DNA纳米技术从试管走向细胞的历程

1、DNA纳米技术从试管走向细胞的历程基于沃森-克里克碱基互补配对原则，随着合成成本的降低，DNA在构建自组装分子结构和动态分子装置上得到了广泛的应用。在无细胞环境中，DNA纳米技术的研究者对DNA复杂系统和定量反应机制的研究已经达到基因工程和细胞技术无法企及的程度。然而，DNA纳米技术最有趣的应用（最大地利用DNA系统尺寸小、生物相容性好以及可塑性强的性质）都停留在生物界面的程度。这篇综述里，我们回顾了DNA纳米技术研究从试管到细胞的历程。我们着重介绍了DNA成像探针、智能治疗及药物转运系统发展过程中的关键性突破，同时展望了细胞DNA纳米技术未来的挑战和机遇。 DNA纳米技术属于纯粹的分子生物工

2、程学技术。这一领域旨在将DNA作为工程学材料构建分子结构和装置。DNA碱基互补配对的自然特性使得控制DNA间的相互作用变得简单，同时可以合理地设计具有精确尺寸的DNA纳米结构、自主移动的分子马达和处理信息的DNA回路。目前还没有任何其它分子工程技术可以像DNA纳米技术这样完全从头设计复杂多样的类分子生物系统。DNA纳米技术的成功源于三个关键因素：1. 对DNA热动力学的认知使得我们可以精确预测单链DNA自身折叠及DNA分子间的相互作用（1，2）；2. DNA合成成本不断下降，质量不断提高（3）；3. 研究主要在无细胞环境中进行，DNA不会受到的DNA/RNA酶以及细胞内可能会出现的其它复杂因子

3、的干扰，故而可以朝着设计的预期发展。长期以来，DNA纳米技术的发展动力是构建智能治疗剂、药物转运系统、分子生物学工具以及其他可以与活细胞相互作用甚至能操控活细胞的装置（4-7）（Fig.1）。这些应用是核酸结构和装置的显著优势，特别是它们尺寸小、生物相容性好以及可控的通过杂交与细胞核酸作用的明确性质。然而，要实现DNA纳米技术的应用，必须解决从高度混合的反应缓冲液到空间结构化、内容复杂的细胞环境中，实验依然可以进行（Box 1）。在这篇综述里，我们总结了最近将DNA纳米技术应用至细胞的研究进程。我们着重于核酸纳米装置及结构的合理设计、化学修饰，然后转运至哺乳细胞的过程。首先，我们简单回顾了细胞

4、外DNA纳米技术的研究；然后，转向更多的类细胞环境的研究。在细胞裂解液或固定细胞等类细胞环境下，可以不完全的部分模拟复杂的细胞环境，获得相关数据。接下来，在介绍转运DNA装置至细胞内的相关工作前，我们讨论了最近一些证明DNA纳米装置可控的与细胞表面蛋白相互作用的研究成果。紧接着介绍了在活细胞内工作的装置，同时回顾了利用DNA探针和逻辑门检测、分析和调控细胞内RNA水平的早期工作。我们通过着重介绍在活细胞内增强DNA装置表现的RNA成像探针、siRNAs或者ASOs的设计原则来介绍这一部分工作。最后，我们介绍了与DNA纳米技术很大程度上有着相同目标但又用于遗传编码和转录RNA的RNA纳米技术和R

5、NA合成学。Figure 1| DNA纳米技术在生物界面上的应用 A，智能治疗剂可以将结构与分子逻辑结合，在特定的细胞或组织内实现靶标治疗（60）。B，DNA纳米结构可作为可设计的脚手架来附着药物、靶标链和脂双分子层等其他修饰（78）。C，一系列新奇的敏感特定的成像探针，基于DNA设计的与RNA序列特异性相互作用的信号放大器（52）。D，DNA折纸和其它结构可精确控制功能分子基团的空间结构，形成高效的细胞生物学定量检测工具（66）。无细胞DNA纳米技术为了在复杂潮湿的环境中可靠地实现功能，在活体用分子传感器检测环境变化；用分子马达和致动器适应环境；用计算控制回路将传感器信息转换为马达的运行；用

6、特定结构的元素来保护并组织这些部件。有趣的是，在无细胞环境下，DNA纳米技术在组织大部分模拟复杂生物现象的分子马达必须的大部分功能化组件上已经有了一定的进展。我们在这里回顾了一些无细胞DNA纳米技术的主要成果并指出了其在细胞环境中的潜在应用。结构DNA纳米技术在上世纪80年代，Nadrian Seeman提出了DNA可以作为结构工程学材料这一概念（8-10）。在1998年，Winfree等首次经实验实现了大尺寸结构的合成：他们证明纳米尺寸的DNA小块可以通过多条寡聚核苷酸链自组装形成微米级的周期性排列的DNA阵列（11）。随后，tile自组装和相关技术被成功的应用与构建一系列的阵列和网络DNA

7、结构（11-19）。Rothemund通过DNA折纸将结构DNA自组装进一步发展。DNA折纸术操作简单，结构具有足够的弹性来适应几乎所有的二维结构，而且能够稳定高效的形成目标结构（20）。DNA折纸通过长单链与大量短订书链杂交折叠成目的结构。这项技术被快速广泛地应用，而且广泛的用于自组装三维结构（21-24）。DNA纳米结构一开始是作为药物转运工具和相似的应用来研究，因为DNA折纸上精确分布的脚手链，可以连接药物和靶标等官能基团。另外，三维结构可以设计成需载运药物的保护结构。动态DNA纳米技术动态DNA纳米技术通过DNA酶催化或DNA链置换反应介导的链杂交实现的自组装构建具有可移动部件或时变行

8、为的装置。动态DNA纳米技术可追溯至多方面的起源，包括Adleman关于DNA计算及功能化核酸的进展和表征研究（25）。然而，真正开启这一领域的是Yurke及其合作者，他们证明功能化分子马达可被合理地设计，并且仅通过杂交和链置换反应实现周期性工作（26）。随后，Winfree和Pierce课题组证明多重链置换反应可以组合在一起构建复杂的级联反应（27，28）。由于DNA链置换级联反应原理简单，自从被应用以来已经被广泛和有效地应用于分子工程，成为大量动态DNA装置的工作原理。动态DNA纳米技术在分子马达中的应用（29，30）包括：沿轨道自主移动的步行马达（31-34）；分析复杂混合分子体系中信息

9、的分子回路（27，35-39）；可以检测和放大信号的催化放大器（40-44）。很多这种系统有明显的潜在生物学应用，比如：Shapiro及其合作者利用DNA和限制酶构建通体外过检测和分析一类基因调控类似产物的分子标签来诊断疾病阶段（6，45）。相反的，分子装置和结构在活细胞上和活细胞内分析和检测分子信息这一应用领域超越相应的电力学方法。Box 1|细胞内的人工核酸研究人员在研究ASO、siRNA、分子信标以及相关技术的过程中发展了不同的技术、设计原则及限制因素，帮助我们认识核酸纳米结构进入细胞所需克服的困难。转运在试管中，各种组分的浓度可以精确控制，实时监测反应动力学数据。核酸装置要在细胞内发挥

10、功能，首先必须穿过细胞膜。不同的核酸转运方法会导致截然不同的细胞摄取速率、摄取量、细胞器内的分布甚至细胞状态。例如通常用于转染的脂类试剂能够有效的转运大量的探针进入细胞，但是一大部分都被包裹在溶酶体内，并不能进入细胞质（132，133）。相反，显微注射可以将核酸直接递送至细胞质或细胞核，但仅限于相关的少数细胞。我们参考了Bao等（134）更深入地比较转运合成核酸至细胞的不同方法及Davis等关于纳米颗粒药物载运的综述（85）。稳定性与化学修饰未作化学修饰的短链核酸在细胞内的半衰期很短（135）。然而，大量针对核酸五碳糖、碱基和骨架的化学修饰已被证明能够有效的增强其稳定性。最常用的修饰有核苷内连

11、接处的磷酸化修饰和核糖的2甲氧基修饰（136）。因为化学修饰能有效保护核酸抵抗核酸酶的降解，一些化学修饰（比如磷酸化键合（137）可能会影响细胞活性（138）。因此，在选择核酸装置修饰时，必须平衡装置稳定性与细胞活性。分子聚集与细胞区域化细胞内密布着蛋白和其它生物大分子，会干扰多级多输入逻辑回路和其它具有很多相互作用组分系统的运行。随着分子尺寸的变化，合成DNA在细胞质内的扩散率为水溶液中1-20%（139）。在细胞环境和缓冲液中，单链互补核酸的杂交速度也不一样（140）。另外，哺乳动物细胞由多种不同的单元组合形成，这些单元间的分隔会阻碍回路中的不同组分在细胞内相遇。免疫活性进入细胞的外源核酸

12、会通过激活TLR受体引发自发免疫应答。TLR3识别双链RNA，TLR7和TLR8识别单链RNA，TLR9识别DNA中的非甲基化CpG。哺乳细胞基因组中的CpG是完全甲基化的，而细菌的没有，TLR9的任务就是检测细胞内的细菌源的非甲基化CpG（79）。蛋白激酶R结合的长于30bp的双链RNA会激活细胞免疫应答，导致细胞死亡（141）。TLR9（142）或PKR（143）激活介导的免疫应答被认为是具有治疗意义的，所以这两种通路的免疫刺激可能是大家喜闻乐见的。然而，避免这些免疫刺激更为普遍。细胞裂解液和固定细胞内的DNA纳米技术细胞环境与无细胞环境截然不同（Box 1）：DNA酶和RNA酶等核酸结合

13、蛋白的存在可能会影响装置的功能。另外，细胞内高度结构化，限制了外源核酸的自由扩散。细胞裂解液、血清和固定细胞提供模拟活细胞某些性质的反应环境，同时有保证了DNA装置的检测和观察处于一个相对可控的环境中。DNA纳米结构在细胞裂解液和血清中的稳定性裂解液是细胞内容物的均匀混合物。即使DNA纳米结构在裂解液中遇到的细胞组分与细胞内的浓度与活性不同，核酸装置可以很容易进入这种模拟细胞内环境的没有细胞壁的环境中。Yan Hao, Meldrum和合作者发现DNA折纸细胞裂解液中孵育12小时后可以重新提取并表征（46），而长单链和双链孵育后无法重新获得。由于折纸与裂解液混合液的详细条件并没有公布，很难判断

14、该反应条件与生理环境的相似度。另外，DNA折纸实在高Mg2+浓度（10 Mm）的溶液中折叠的，向裂解液中加入大量的结构会提高反应液的Mg2+浓度，使得结构看上去很稳定，但是在细胞内就很难预测了。即使这样，这些效应都是可以控制的，细胞裂解液仍然是探索纳米装置在生理环境表现的有效方法。将纳米结构送入细胞和动物要求结构在血清和含血清的培养基中能保持结构稳定。血清跟裂解液一样含有核酸酶，缺乏维持结构所需的镁等盐离子。Conway等发现具有三棱柱结构的三链小结构血清内稳定性比无结构混合链好（47）。电泳分析显示无结构链在10%胚牛血清中的半衰期小于1小时，而具有完整结构的链半衰期接近两小时。对链进行化学

15、修饰后，结构的半衰期甚至大于24小时。Perrault和同事全面分析了三维折纸在含血清的哺乳动物细胞培养基内的稳定性，证明折纸结构稳定性的强弱取决于：折纸的设计、Mg2+浓度及核酸酶的活性（48）。通过电泳和TEM表征，他们发现折纸与细胞培养基孵育一天后，3次试验中有两次出现了部分折纸分解的现象，而向培养基中加入6mM Mg2+可以抑制分解。有趣的是具有三级结构的DNA折纸纳米管即使不在培养基中加盐也能保持结构稳定。向培养基中加入高于5%的胚牛血清，孵育24小时后3种结构皆被DNA酶部分降解。当加入能与核酸竞争性结合的肌动蛋白后核酸酶对结构的降解作用神奇地减弱了，并且这种修饰在细胞培养环境下也

16、有效。为了定量DNA酶对纳米结构降解的程度，Keum和Bermudez检测了DNA四面体在DNAase 1存在下的半衰期，发现DNA四面体比双链DNA稳定3倍（49）。DNA折纸也同样被证明在核酸酶的环境中比双链DNA稳定。Castro等将折纸与不同的核酸酶孵育24小时后，通过TEM和电泳评估折纸的降解程度（50）。在DNase 1和T7核酸内切酶环境中检测到了降解，然而在DNase 1中折纸的降解速度比DNA双链慢了几百倍。比较折纸与四面体的研究，证明DNA折纸比较小的四面体更稳定，可能是应为折纸中链之间的连接更紧密。上述的研究说明DNA纳米结构比简单的单双链核酸更能抵抗核酸酶的降解。而且一

17、些纳米结构在生理盐浓度下能够长时间保持结构的完整。以后的研究必需完全揭示结构的功能与稳定性的内在关系。固定细胞内的DNA纳米技术通透化处理的细胞和组织在某些方面依然能够模拟细胞环境：固定化细胞的很多结构组织依然保存完好，特别是区域化分布的mRNA和蛋白。固定化细胞为免疫或荧光原位杂交观测细胞内的mRNA和蛋白分布提供了一个可控的环境。基于DNA纳米结构的新方法很实用并且提高免疫或荧光原位杂交的灵敏度和特异性。例如基于HCR的分子探针已经在完整的脊椎动物胚胎中对5种靶标RNA实现了同时成像（51，52）。通过在靶标mRNA杂交一系列适配链，Choi等可控地催化两种带有荧光标记的发卡结构发生聚合反

18、应，反应产物与靶标mRNA结合，实现荧光信号放大，就可以很容易地通过荧光显微镜实现成像（Fig. 2a）。Raj和同事将链置换与单分子FISH (smFISH)相结合，通过检测个体内的mRNA可以获得单碱基突变信息（53）。进行单分子荧光原位杂交时，大量单独标记的DNA短链透过固定的细胞膜与靶标mRNA的不同区域结合（54）。对同一靶标mRNA上的探针进行共定位，可以得到普通荧光显微镜就能区分的不连续的荧光亮点。单碱基水平的区分是通过另外加入修饰荧光/淬灭剂的链置换探针实现的（53）。如果Toehold和靶标区域出现单碱基突变就会明显降低探针链通过Toehold介导链置换的速度，对单碱基突变探

19、针进行共定位就可以分析是否出现突变（Figure 2b）。固定细胞内的链置换也已经用于研究DNA标记的蛋白研究（55）。这种杂交和链置换的能力使得多种蛋白成像不再受限于显微镜能提供的波长（通常四种），转而之受限于能够实现杂交和链置换的序列数量。DNA-PAINT同样利用了DNA杂交的可逆性质。短的、荧光标记的DNA成像序列可以瞬间与互补的锚定链结合，从而附着至靶标上（56）。这种自发的结合与解离使得荧光像开关一样在打开与关闭之间切换，这使得靶标位点在全内反射显微镜上的成像分辨率达到10nm。综上所述，DNA-PAINT可逆的性质使其不受限于荧光分子的数量，而且标记于序列上的荧光染料可以反复使用

20、。DNA-PAINT在固定细胞内已经通过DNA锚定链结合的抗体来靶向细胞内的蛋白实现了三维成像（57）。Figure 2| 固定细胞内的mRNA原位成像。A, HCR FISH（52）。左：起始链杂交至靶标mRNA，然后引发两种荧光标记的发卡结构H1，H2之间发生聚合反应，使得mRNA上结合多个荧光分子，可以通过荧光显微镜成像。右：斑马鱼Z轴上不同位置的共聚焦显微镜成像。HCR探针用于检测四种不同的mRNA (红: Tg (flk1:egfp); 蓝: tpm3; 绿: elevl3; 黄: ntla). B, 通过链置换探针检测单碱基突变（53）。左：反应机制，突变型和野生型探针与靶标mRN

21、A竞争性结合。由于结合能力取决于Toehold序列，每一种探针都趋向于结合同源mRNA。通过多mRNA靶向探针与单核酸突变检测探针共定位进一步证明信号确实位于mRNA上。右：导向探针（image 1）、野生型探针（image 2）和突变探针（image 3）对BRAF mRNA进行荧光成像。Image 4显示了mRNA被区分为野生型或突变型。与细胞表面的标签相互作用哺乳动物细胞是由大量的区域和结构组成，不同的结构和区域负责不同的生化反应。细胞表面最容易接近的结构，脂质双分子层结合了许多表面蛋白，不同类型的细胞表面蛋白也不一样。最近的几篇文献证明DNA纳米系统通过设计可以与细胞表面的标签相互作用

22、；像抗体、适配体一样（58），DNA治疗剂最成熟的例子是靶向血液中的细胞表面标签和细胞，而不需要将纳米结构摄取至特定的细胞或组织中。Stojanovic和同事通过将DNA链置换探针共价修饰蛋白抗体的方法使探针结合特定的细胞表面蛋白（59）。细胞结合一种或者两种探针取决于细胞表面具有哪种蛋白。探针结合至蛋白后，加入引发链，激发包括探针在内的一系列的链置换反应，结果取决于细胞表面探针的种类和数量，从而区分细胞种类（Fig. 3a）。虽然在细胞表面标记两种荧光标记的抗体也能获得类似的结果，但是这项工作提供了更容易实现细胞状态分选的方法，使同时分析多种分子标签和将信息汇总为更容易翻译的动态信号更有可能

23、实现。Douglas等组装了DNA纳米机器人，载带可捕获特定种类细胞的分子（60）。这种捕获是通过适配体与原本不能捕获细胞的Origami链杂交将细胞与Origami连接在一起的。适配体是选择性结合特定蛋白或完整细胞的DNA或RNA（61，62），能够通过链杂交将纳米机器人与特定细胞结合，避免了将DNA与抗体结合。适配体也属于捕获机制的一部分，其与靶标蛋白结合后会发生构象变化，从而使Origami可以捕获。由两种不同的适配体设计组合成的逻辑与门被用来将不同的荧光和药物分子靶向至细胞（Fig. 3b）。有趣的是，一种相似的纳米机器人被证明可以在蟑螂血流中发挥作用，并与其它纳米机器人共同实现逻辑运

24、算（63）。Tan课题组也利用适配体构建的逻辑门区分混合的多种细胞（64）。该课题组最近证明模块化设计的逻辑门可以有更多的信号输入，能结合更多的杂交链，可以降低脱靶效应（65）。DNA纳米装置不仅可以标记细胞表面的标签，Origami的可寻址性可以在纳米尺度上精确控制适配体链的组装密度（66）。Shaw等DNA系统的可寻址性还可以为DNA进入细胞制造特殊身份。Francis和同事发展了一种将合成DNA固定至活细胞表面的方法，从而可以不受特意性分子数量限制的标记细胞（67）。合成糖处理细胞后变形并和细胞膜融为一体，可以作为“化学手臂”，然后磷酸化修饰的单链DNA通过Staudinger连接法连接

25、至“化学手臂”（68）。Gartner和Bertozzi证明这种方法可以用于将细胞组织形成三维细胞聚集结构（69）。作为结构指导膜功能的例子，作者将中国仓鼠细胞组织成“微膜”结构，为造血原细胞（FL5.12）的生长提供生长因子IL-3。造血原细胞只有接合至分泌IL-3的细胞才能生长。Gartner课题组进一步将这一策略用于不同细胞间不同的Ras信号对这种微膜结构变化的影响（70）。除了可以模仿细胞间的连接基元外，DNA还可以被用于模仿其它蛋白的功能。通过修饰亲水基团，DNA结构可以插入脂膜（71，72）。Burns等证明纳米孔通道插入脂膜后具有较强的细胞毒性（73），可能是由于离子、营养物及其

26、它跨膜分子的自由移动导致。Figure 3| 细胞表面计算A，通过细胞表面标签的原位评估进行细胞种类区分（59）。细胞先包裹DNA修饰的抗体（DNA回路、抗体以矩形和椭圆表示，DNA链用各种颜色的链表示），一个或两个逻辑门结合至细胞后，通过表面标签勾勒细胞轮廓。随后加入的起始链（红色）引发一系列链置换反应（完全互补的序列用同样的颜色标志）。可溶解的报告复合物只能结合表面同时结合了两种逻辑门的细胞。 B. 对特定细胞种类进行治疗的分子机器人。概要图介绍了管状纳米机器人响应细胞表面表达的特定抗原（钥匙）的机制（60）。纳米机器人最初由两条适配体锁链固定为一个封闭的结构，只有当它遇到膜表面呈现两种对

27、应抗体的细胞时才能打开，从而释放药物。底部：纳米机器人关闭和打开状态下的TEM图片（比例尺：20nm）。DNA纳米结构作为药物载运装置讨论至此不仅证明在细胞裂解液和培养基（以及昆虫内）中纳米装置和结构的可能性，而且展示了纳米系统与细胞表面蛋白相互作用的例子。现在，我们回顾一下将纳米装置转运至哺乳动物细胞内的困难，并讨论它们作为药物转运装置的工作。DNA纳米结构的细胞摄取毛成德等通过构建了叶酸修饰的DNA纳米管，靶向很多癌细胞表面过表达的叶酸受体，成功证明DNA大结构可以进入细胞。他们进一步在纳米管上修饰荧光标签确认纳米管或者碎片是同过于受体结合进入细胞的（7）。Walsh等证明脂质转染试剂存在

28、与否人类胚肾细胞对DNA四面体的摄取效率几乎一样，并通过FRET证明被细胞摄取很长时间后DNA四面体依然保持结构完整（74）。Schuller等证明比DNA四面体大的DNA折纸结构在无转染试剂辅助下也能进入细胞（75）。标记于折纸上的荧光在内化过程中可以示踪折纸的摄取过程，但是无法证明折纸在细胞内是否完整。应为DNA自身携带负电荷，然而令人惊奇的是在没有转染试剂的情况下细胞依然能摄取DNA纳米结构。梁乐等最近研究了DNA四面体细胞摄取机制，发现DNA四面体进入哺乳动物细胞是受体（特别是小窝蛋白）介导的内吞。进入细胞后DNA四面体沿着微管运动，最终在溶酶体内聚集。为了证明DNA纳米结构能够靶向细

29、胞内的不同位置，梁乐等在DNA四面体上修饰核定位序列，并在细胞核内成功检测到它们（76）。虽然DNA纳米结构可以有效的进入细胞，额外的修饰可以增强摄取效率或稳定性。比如Mikkila等证明人类胚肾细胞摄取病毒衣壳蛋白包裹方块DNA折纸的效率是lipofectamine2000转染的10倍（77）。Perrault和Shih构建了包裹在双层脂内的DNA八面体。八面体通过与修饰了脂质分子的DNA链杂交在表面形成脂鞘（78）。被包裹的八面体不仅免疫活性降低，而且在小鼠内循环内比位包裹脂质的八面体表现出更好的生物利用度（Fig. 1b）。药物转运CpG寡居脱氧核苷酸（ODNs）是可以刺激TLR9受体引

30、发强烈自身免疫的非甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤序列（79）。CpG ODNs是很好的治疗药物，因为可以完全通过杂交的方式将CpG直接连接至DNA纳米结构。Takakura和合作者构建基于CpG的Y型DNA刺激免疫应答（80，81）。他们发现与常见的单链或双链DNA相比，Y型DNA更容易被巨噬细胞摄取，因此可以增强免疫刺激。之后的研究证明修饰多个CpG ODN的多臂结构（82）、DNA四面体（83）、DNA折纸（75）可以被有效摄取并刺激免疫应答。Chang和合作者以链霉亲和素和CpG修饰DNA四面体构建了合成疫苗（84）。链霉亲和素模拟抗原，而CpG作为免疫佐剂增强免疫应答。这种结构首先在小鼠类

31、巨噬细胞细胞系内验证，然后注射至小鼠体内进行试验。注射了该种合成疫苗的小鼠比注射联合亲霉素与CpG混合物的小鼠表达更多的抗联合亲霉素IgG抗体。DOX是一种广泛应用于癌症治疗的细胞毒素类药物，DNA纳米结构也已被设计成DOX转运载体。之前已经有工作证明纳米颗粒包裹DOX可以降低副作用，同时有效增强体内循环时间（85）。另外，DOX可以嵌入DNA，天生适合于DNA颗粒一起转运，这一思路首先出现于DNA适配体领域（58）。Chang等首次利用DNA纳米结构（特别是20面体线框）转运DOX至癌细胞（86）。Jiang等基于这一思路设计了三角和管状DNA折纸转运DOX至胸腺癌细胞，折纸的大尺寸大大增加

32、了DOX的载带量，而且该复合结构不仅对常规的癌细胞有毒性，对DOX抗药癌细胞也作用（87）。Kim等同样发现DNA四面体载带的DOX也能作用于其他的抗DOX细胞系（88）。Hogberg及合作者发现通过改变DNA纳米管折纸的结构扭转角度可以调控DOX的载带、转运和释放（89）。Zhu等利用类似HCR的机制制备DNA聚合物来转运DOX（90）。这种聚合物可以通过适配体识别癌细胞，抑制小鼠体内肿瘤的生长。Zhang等通过尾静脉注射载带DOX的三角折纸至肿瘤小鼠发现相比相同计量的游离DOX，基于折纸的DOX转运能更快的降低肿瘤的重量（91）。已经有相关工作研究siRNA和ASO转运。Keum等在DN

33、A四面体的一条边链上插入一段具有茎环结构的反义序列证明ASO可以通过RNase H介导的序列特异性靶标mRNA降解降低蛋白表达量（92）。Lee等将siRNA和癌症靶向序列杂交至DNA四面体，证明DNA四面体可以转运siRNA至小鼠肿瘤（93）。他们证明在细胞培养环境中，DNA四面体上siRNA数量及相对位置会影响摄取与基因沉默效率。耦合了siRNA和靶向序列的DNA四面体在小鼠体内表现出高度的组织靶向性，大多聚集于肾脏和肿瘤，其它区域几乎没有。有一点需要说明的是体内实验和体外表征的四面体结合了不同数量的接合链。另外，文中并未提供DNA四面体在体内稳定性的相关数据，所以很难判定结构在此种环境中

34、的结构是否完整。最后，Weziman及合作者通过RCA制备长单链构建了周期性纳米带状折纸。纳米带进入细胞是通过网格蛋白介导的途径。siRNA共价结合至纳米带后基因沉默效率高于两者简单的混合（94）。这部分讨论的工作证明了：DNA纳米结构可以作为药物转运颗粒。DNA结构转运与其它纳米颗粒或聚合物转运方法的区别主要是DNA纳米结构的可设计行，以及可实现形状和尺寸的高度均一性。Figure 4|哺乳动物细胞内的纳米机器和逻辑门a,b, pH敏感的DNA纳米装置同时检测弗林蛋白酶（Fu）和蛋白转移酶（Tf）通路（97）。左：转铁蛋白修饰的DNA纳米机器Tf-ITf受限于转铁蛋白通路。纳米机器首先进入分

35、类内体（SE），然后进入循环内体（RE），最后回到细胞膜。DNA纳米机器Fu-IFu靶向弗林蛋白酶通路：首先进入分类内体，然后进入晚期内体（LE），最后集中于反面高尔基体（TGN）。纳米机器的荧光对不同内体环境之间不同的pH敏感。右：DNA纳米机器的pH敏感元件IFu（绿线，上部）和ITf（粉红色线，底部）在低pH环境下呈现i构型，荧光分子间发生FRET。 b，基于酶性DNA的与门在活细胞内工作（113）。左：包含miR-21和miR-125b序列的合成输入与逻辑与门一起显微注射进入细胞。右：反应机制。输入B首先结合至发卡（绿色部分），然后与输入A作用将与门的两个部件结合在一起。然后酶性DNA

36、剪切基质，将荧光分子（红点）从淬灭剂（黑点）附近释放，发出荧光。活细胞内的DNA动力学纳米装置这部分我们回顾在细胞内工作、对特殊环境因素产生应答的动力学核酸装置，包括对pH等环境变化敏感的装置。最近还有工作检测细胞内特定信息的携带者RNA。最后，我们讨论了核酸装置的输出对基因表达水平的调控，回顾了逻辑回路检测和分析多分子标签的早期工作。细胞环境传感酶性DNA和适配体等功能核酸已被作为生物传感器，广泛应用于细胞内分子水平的检测。在这里我们重点介绍两个将功能核酸传感器与DNA纳米马达或结构相结合的工作。Pei等构建了一系列具有一条或两条边链可重构的DNA四面体，这些边链会随着溶液内的质子、ATP和

37、水银等特定分子的信号变化而发生形变（95）。他们采用FRET报告策略实现了可形变的DNA四面体随着细胞内ATP浓度的变化而产生结构变化。这证明将DNA纳米结构与细胞传感器结合的可行性，这对潜在的智能药物的载带具有重要意义。Modi等通过相似的方法，利用DNA探针对活细胞内体途径各阶段的pH进行成像检测（96）。他们借鉴Yuke的DNA镊子设计，并以对pH敏感的i四联体作为开关来打开和关闭DNA镊子（Fig. 4a）。传感器被飞虫血细胞内吞后经历早期内体（pH 6）和晚期内体（pH 5.5），最终成为溶酶体（pH 5）。随着内体的酸性增强四联体的荧光发生变化，从而间接的检测pH。将传感器与转运蛋

38、白结合可以对特定受体介导的内吞途径进行成像。后续的研究中，该课题组证明pH敏感纳米机器可以在同一个细胞内同时追踪多个通路（97）。细胞RNA检测细胞的种类和健康状况往往可以通过RNA水平反映出来，但是检测处于细胞质的mRNA和miRNA要求纳米材料能够进入细胞质。另外，很多RNA是低拷贝的，必须进行信号放大。同时，RNA的二级结构和RNA结合蛋白也会降低某些探针序列与靶标RNA的结合能力。活细胞成像领域的很多相关问题已经被解决，同时发展了大量的可以在活细胞内检测特定mRNA的核酸探针。用于增强活细胞成像探针的化学和结构修饰方法也可以用于增强DNA纳米装置在细胞内的表现。茎上同时标记荧光分子和淬

39、灭剂的茎环式分子信标可能是目前用于活细胞mRNA成像研究最多的探针（98）。当探针处于游离状态时，荧光处于淬灭状态；而当探针与靶标mRNA杂交后，荧光转换为发光状态。在该设计为基础可增强探针表现：加入更长额RNA靶向序列或转运RNA（tRNA）序列会促进探针从细胞核进入细胞质，从而促进其与mRNA的相互作用（99-101）（Fig. 5a）。化学修饰，特别是RNA 2甲氧基修饰被用与阻值细胞内核酸酶的降解，增强探针的稳定性（102）。类似于上面描述的FISH技术，多探针共定位可以降低本底荧光的干扰（101）。通过链和亲霉素将几条寡聚核苷酸链连接在一起的MTRIP等多价探针也可以增强信号（103

40、）（Fig. 5b）.Mirkin与合作者设计的纳耀斑结构首次在活细胞内实现了与RNA的链置换反应（Fig. 5c）。纳耀斑结构以纳米金为核心，外围功能化修饰靶向mRNA或miRNA的DNA寡聚核苷酸链。较短的荧光标记的链与纳耀斑结构上的DNA链杂交，由于荧光分子靠近纳米金，所以处于被淬灭的状态（104）。与靶标结合后，短链被置换导致荧光信号增强。有一种修饰纳耀斑结构的技术是利用LNA修饰的短链来增强与靶标RNA的结合能力，虽然同是会导致靶标的降解（105，106）。Halo等进一步证明纳耀斑结构与流失细胞技术结合可在全血环境中分选循环的获得癌细胞（107）。调节细胞RNAASO、酶性核酸和s

41、iRNA等非编码核酸基因调节技术的出现不仅使得在细胞内设计DNA纳米系统成为可能，也可以与DNA纳米装置结合调控细胞内环境。Afonin等证明可以自组装成功能siRNA的两种DNA:RNA复合物单独存在细胞内时是不能实现RNA干扰的（108）。反应是从两个复合物中处于单链状态的延伸链间的杂交开始，可能是通过四通链置换的方式进行的（109）。在体外培养的细胞和异种移植的肿瘤鼠模型中检测到了siRNA活性。如果这种调控的反馈可以检测特定的分子信标将会更加有趣。Benenson和同事首次在这一方向进行研究，他们设计了能与细胞裂解液组分相互作用的核酸链置换回路（110）：当需检测的RNA加入裂解液后引

42、发链置换反应，生成有功能的siRNA。Pierce与合作者证明在无细胞生化分析中形成可被Dicer酶切的RNA的更普遍的规律（111）。Yokobayashi与合作者构建了遗传编码的RNA茎环系统作为RNA干扰通路的基底，通过合成的外源转运输入的寡聚核苷酸链激活（112）。分子计算实现多输入和多重分子回路是动态DNA纳米技术的一个重大的成就。相比基于合成基因调控网络的技术，DNA纳米技术在实现细胞内“生物计算”有什么优势？第一，DNA回路的组分的反应机制简单，可在分子水平上进行合理设计，因此可以对反应通路进行高度的控制。第二，通过简单的序列改变就可以设计新的或正交的组分，很易实现模块化的扩大系

43、统规模。第三，与遗传编码蛋白组装的系统相比，很多DNA装置具有相对的小DNA足印。Shapiro课题组将酶性DNA逻辑与门和miRNA延伸的输入一起显微注射至胸腺癌细胞MCF-7中（113）（Fig. 4b）。为了防止核酸酶降解逻辑门，在3末端修饰额外的反向胸腺嘧啶。逻辑门的运算通过荧光显微镜测定，荧光仅在两种输入同时存在的情况下才能增强，这与逻辑与门的模式一致。DNA链置换逻辑门最近也已经被用于检测活细胞内的mRNA聚合物。基于体外已经证明的设计（27），Hemphill和Deiters利用DNA组件的逻辑与门在肝癌细胞Huh7中检测内源mRNA miR-122和miR-21（114）。逻辑

44、门是通过标准的转染方式进入细胞的，其仅在同时表达两种输入miRNA的细胞中才能激活。这部分所回顾的结果证明动态DNA装置的设计在检测细胞内信息、通过嵌入分子控制回路来分析信息以及对细胞内产生的变化等方面有快速的进步。Figure 5|活细胞内mRNA成像a, 比率计生物分子信标（101）。顶部：与靶标mRNA的结合使得荧光分子（红点）从淬灭剂（黑点）上释放，从而发射高水平荧光。多个RBMB可以结合至异源mRNA 3UTR的串联重复靶标，可以呈现活细胞内的单拷贝mRNA。参照染料是掌控分子信标的转运在不同细胞间的差异。底部：RBMB和FISH探针对HT1080细胞内相同mRNA的荧光成像。图1：

45、FISH探针；图2：RBMB报告染料；图3：包含细胞核染色（蓝色）的合并图像。b, 多标记四价RNA成像探针（MTRIPs）（103）。顶部：MTRIPs由多条荧光标记的短链与链合青霉素（紫色）连接组成。通过设计可以使多个MTRIPs杂交至一条mRNA上，这样就可以在活细胞内对单条mRNA成像。底部：A549细胞内的-actin mRNA共聚焦成像。图1：MTRIPs；图2：竞争探针；图3：包含细胞核染色（蓝色）的合并图像。c, 纳耀斑结构（104-107）。左：纳耀斑结构包含较长的“捕获链”和荧光标记的“燃耗链”，荧光处于被纳米金淬灭的状态。当靶标mRNA与“捕获链”结合，“燃耗链”被置换，

46、使得荧光增强。右：Hela细胞的荧光共聚焦成像，左侧为对照纳耀斑处理的细胞，右侧为Survivin（靶标mRNA）纳耀斑处理的细胞。遗传编码的结构和装置从基因治疗到代谢管理，都需要应用植入来长期控制基因表达。活细胞内通过遗传编码或转录产生的RNA和调控元素比瞬时转运的合成DNA系统更适合。要通过改进将目前的DNA纳米技术适于转录需要大量的实验方法调整和分子设计。虽然这看上去是很大的挑战，但其实已经有了较大的突破。转录RNA的出现使得纳米技术与合成生物学的界限越来越模糊，我们在这里强调几个转录RNA相关的有趣工作。基于无细胞RNA纳米技术的二维和三维结构已经五花八门，RNA能够制备的结构尺寸也在快速的变大（115-120）。比如Afonin等6条或者10条40bp左右的短链通过共转录和恒温自组装构建RNA纳米管（120）。最近，Geary，Rothemun