第十三章可见分光光度法和紫外分光光度法简介

1、1 第十三章第十三章 紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法 （Vis-UV Spectrophotometry） 一、分光光度法基本原理一、分光光度法基本原理二、紫外二、紫外- -可见分光光度计可见分光光度计三、提高测量灵敏度和准确三、提高测量灵敏度和准确度的方法度的方法2本章目的要求本章目的要求掌握内容掌握内容 1. Lambert-Beer定律及其应用定律及其应用 2. 摩尔吸光系数摩尔吸光系数 3. 吸收光谱吸收光谱熟悉内容熟悉内容 1. 单色光和互补色光单色光和互补色光 2. 分光光度法的测定方法分光光度法的测定方法了解内容了解内容 1. 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计

2、2. 条件的选择条件的选择 3概念：概念： 分光光度法是根据物质的分光光度法是根据物质的吸收光谱吸收光谱及及光的吸收定光的吸收定律律，对物质进行定性、定量分析的一种分析方法，对物质进行定性、定量分析的一种分析方法。分类分类：可见可见分光光度法分光光度法(400760 nm)紫外紫外分光光度法分光光度法(10400 nm)红外红外分光光度法分光光度法(7603105 nm)4 此法的特点：此法的特点： 灵敏度高灵敏度高-10-4 mol/L 10-6 mol/L 相对误差小相对误差小-2%5% 应用广泛应用广泛-医药、卫生、环保、化工医药、卫生、环保、化工51 1 分光光度法基本原理分光光度法基

3、本原理一、物质对光的选择性吸收一、物质对光的选择性吸收1、当一束光照射到某物质或溶液时，组成该物质的粒、当一束光照射到某物质或溶液时，组成该物质的粒子会与光子作用，光子的能量转移到粒子上，使粒子子会与光子作用，光子的能量转移到粒子上，使粒子由低能量的由低能量的基态基态转为转为激发态激发态，而产生吸收谱线。而产生吸收谱线。M基态基态 + h v h v M*激发态激发态 、粒子对光子能量的吸收是、粒子对光子能量的吸收是有条件有条件的，只有的，只有h v =E才会被粒子吸收。才会被粒子吸收。 h v-光子的能量；光子的能量；E-被被照射粒子基态与激发态的能量差照射粒子基态与激发态的能量差 、不同物

4、质的、不同物质的E不同，所以它对光子的吸不同，所以它对光子的吸收具有收具有选择性选择性，会吸收不同波长的光。，会吸收不同波长的光。6 若某物质对各种色光均不吸收，若某物质对各种色光均不吸收，则呈现则呈现 ； 若全部吸收则呈若全部吸收则呈 ； 若吸收蓝色光则呈现若吸收蓝色光则呈现 。 2、单色光、复色光、互补色光单色光、复色光、互补色光单色光：单色光：具有单一波长的光叫单色光，如具有单一波长的光叫单色光，如红光红光，蓝光蓝光等等复色光：复色光：由不同波长的光组成的光叫复色光，如日光等由不同波长的光组成的光叫复色光，如日光等互补色光：互补色光：如果两种适当颜色的单色光按适当的强度比如果两种适当颜色

5、的单色光按适当的强度比例混合能得到白光，则这两种颜色的光叫做例混合能得到白光，则这两种颜色的光叫做互补色光互补色光。白光白光红红青蓝青蓝橙橙青青绿绿蓝蓝黄黄紫紫无色透明色无色透明色黑色黑色黄色黄色7 为了研究溶液对不同波长的光的吸收情况，将不同波长的为了研究溶液对不同波长的光的吸收情况，将不同波长的单色光依次通过一固定浓度的有色溶液，测量该溶液对不同波单色光依次通过一固定浓度的有色溶液，测量该溶液对不同波长的单色光的吸收程度，即长的单色光的吸收程度，即吸光度吸光度A ，以，以A为纵坐标，波长为纵坐标，波长 为横坐标作图，所得曲线即为该溶液的为横坐标作图，所得曲线即为该溶液的吸收光谱吸收光谱 吸

6、收光谱中与吸收吸收光谱中与吸收峰相对应的波长称为峰相对应的波长称为最最大吸收波长，大吸收波长， max max=515 A480 520 560nm 二、二、 物质的吸收光谱物质的吸收光谱8三三(邻二氮菲邻二氮菲)合铁合铁(II)离子离子的吸收光谱的吸收光谱A400 500 600max=510 绿绿 吸收光谱的意义：吸收光谱的意义：1、说明一种物质对不同波长的光、说明一种物质对不同波长的光的吸收程度是不同的；的吸收程度是不同的；2、一种物质的不同浓度的溶液，、一种物质的不同浓度的溶液，吸收光谱的形状基本相同，最大吸吸收光谱的形状基本相同，最大吸收波长也一样。收波长也一样。吸收曲线的形状和吸收

7、曲线的形状和 max 是定性分析的基础是定性分析的基础溶液的浓度愈大吸收光愈强溶液的浓度愈大吸收光愈强 是定量分析的基础是定量分析的基础9I 0I tI0=Ia+It+Ir吸收光强吸收光强Ia 反射光强反射光强IrIaIr 在实验中，被测溶液和参比溶液分别置于同样在实验中，被测溶液和参比溶液分别置于同样质地和厚度的比色皿中，反射光强度大小近似可相质地和厚度的比色皿中，反射光强度大小近似可相互抵消互抵消(扣除参比扣除参比)，则上式简化为，则上式简化为 I0 = Ia + It 三、透光率和吸光度三、透光率和吸光度10 透光率的负对数称为透光率的负对数称为 吸光度吸光度 A(absorbance)

8、 A= - lgT = lgI0It吸光度愈大，溶液对光的吸收愈多吸光度愈大，溶液对光的吸收愈多透射光的强度透射光的强度 It与入射光的强度与入射光的强度I0的比值称的比值称为为透光率或透射比透光率或透射比 T = ItI0透光率愈大，溶液对光的吸收愈少透光率愈大，溶液对光的吸收愈少11四、四、Lambert- Beer 定律定律 溶液对光的吸收除与溶液本性有关外，还溶液对光的吸收除与溶液本性有关外，还与入射光波长、溶液浓度、液层厚度及温与入射光波长、溶液浓度、液层厚度及温度等因素有关。度等因素有关。A=kbc b为液层厚度，通常以为液层厚度，通常以cm为单位为单位k称为吸收系数称为吸收系数(

9、absorptivity)，其数值的大小，其数值的大小，与物质的性质、入射光波长、溶剂种类及溶液温度等因素与物质的性质、入射光波长、溶剂种类及溶液温度等因素有关。当波长等其他因素一定时，只与物质的性质有关。有关。当波长等其他因素一定时，只与物质的性质有关。12A=kbc1、在一定条件下，溶液的吸光度与溶液的组、在一定条件下，溶液的吸光度与溶液的组成标度及液层厚度的乘积成正比。成标度及液层厚度的乘积成正比。2、此定律是光度法定量分析的基础，不仅适、此定律是光度法定量分析的基础，不仅适用于可见光，也适用于紫外光和红外光。用于可见光，也适用于紫外光和红外光。13 单位单位b 液层厚度：液层厚度：cm

10、c 物质的量浓度：物质的量浓度：mol L-1 摩尔吸光系数：摩尔吸光系数：L mol-1 cm-1Lambert - Beer Law A = k b c若若c为质量浓度，则为质量浓度，则一般一般大于大于10103 3即可进即可进行分光光度法测定行分光光度法测定若若c为物质的量浓度，则为物质的量浓度，则A=bc A= a b 单位单位b 液层厚度：液层厚度：cm 质量浓度：质量浓度：g L-1a 质量吸光系数：质量吸光系数：100mL g-1 cm-1当当100mL溶液中含被测物质溶液中含被测物质1g，液层厚度液层厚度b为为1cm时的吸光度时的吸光度值，称为比吸收系数值，称为比吸收系数(sp

11、ecific absorptivity) 14 a与与关系式为关系式为 BaMMB为吸光物质为吸光物质B的摩尔质量。的摩尔质量。 例例13.1 一有色溶液一有色溶液,当用当用1cm的比色皿测量时的比色皿测量时,其透光其透光率为率为T,若改用若改用2cm比色皿测量比色皿测量,则透光率应为多少？则透光率应为多少？解：解： 由式由式AlgT=abc，得，得 abcT10当比色皿为当比色皿为1cm时，时，当比色皿为当比色皿为2cm时，时，TTac10122210TTac15如果溶液中含有多种吸光物质时，若吸光物质之间如果溶液中含有多种吸光物质时，若吸光物质之间没有相互作用，则溶液的吸光度等于各吸光物质

12、的没有相互作用，则溶液的吸光度等于各吸光物质的吸光度之和，即吸光度之和，即).(.332211321iiiccccbAAAAA16第二节第二节 紫外紫外-可见分光光度计法可见分光光度计法17一、分光光度计的构造一、分光光度计的构造光源光源 检测检测 器器 吸收吸收 池池单色器单色器数据处理器数据处理器181. 光源光源要求足够强度，且强度恒定不变（电源要求足够强度，且强度恒定不变（电源稳压器）可见区：钨灯；紫外区：氢灯（氘灯）稳压器）可见区：钨灯；紫外区：氢灯（氘灯）2. 单色光器单色光器提供所需波长的单色光。提供所需波长的单色光。 单色器由单色器由棱镜或棱镜或光栅光栅、狭缝和准直镜组成，要狭

13、缝和准直镜组成，要求适当宽度的狭缝，以保证单色光光强和纯度求适当宽度的狭缝，以保证单色光光强和纯度193. 吸收池吸收池用来盛放溶液的容器。用来盛放溶液的容器。 可见光区可见光区：光学玻璃光学玻璃；紫外光区：石英；紫外光区：石英配套使用，有相同的厚度和透光性配套使用，有相同的厚度和透光性要求光洁、透明要求光洁、透明，切勿直接用手接触，切勿直接用手接触规格：规格：0.5、1.0、2.0、3.0、5.0cm 4. 检测检测器器光电二极管，光电二极管，进行光电转换、信号进行光电转换、信号放大及输出。放大及输出。 光光阴极阴极电子电子电流电流放大器放大器指示器指示器20u 紫外紫外-可见分光光度计的类

14、型可见分光光度计的类型 单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计分光光度计。 1 1、单光束分光光度计、单光束分光光度计：经单色器分光后的一束平：经单色器分光后的一束平行光，行光，轮流轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定光度的测定 ； 2 2、双光束分光光度计、双光束分光光度计：单色器分光后经反射镜分：单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，解为强度相等的两束光，一束一束通过参比池，通过参比池，另一另一束束通过样品池。通过样品池。 优点：能自动消除光源强度变化优点：能自动消除光源强度变化所引起的

15、误差所引起的误差 21 双波长分光光度计双波长分光光度计 优点：对于多组分混合物、浑浊试样（如生物组优点：对于多组分混合物、浑浊试样（如生物组织液等存在背景干扰或共存组分吸收干扰）分析，织液等存在背景干扰或共存组分吸收干扰）分析，能提高方法的灵敏度和选择性。能提高方法的灵敏度和选择性。 22二、测定方法及应用二、测定方法及应用（一）分光光度法的测定方法（一）分光光度法的测定方法1.标准曲线法标准曲线法依据：依据：A= kbc （1）配制一系列标准溶液配制一系列标准溶液 C1、C2Cn（2）选择适当波长选择适当波长 max（3）作标准曲线作标准曲线 用空白液调用空白液调0，测一系列标准溶液，测一

16、系列标准溶液的的A1、A2An，以，以A为纵坐标，为纵坐标，C为横坐标，作图为横坐标，作图得标准曲线得标准曲线.（4）测被测溶液吸光度测被测溶液吸光度，在标准曲线上查得其含量。，在标准曲线上查得其含量。23c（mg/L）A =550nm 40 80 120 2000.60.40.20.0242 2标准对照法标准对照法 将一个将一个标准溶液标准溶液和一个和一个待测溶液待测溶液（两者浓度相近）（两者浓度相近）在在相同条件相同条件下测定各自的吸光度，就可计算出待测下测定各自的吸光度，就可计算出待测溶液的浓度。若标准溶液的浓度为溶液的浓度。若标准溶液的浓度为cs，标准溶液的，标准溶液的吸光度为吸光度为

17、As；待测溶液的浓度为；待测溶液的浓度为cx，待测溶液的吸，待测溶液的吸光度为光度为Ax sssscbAxxxxcbAxsxsccAAssxxcAAc 25（二）紫外可见分光光度法的应用（二）紫外可见分光光度法的应用 1 1单组分测定单组分测定 磷磷 磷钼蓝光度法磷钼蓝光度法 反应反应 :H3PO4 12(NH4)2MoO4 21HNO3 (NH4)3PO4 12MoO3 21NH4NO3 12H2O+还原剂（还原剂（SnCl2、抗坏血酸等）将该杂多酸中的、抗坏血酸等）将该杂多酸中的Mo()还原为还原为Mo() ，即生产磷钼蓝，其，即生产磷钼蓝，其最大吸最大吸收波长为收波长为660nm。26（

18、一）（一） 仪器测定误差仪器测定误差1.光电管的灵敏度差光电管的灵敏度差2.光电流测量不准光电流测量不准3.光源不稳定光源不稳定4.读数不准读数不准 最佳读数范围最佳读数范围A = 0.20.7 第三节第三节 提高测量灵敏度和准确度的方法提高测量灵敏度和准确度的方法一、分光光度法的测定误差一、分光光度法的测定误差27（二）偏离朗伯比尔定律引起的误差（二）偏离朗伯比尔定律引起的误差 1、物理因素：单色光纯度差、杂散光、散、物理因素：单色光纯度差、杂散光、散射光、反射光、非平行光等导致偏离射光、反射光、非平行光等导致偏离朗伯朗伯比尔定律比尔定律 ，产生误差。，产生误差。 2、化学因素、化学因素（1

19、）溶液浓度过高引起的偏离）溶液浓度过高引起的偏离（2）化学反应引起的偏离）化学反应引起的偏离28A=bc 29二、分析条件的选择二、分析条件的选择v1、入射光波长的选择、入射光波长的选择 max2 2、吸光度范围的选择、吸光度范围的选择 0.20.7 3、 显色条件的选择显色条件的选择-选择合适的显色选择合适的显色剂剂 显色剂须具备的条件：显色剂须具备的条件： （1）灵敏度高）灵敏度高 104 （2）选择性好）选择性好 避免共存物的干扰避免共存物的干扰 （3）生成的有色物组成确定）生成的有色物组成确定 （4）生成的有色物质稳定）生成的有色物质稳定 （5）显色剂本身没有明显的吸收）显色剂本身没有明显的吸收 显色剂显色剂30 (1) 显色剂的用量显色剂的用量 由实验由实验A-c测定测定314、溶液的