶中的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，

41、大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于复原剂在加热的过程中被氧主要由于复原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目合，聚合成大分子，其分子量要比目的条带大，有时不能进入分别胶。但的条带大，有时不能进入分别胶。但它却于目的条带有一样的免疫学活性，它却于目的条带有一样的免疫学活性，在在WBWB反响中可见其能与目的条带对应反响中可见其能与目的条带对应的抗体作用。处置方法：在加热煮沸的抗体作用。处置方法：在加热煮沸后，再添加适量的后，再添加适量的DTTDTT或

42、或BetaBeta巯基乙醇，巯基乙醇，以补充缺乏的复原剂；或可加适量以补充缺乏的复原剂；或可加适量EDTAEDTA来阻止复原剂的氧化。来阻止复原剂的氧化。l 8.为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ l 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的景象。主要与缓冲液和分别胶的浓度有关。处置方法：改换正确pH值的Buffer；降低分别胶的浓度。SDS-PAGE的优点的优点l设备简单l快速l分辨率和灵敏度高 l特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和分子量的测定 SDS-PAGE的缺陷的缺陷 1. 有许多蛋白质是由亚基或两条以上肽链组成的如血红蛋白、胰凝乳蛋白酶等，他们在变性剂和强复原剂的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类的蛋白质，SDS-PAGE测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完好蛋白质的分子量。 SDS-PAGE的缺陷的缺陷l2. 还有一些电荷异常和构象特殊的蛋白质如组蛋白F1，含有较大辅基的糖蛋白和含有二硫键较多