抗呕吐毒素多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

1、抗呕吐毒素多克隆抗体的制备、纯化及鉴定作者：张银志，王俊双，孙秀兰【摘要】 耳的：制备呕吐毒素(don)的多克隆抗体，并对 抗体效价、特异性和抑制率进行鉴定。方法：采用edc法合成了呕吐 毒素的完全抗原don bsa,并通过免疫新西兰大白兔，得到呕吐毒 素的多克隆抗体。结果：eltsa检测出多抗中含有呕吐毒素的特异性 抗体，其效价最高为12 800,其抑制率为50%时，don的浓度为10 mg/l, don的最低检测浓度为0. 1 mg/lo与结构类似物t 2毒素和 niv的交叉率分别为9. 1%和4.9%。结论：呕吐毒素经过衍生化后制 备出完全抗原，经免疫新西兰大白兔后得到的多克隆抗体可以完

2、全满 足ehsa检测的需要。【关键词】呕吐毒索；多克隆抗体；鉴定呕吐毒素(vomitoxin)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (dcoxynivalcnol; don) 1,化学名为 3a, 7 a , 15一三瓮基草 镰抱菌 9 烯 8 酮，属单端抱霉烯族化合物。don主要由禾谷 镰刀菌(fusarium gram in earum)和黄色镰刀菌(fusarium culmorum ) 产生，广泛存在于霉变的小麦、大麦、玉米等谷物籽实中，具有急 性毒性、免疫毒性和胚胎毒性等危害2-4。目前国内关于don的检 测方法，主要包括薄层层析法(tlc)、高效液相色谱法(hplc)、气相色谱法（gc）、lc

3、apci ms和免疫学检测方法。免疫学检测方法 具有特异性强、灵敏度高、实验操作较简单等优点，广泛应用真菌 毒素检测。冃前国内有少数几家公司生产用于检测呕吐毒素的elisa 试剂盒，但生产屮的主要试剂don的完全抗原和多克隆抗体基本来自 于国外，价格昂贵。我们在本实验室合成了 don免疫抗原和检测抗原 的基础上，制备了 don多克隆抗体，对抗体效价和特异性进行检测, 研究结果为建立呕吐毒素的免疫检测方法奠定了基础。1材料和方法1.1材料酶标仪、洗板机和可调试移液器为thermolabsystem公司；冷冻离心机为allegra公司；冷冻于燥机为labconco公司；微量可调移液器:finnpi

4、pette公司;96孔和16孔酶标板:corning公司。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（don）jiff弗氏不完全佐剂（tcfa）、弗氏完全佐剂（cfa）、牛血清白蛋白（bsa）、卵清蛋口 （ova）均购自于sigma.公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg（hrp igg）、1 乙基 3（3二甲氨丙基）碳二亚胺盐酸盐(edc hc1)u!甲基联苯胺（tmb）上海生工生物技术服务工程公司;tween 20国药集团化学试剂有限公司。透析带（截留分子量14 000） 为上海华美生物工程有限公。新西兰长耳白兔（雄性，1520 kg） 购自上海陈行实验用兔有限公司。1.2. 1完全抗原的制备(1)分别称取dcc

5、 0. 78 mg> nhs 1. 38 mg,并分别溶于100 ul的dmf屮，待用。(2)分别称取4 mg bsa 和mbsa溶于200 u l, 0. 01 mol/l ph7. 4 pbs中，冰箱中冷藏待用。 将don衍生物溶于350 »l的dmf中，将nhs溶液加入，并在搅拌 的同时缓慢加入dcc溶液，混合物在4°c避光反应2h,经离心提取上 清夜，然后在搅拌的同时缓慢滴加bsa (或mbsa)溶液，4°c下缓慢 搅拌反应20 ho (3)将产物溶液用0. 01 mol/l ph7. 4 pbs溶液在4°c 下透析72 h,每12 h换透

6、析液1次，溶液用小瓶分装，真空冷冻干 燥后，在4°c保存。制备包被抗原所用的蛋口为ova,方法与免疫抗原 相同5-8o1.2.2抗血清的制备选3只健康新西兰雄性大白兔，取其 中1只作为阴性对照，剩余2只为实验组。初次免疫时，将don bsa 冻干粉用生理盐水溶解，用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量，配 成1 g/l的溶液。将上述溶液与等量完全或不完全福氏佐剂用混合搅 拌法将其充分乳化好后，于实验动物背部皮下多点注射，iml/只。初 次免疫后的免疫称为加强免疫，加强免疫用福氏不完全佐剂乳化，第 1次加强免疫于足下注射，以后的加强免疫于肌肉多点注射，每2周 加强免疫1次，剂量与初次免疫相

7、同。第2次加强免疫后，每隔2周 耳缘静脉取血测定效价变化，4次加强免疫后从耳缘静脉采血，采用间接酶联免疫法测定抗血清效价。待效价达到要求后，单独用免疫原 冲击免疫1次，7 d后采用颈动脉取血获得抗血清，收集于50 ml灭 菌塑料离心管中，备用。1.2.3纯化塑料离心管倾斜，与水平成50°于室温下静置4 h,待血液凝固后，于4°c冰箱过復，血清自然析出。将血清吸出后,3 000 r/min离心15 min,取上清，与前面吸出的血清混在一起，再 以4 000 r/min离心10 min,然后加入0. 2 g/l叠氮钠和500 ml/l 廿油，分装，-20£保存备用。1

8、. 2. 4效价测定 采用饱和硫酸钱二次沉淀法纯化抗体9o1 : 100稀释don ova包被液，100 ul/孔，4°c冰箱过夜；弃去包 被液，每孔注入200 u l洗液，于振荡器上振荡3 min,如此重复洗 涤3次；拍干酶标板，每孔加入150 li l溶液封闭酶标板，37°c封闭2 h;洗涤3次，按100 ul/孔加入抗血清(或don 抗血清的混合 物)，37°c孵育lh;弃去抗血清洗涤3次，拍干，加入酶标二抗，100 ul/扎37°c孵育lh;弃去酶标二抗，洗涤3次，每孔加入100 ul 底物显色溶液，37°c避光15 min;每孔加入终

9、止液50 ul,测定450 nm的吸光度值(a450)。间接elisa法测定抗血清的效价，将抗血清 和阴性对照血清进行逐级稀释，空白对照孔不加抗血清而加入100 u l pbs溶液。阳性血清的a450m阴性对照孔的2. 1倍并且a450大 于0.1,此时的抗体稀释倍数即是该抗血清的效价。1.2.5抑制浓度ic50和交叉反应率的测定（1）用pbs将 don 标准品稀释成不同浓度（1 000、100、10、1、0.1、0. 01mg/l） 标准液，将标准液和适当浓度的抗血清混合，吸取混合液100 ul按 照eijsa进行测定。以（1 a/ao） x100%接近50%时的混合液中 的don标准浓度作

10、为ic50o （2）以不同浓度（1 000、100、10、1、 0.1、0.01mg/l）的don的近似物t 2毒素替代don,按照elisa 进行测定分别得到各口的抑制浓度ic50,以don的ic50除以近似 物t 2毒素的ic50'得到交叉反应率（ic50/ic50' x100% ）,根 据交叉反应率的人小反映抗血清的特异性。2结果2. 1 don人工抗原的鉴定（1）从ir图谱（图1）屮可以看 出，谱带1、2、3存在差异。bsa的红外光谱显示了蛋白质所共有 的谱带，3 315 cm-1为胺基伸缩振动产生，1 651 cm-1和1 538 cm-1 为酰胺带i和酰胺带ii。d

11、on bsa偶联物的红外光谱图基本显示出 bsa的特征吸收谱带，但与bsa相比，偶联物在1 070 cm-1和1 024 cm-1 （c 0键的吸收）处显示出了明显的吸收峰，这与don标准品 在这两处的吸收相吻合。而呕叶毒素的衍生物结构中的有些特征基团 如1 735 cm-1的丁酮（碳基c二0）,由于受bsa吸收峰的影响表现并 不明显o（2）elisa检测法：为了进一步证明don完全抗原的存在，用 elisa法进行2次检测。从表1中的数据可以看出，与呕吐毒素的标 准溶液相比，在酶联免疫反应中呕吐毒素的完全抗原表现出了相同a 值变化趋势，可以证明偶联是成功的。图1 don bsa偶联物红外光谱图

12、（略）2.2抗血清的鉴定（1）抗血清效价的确定：第2次免疫1 周后，兔耳缘静脉取血测定抗血清的效价，以后每隔3周取血测定1 次，直到动脉完全采血，抗血清效价的变化如图2所示，从图2可以 很明显看岀，免疫动物抗血清的效价呈不断升高的趋势，最后1次免 疫取血抗血清效价明显提高，表明完全抗原的免疫性较好。由于收集 到的血清中存在一些非特异性的物质，故需要将抗血清纯化后再进行 效价测定。对纯化前后测定抗血清的效价做了比较，从结果可以看出, 纯化后抗血清的效价要明显好于纯化前的血清。（2）抗血清效价的测 定:采用间接eltsa测定抗血清的效价，1号、2号两只兔子抗血清的 效价分别为12 800和1 60

13、0o表1呕吐毒素完全抗原elisa检测数据（略）图2几次采血后的抗血清效价的测定（略）2. 3多克隆抗体特性鉴定图3显示，don的浓度在0. 1 n）g/l 至100 mg/l之间与a/ao有良好的线性关系。截取don浓度在0. 1 mg/l 至100 mg/l之间，以吸光度比值a/a0为纵坐标，1 000倍don标准 溶液的浓度的对数值为横坐标拟合标准曲线，得到线性回归方程为： y二-0.2134x+1.3463, r2=0 9962。以 a/a0 值接近 50%所对应的 don 的 浓度为ic50, a/ao值接近50%时，don的浓度为10 mg/l,即本实验 方法所得tc50值为10

14、mg/lo该值恰好位于标准曲线的线性区间上。同时研究了 don的两种结构类似物t 2毒素、雪腐镰刀菌 烯醇niv对抗血清的竞争抑制反应性，结果显示，t 2毒素代替don 所得ic50为110 mg/l、niv代替don标准溶液所得ic50为204 mg/l , don与t 2毒素、ntv的交叉反应率分别为9. 1%, 4.9%。图3抑制率曲线（略）3讨论don的相对分子质量仅为296. 3,属于小分子半抗原，有免 疫反应性，无免疫原性，只有将其与大分子载体蛋白偶联，才能作为 免疫原。可用的载体蛋白有bsa、兔血清白蛋白（rsa）、牛甲状腺 球蛋白（btg）以及ova等，其中以bsa、ova最为

15、常用43为了减 缓免疫原在动物机休内的释放速度，延长免疫原具有免疫活性的时间, 在免疫前必须将免疫原与佐剂乳化完全，形成油包水的结构。据呕吐毒素木身的结构特性，需要用化学方法在呕吐毒素上 引入竣基后才能与载体相连，然后应用碳二亚胺法合成完全抗原，该 法可分为两种，一种是在有机相中进行反应的二环已基碳二亚胺法 (dcc法)，另一种是在水和屮进行反应的对乙基一 n, n 二甲基丙基 碳二亚胺法(简称edc法)。我们采用dcc法进行合成，合成过程中需 要在严格的无水条件下进行反应，所用的有机溶剂需预先脱水处理。本实验得到的呕吐毒素的抗原和多克隆抗体经elisa鉴定后 完全符合elisa检测的要求，不

16、仅为建立呕吐毒素elisa和金标侧流 层析(cgta)等检测法奠定了基础，同时也可以用于基于免疫抗体识 别分析的don的相关研究中。【参考文献】1 刘绍伟，罗仕欢浅谈霉菌呕吐毒素j湖南饲 料，2006(2) : 26-272 阳传和，刘畅，罗雪云，等.小麦中脱氧雪腐镰刀菌 烯醇酶联免疫吸附测定方法的研究j微生物学报，1994, 34(1): 65-70.3 李国华，陆曙梅.免疫检验技术m.北京：人民卫生出版社，2002, 125.4 梁颖，张春晖，刘邻渭.液相色谱 质谱测定小麦中b类单端抱霉烯族毒素j中华预防医学杂志，2006, 40(4): 293-295.5 王俊双，袁耀萍，孙秀兰.dcc法制备脱氧雪腐镰刀 菌烯醇人工抗原的研究j食品研究与开发，200& 29 (5): 118-