基于金纳米微粒的化学发光免疫分析和特定序列DNA分析(精)

1、基于金纳米微粒的化学发光免疫分析和特定序列 DNA 分析 免疫分析和特定序列 DNA 分析在近几年一直吸引着各国学者的关注，检 测方法包括有电化学法、分光光度法、荧光法、同位素法和化学发光法 (CL) 等。各种方法各有优缺点。同位素法是最为成熟的方法 , 但是不可否认的是同位 素标记技术较为繁琐 , 且存在一定的环境污染 , 也可能对人的健康造成一定的损 害。为了替代同位素法 , 其他的非放射性技术 , 包括有电化学法 , 酶法, 荧光法 ,CL 法在近几年发展迅速。CL 分析是根据化学反应产生的光辐射(化学发光)确定物 质含量的一种痕量分析方法。CL 分析法不需光源，避免了杂散光的干扰，具有

2、检 测灵敏度高的特点 ,且仪器设备简单、操作简便 , 已成为近年来一个非常活跃的 研究领域 , 目前已成功地应用在药学、生物学、分子生物学、临床医学和环境学 等诸多领域。金纳米微粒作为生物标记物与现有的标记物相比 , 具有制备过程简 单,价格便宜 ,制备的纳米微粒标记物性质稳定 ,生物活性损失小等优点 , 是一种 理想的标记分子。因此，本论文以金纳米微粒为标记物，采用 CL 分析法,发展了 一系列具有创新意义的基于金纳米微粒的 CL 免疫分析和特定序列 DNA 分析法, 整个论文由以下六个部分构成 : 第一章基于金纳米微粒的化学发光金属免疫分析 1、基于 96 孔板的化学发光金属免疫分析大量的

3、研究表明 , 第二抗体上标记分子 数目的增加能够导致免疫反应灵敏度的大幅增加 , 但过多的标记分子存在又会降 低抗体的生物活性。鉴于单个金纳米微粒中包含了成千上万个金原子的特性 (如 1个 20 nm 的胶体金微粒,在理论上包含了 2.3 X 105 个金原子),用金纳米微粒 标记第二抗体，在免疫反应结束后将金纳米微粒溶解形成 Au(3+)离子进行检测, 可大幅提高免疫反应的检测灵敏度。本节将金纳米微粒作为生物标记物的优势 与 CL测定 Au(3+)离子的高灵敏度相结合，将金纳米微粒引入生物素化抗体和 人 IgG 的 CL金属免疫分析,以 96 孔板为载体发展了三种基于金纳米微粒溶解的 CL

4、免疫分析法。 探讨了金纳米微粒溶解及 CL 测定的最佳条件。在(一抗-IgG- 金纳米微粒修饰二抗)检测系统中，基于 10nm 和 30nm 金纳米微粒测定 IgG 的线 性范围分别为 1-75 ng 和 0.5-25 ng, 检出限分别为 0.5 ng 和 0.1 ng 。在(一抗 -IgG-生物素化抗体-金纳米微粒修饰链霉亲和素)检测系统中,5 nm 和 10 nm 金 纳米微粒测定 IgG 的线性范围分别为 10-250ng 和 1-250ng, 检出限分别为 5 ng 和 1 ng。 2、基于磁性分离的化学发光金属免疫分析免疫磁性微球是将磁性分 离技术和免疫学结合而发展起来的一类新型材

5、料。其表面包被有单克隆抗体 , 可 与相应抗原特异性地结合 , 然后在磁场作用下与溶液相分离 , 方便地将待测物以 结合体的方式分离出来 , 从而实现了均相反应 , 异相分离。免疫磁性微球具有很 多优良特性 , 分离简便易行、靶物质的生物活性能够得到高效保留 ,且高效、快 速、低毒 , 可广泛应用于细胞分离和提纯、免疫检测、核酸分析基因工程、靶向 释药载体等领域。本节建立了基于磁性分离和金纳米微粒标记的高灵敏度 CL 免 疫分析方法。人 IgG 抗原分别与固定于磁性微球表面的羊抗人 IgG 和金纳米微 粒标记的二抗结合 , 形成夹心结构的免疫复合物 , 在免疫反应结束后 , 采用 HCl- N

6、aCI-Br_2溶液将金纳米微粒溶解,释放出的 Au(3+)离子催化鲁米诺(luminol) 产生 CL，间接定量人 IgG。该方法检测人 IgG 的检测灵敏度可达到 3X 10(-12) mol/L, 优于传统的酶联免疫法以及基于金纳米微粒的电化学分析法。同时 , 该方 法也易于拓宽至其他的生物检测如 DNA 杂交分析等领域。第二章基于金纳米微 粒的炭疽杆菌 DNA 化学发光分析作为一种全球性的生化武器，炭疽杆菌引起了公 众以及军事部门的热切关注 , 建立实时有效的识别、检测技术 , 对控制其传播具 有重要意义。本文以磁性微球作为载体 , 金纳米微粒作为标记 , 构建了检测炭疽 杆菌毒力相关

7、质粒 pX01 的 pag 基因片段的 DNA CL 检测新技术。首先，将氨基修 饰的炭疽杆菌捕获 DNA 探针固定在羧基化磁性微球上；然后与炭疽杆菌目标 DNA 和生物素修饰的报告探针杂交 ; 再与链霉亲和素修饰的金纳米微粒反应 ; 金纳米 微粒溶解,释放出 Au(3+)离子,形成 AuCI_2 离子，催化 luminol 体系产生 CL,实 现了炭疽杆菌目标 DNA 勺监控。炭疽杆菌目标 DNA 在 0.02-2.0 pmol 范围内,CL 信号随含量线性增加 (R2=0.990), 最低检测限为 0.01 pmol 。本章所报导新技 术的检测灵敏度 ,较文献所见的基于金纳米微粒溶解的电化

8、学测定法灵敏度提高 了 150 倍,比 ICP-MS 法的灵敏度增加了 20 倍。第三章基于聚苯乙烯微球放大的 特定序列 DNA 化学发光分析一个 0.5 卩 m 的聚苯乙烯微球表面大约可以沉积 80 个 5nm 的金纳米微粒，本章在第二章工作的基础上，采用链霉亲和素修饰的聚苯 乙烯微球代替链霉亲和素修饰的金纳米微粒 , 构建了以聚苯乙烯微球为载体的高 灵敏度的炭疽杆菌 DNA 放大检测技术。整个分析过程由以下几个步骤构成 :(1) 将氨基修饰的捕获探针固定于经过 EDC 舌化的羧基修饰的磁性微球表面；(2)通 过第一步杂交将目标 DNA 序列结合于磁性微球表面;(3)目标 DNA 序列与生物

9、素 修饰报告序列二次杂交 ；(4) 用链霉亲和素修饰的聚苯乙烯微球代替链霉亲和素 修饰的金纳米微粒 ,与报告序列上修饰的生物素反应 ；(5) 将生物素金纳米微粒组 装在聚苯乙烯微球表面。 溶解金纳米微粒，测定其 CL 强度，间接定量炭疽杆 菌目标 DNA 勺量。炭疽杆菌 DNA 在 0.5-200 fmol 范围内,CL 信号随含量线性增 加(R2=0.989),最低可检测浓度为 1X 10(-12) mol/L(反应体积为 100 卩 L,绝 对量为 0.1 fmol), 较第二章不放大方法提高了 100 倍。错配识别实验表明该方 法可以较好地区别目标序列和各种错配序列。综上所述，本章所构建

10、的 CL 新技 术非常适合于高灵敏度检测炭疽杆菌特定序列。第四章羟胺放大化学发光及目 视比色法测定特定序列 DNA1 基于 96 孔板的羟胺放大特定序列 DNA 分析金纳 米微粒能催化 HAuCI_4-NH_2O 氧化还原反应，使 Au 原子沉积到金纳米微粒表面： 导致金纳米微粒的直径由小变大。基于此 , 本章发展了羟胺还原放大技术 ,分别 采用目视和 CL 分析法测定了炭疽杆菌目标 DNA 反应包括四步:(1)氨基修饰的 捕获探针共价结合到 DNA 结合板上,并与目标 DNA 或错配 DNA 部分序列杂交;(2) 金纳米微粒探针与目标 DNA 勺剩余碱基部分杂交，形成三明治式的夹心结构；(3

11、) 羟胺还原放大 ,Au 原子沉积到金纳米微粒表面 ;(4) CL 法或目视比色法间接测定 目标 DNA 的量。采用目视比色法，实验结果直接通过肉眼就能观测得到，简单方 便,能在不具备 CL 设备的实验室广泛应用。相对而言,采用 CL 法可大幅提高检 测灵敏度，目标序列 DNA 勺最低检测限可达 10amol。更重要的是，该方法能在既 不升高洗涤温度也不降低洗涤液盐浓度的常规杂交条件下 , 很好地识别 8 种单碱 基错配 DNA 序列,表明该方法有望应用在单碱基多态性分析领域。综合而言 ，本 节采用的目视分析法和 CL 分析法,简化了仪器设备，缩短了分析时间，为临床、 环境和生物防护等领域的特

12、定序列 DNA 分析提供了有价值的手段。2、均相目视 比色法测定特定序列 DNA 本节以磁性微球为载体，发展了羟胺还原放大均相目视 比色法测定炭疽杆菌目标 DNA 该技术包括以下步骤:(1)将氨基修饰的捕获探 针固定于经 EDC 舌化的羧基磁珠表面；(2)通过第一步杂交反应将目标序列结合 于磁性微球表面 ;(3) 链霉亲和素修饰的金纳米微粒表面结合生物素修饰的报告 序列制备成金纳米微粒探针 , 通过第二步杂交反应将金纳米微粒探针结合于磁性 微球表面；(4)在 80C水浴中,使结合的金纳米微粒从磁性微球表面解离；(5)收 集从磁性微球表面解离的金纳米微粒，金染色后采用酶标仪测定其在 630nm

13、处的 吸收值，间接定量炭疽杆菌目标 DNA 的量。米用该方法测定炭疽杆菌目标 DNA 勺 线性范围为 0.25-25 fmol,最低检出限为 0.1 fmol,较上一节中基于 96 孔板的 目视比色法测定炭疽杆菌目标 DNA 勺检测灵敏度提高了一个数量级。第五章基 于金纳米微粒形成的目视比色汞离子分析人体内的重金属含量如果超标 ，容易造 成慢性中毒。因此，重金属检查是药物杂质检查项下的重要检查项目。汞是重金 属中的一种，对人体的危害极大，建立快速、灵敏的 Hg(2+)离子测定方法有着 重要的意义。本章在第四章的基础上，基于羟胺还原反应构建了基于金纳米微粒 形成的目视比色法汞离子(Hg(2+)测

14、定方法。基本原理:Hg(2+)离子能催化 HAuCI_4-NH_2O 氧化还原形成金纳米微粒,金纳米微粒的形成速度随着溶液中 含 Hg(2+)离子的浓度增加而加快。基于此原理，建立了基于金纳米微粒形成的 目视比色 Hg(2+)离子测定方法。整个测定过程仅需 16 min,测定 Hg(2+)离子 的线性范围为 10-1000 nmol/L,最低检出限为 10 nmol/L(2ppb)。除此之外，该 方法也显示出良好的选择性,12 种干扰金属离子在浓度在高于 Hg(2+)离子浓度 100 倍的情况下仍不干扰测定。综上所述，本章发展了简便、灵敏、专一性强的 目视比色 Hg(2+)离子测定法，有广泛的

15、应用前景。第六章综述一一化学发光免 疫分析及 DNA 分析免疫分析和 DNA 分析在近几年一直吸引着各国学者的关注，各 种检测方法已被用于了免疫分析和 DNA 分析。本章综述了 2000年至 2008 年所 发展的 CL 免疫分析法及 DNA 分析法的特点，分为两个部分。第一部分以不同的 标记物分类，主要介绍了单组分 CL 免疫分析和特定序列 DNA CL 分析方法的研究 进展。 第二部分分别介绍了基于空间位置识别模式和基于标记物识别模式的多 组分 CL 检测技术的研究进展。 同主题文章王 1 . 王胜林,王强斌,古宏晨,朱以华.磁性微球的生物医学应用研究进展 J. 化学世界.2001.(07) 2 . 刘先桥,官月平,邢建民,马志亚,刘会洲磁性微球的制备及在细胞分 离中的应用J. 化学通报.2004.(10) 3 . 程新宝 ,袁曙光,李玛琳.丝裂霉素磁性微球体外抗肿瘤活性研究J. 中原 医刊.2003.(14) 4 . 兰小鹏,朱忠勇.磁性微球在生物医学上应用的新进展J. 国际检 验医学杂志.1993.(04) . 丁皓，吴晓俐，朱运松，宋后燕.抗人 IgG 单克隆抗体制备和鉴定 J.上海医科大学学报.1994.(03) 成党效磁性微球一一一种新的靶向给药系统J. 陕西医学杂志. 1995.(02) 7 . 惠旭辉，高立达，方康勋，王光祖.磁控血