刘秀丽毕业答辩

1、答答 辩辩 人人：刘秀丽：刘秀丽指导老师：张金文指导老师：张金文专专 业：植物学业：植物学马铃薯晚疫病、环腐病和青枯马铃薯晚疫病、环腐病和青枯病同步分子检测技术的研究病同步分子检测技术的研究甘肃省科技重大甘肃省科技重大专项专项（1102NKDA0251102NKDA025 ）国家国家自然科学基金自然科学基金（3126034331260343）资助资助主要内容主要内容1研究技术路线研究技术路线2实验材料与方法实验材料与方法3 结果与分析结果与分析4主要主要结论结论5 研究目的与意义研究目的与意义一、研究一、研究目的与目的与意义意义马铃薯马铃薯(Solanum tuberosum L.)是茄科茄属

2、是茄科茄属植物植物，是世界上仅次于水是世界上仅次于水稻、小麦、玉米的第四大稻、小麦、玉米的第四大粮菜兼用作物粮菜兼用作物。马铃薯病害问题也日益突马铃薯病害问题也日益突出，严重影响了马铃薯的出，严重影响了马铃薯的产量和品质，并制约着马产量和品质，并制约着马铃薯生产的发展。铃薯生产的发展。一、研究一、研究目的与目的与意义意义马铃薯晚疫病马铃薯晚疫病（Potato Late Bright）起源于墨西哥，是）起源于墨西哥，是由卵菌纲致病疫由卵菌纲致病疫霉引起霉引起的，的，导致马铃薯茎叶死亡和块茎导致马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂的一种毁灭性腐烂的一种毁灭性真菌真菌病害病害。仅仅在发展中国家晚疫病所造在发展中

3、国家晚疫病所造成的马铃薯的经济损失高达成的马铃薯的经济损失高达 32.5 亿美元，并且种植过程亿美元，并且种植过程中使用的杀菌剂的花费亦高中使用的杀菌剂的花费亦高达达 7.5 亿亿美元美元。一、研究一、研究目的与目的与意义意义马铃薯环腐病马铃薯环腐病(Potato Ring Rot)是由密执安是由密执安棒形杆菌环腐棒形杆菌环腐亚种引起亚种引起的一种危害输导组织的一种危害输导组织的的细菌性细菌性病害病害，以种薯带菌为主要传播以种薯带菌为主要传播途径。途径。一、研究一、研究目的与目的与意义意义马铃薯青枯病马铃薯青枯病( (Potato bacterial wilt) )，又名，又名细菌细菌性性枯萎

4、病。从发生地枯萎病。从发生地域或危害性来说，域或危害性来说，青枯病是马铃薯病青枯病是马铃薯病害中仅次于晚疫病害中仅次于晚疫病的一种常见病和多的一种常见病和多发病，为世界性重发病，为世界性重大大细菌性病害细菌性病害。一、研究一、研究目的与目的与意义意义目前对植物病原检测的方法主要有：传统的目前对植物病原检测的方法主要有：传统的病菌鉴定检测法；血清学鉴定检测法；分子病菌鉴定检测法；血清学鉴定检测法；分子生物学检测生物学检测方法方法等。等。分子分子检测技术的检测技术的方法方法，特别是特别是其中其中 PCR 技技术，以它反应迅速灵敏、针对的目标物是性术，以它反应迅速灵敏、针对的目标物是性状稳定、容易保

5、存、不受表达影响的遗传物状稳定、容易保存、不受表达影响的遗传物质质 DNA，且对样品要求低，探针制作简易耗，且对样品要求低，探针制作简易耗费低等优势，成为植物病原检测的主要发展费低等优势，成为植物病原检测的主要发展趋势。趋势。一、研究一、研究目的与目的与意义意义建立建立一一套套针对马铃薯针对马铃薯晚疫病、晚疫病、环腐病环腐病和和青青枯枯病病能够同时、能够同时、快速快速、准确的准确的检测检测技术技术。预期目的预期目的核心技术核心技术多重多重PCR：同一同一个反个反应应体系中加入两对或两体系中加入两对或两对对以上引物以上引物，分别扩增，分别扩增得到不同的目的片段。得到不同的目的片段。马铃薯病原菌生

6、物信息学分析马铃薯病原菌生物信息学分析多重多重PCR检测体系的验证检测体系的验证构建多重构建多重PCR检测体系并优化参数检测体系并优化参数建立单一引物建立单一引物PCR反应体系并优化反应体系并优化序列比对、分析，设计检测引物序列比对、分析，设计检测引物结合结合NCBI信息设计合成信息设计合成引物克隆靶标基因序列引物克隆靶标基因序列筛选确定保守靶标序列筛选确定保守靶标序列提取感病马铃薯基因组提取感病马铃薯基因组DNA感病马铃薯植株样本采集感病马铃薯植株样本采集二二 研究研究技术路线技术路线三、实验材料与方法三、实验材料与方法菌种与质粒菌种与质粒植物材料植物材料主要试剂主要试剂E. coli DH

7、5；pMD19-T Vector。马铃薯马铃薯青枯青枯病菌株购买于中国微生物菌种保藏中心，病菌株购买于中国微生物菌种保藏中心，其他马铃薯病害的真菌和细菌由甘肃省农其他马铃薯病害的真菌和细菌由甘肃省农科院植保所科院植保所引进引进。马铃薯马铃薯感病植株叶片和感病植株叶片和块茎采块茎采自甘肃省渭源自甘肃省渭源县会川镇和县会川镇和甘南州甘南州。限制性内切酶限制性内切酶、Taq DNA聚合酶；抗生素及标准聚合酶；抗生素及标准DNA分子量分子量Marker、普通琼脂糖凝胶、普通琼脂糖凝胶DNA回收回收纯化试剂纯化试剂盒。盒。 三、实验材料与方法三、实验材料与方法基因组的提取基因组的提取感受态细胞的感受态细

8、胞的制备制备蓝白菌落蓝白菌落筛选阳性克隆筛选阳性克隆马铃薯病原微生物目标序列的筛选及克隆马铃薯病原微生物目标序列的筛选及克隆构建构建多重多重 PCR 检测体系的各引物的检测体系的各引物的设计设计多重多重PCR体系的建立及参数优化体系的建立及参数优化多重多重 PCR 体系构建流程体系构建流程四、结果与分析四、结果与分析不同材料的基因组的提取不同材料的基因组的提取A. 感晚疫病马铃薯；B. 感环腐病马铃薯；C. 感青枯病菌马铃薯。四、结果与分析四、结果与分析注：A-M. DL1000分子量标记； A-1. 晚疫病菌ITS序列克隆；B-M. RTM418分子量标记；B-1. 环腐病菌纤维素酶基因克隆

9、；C-M. DL1000分子量标记；C-1. 青枯病菌Hrp片段克隆。目标种子序列的克隆与鉴定目标种子序列的克隆与鉴定四、结果与分析四、结果与分析经对扩增产物进行回收，连接载体，转化大肠杆菌感受经对扩增产物进行回收，连接载体，转化大肠杆菌感受态，提取质粒后态，提取质粒后PCR检测、酶切验证，最终测序分析。检测、酶切验证，最终测序分析。确定了克隆产物分子与目标种子序列同源皆在确定了克隆产物分子与目标种子序列同源皆在98%以上。以上。目标种子序列的克隆与鉴定目标种子序列的克隆与鉴定四、结果与分析四、结果与分析用于构建多重用于构建多重PCR体系的单一的引物设计体系的单一的引物设计四、结果与分析四、结

10、果与分析各各引物引物对目标病原菌的特异性和对目标病原菌的特异性和灵敏灵敏度度分析分析 用所设计的三对引物用所设计的三对引物PHY1/PHY2 、CMS1/CMS2、RSO1/RSO2，分别对马铃薯三种病原菌及其他参试，分别对马铃薯三种病原菌及其他参试菌株基因组菌株基因组 DNA 进行扩增进行扩增，检测检测所所设计的引物针对设计的引物针对目标病原菌的特异性。目标病原菌的特异性。 采用采用 10 倍梯度稀释法，分别倍梯度稀释法，分别将将提取的晚疫病菌纯提取的晚疫病菌纯 DNA、马铃薯马铃薯环腐病菌和青枯病菌悬浮液稀释环腐病菌和青枯病菌悬浮液稀释成不成不同同浓度梯度，测定浓度梯度，测定引物引物PHY

11、1/PHY2 、CMS1/CMS2、RSO1/RSO2检测检测晚疫病菌、晚疫病菌、环环腐病原菌和青枯病菌腐病原菌和青枯病菌的灵敏度。的灵敏度。 引物引物 PHY1/PHY2 的的特异性和灵敏度分析特异性和灵敏度分析M. DL1000分子量标记；1-10. 在25L体系中模板DNA分别为1.8g、180ng、18ng、1.8ng、180 pg、18 pg、1.8 pg 、180fg、18fg和1.8fg 的扩增产物；11. 阴性对照。M. DL1000分子量标记；1-2. 马铃薯晚疫病菌；3-4. 接种晚疫病菌的马铃薯；5. 马铃薯灰霉菌；6. 马铃薯环腐病菌；7. 马铃薯青枯病菌；8.马铃薯镰

12、刀菌；9. 胡萝卜软腐果胶杆菌；10. 大肠杆菌；11. 农杆菌；12. 乳酸杆菌；13. 马铃薯试管苗；14. 水。 引物引物 CMS1/CMS2 的的特异性和灵敏度分析特异性和灵敏度分析注：M. DL1000分子量标记；1-11. 病菌悬浮液浓度分别为1011、1010、109、108、107、106、105、104 、103、102和101CFUmL-1；12. 阴性对照。注：M. DL1000分子量标记；1-2. 马铃薯环腐病菌；3. 接种环腐病菌的马铃薯；4. 马铃薯青枯病菌；5. 马铃薯镰刀病菌；6. 马铃薯晚疫病菌；7. 马铃薯灰霉；8. 胡萝卜软腐果胶杆菌；9. 大肠杆菌；10

13、. 农杆菌；11. 乳酸杆菌；12. 马铃薯试管苗；13. 水。 引物引物 RSO1/RSO2的的特异性和灵敏度分析特异性和灵敏度分析M. DL1000分子量标记；1-11. 病菌悬浮液浓度分别为1011、1010、109、108、107、106、105、104 、103、102和10 CFUmL-1；12. 阴性对照。M. DL1000分子量标记；1-2. 马铃薯青枯病菌；3-4. 接种青枯病菌的马铃薯；5. 马铃薯环腐病菌；6. 马铃薯晚疫病菌；7. 马铃薯灰霉；8. 马铃薯镰刀菌；9. 胡萝卜软腐果胶杆菌；10. 大肠杆菌；11. 农杆菌；12. 乳酸杆菌；13. 马铃薯试管苗；14.

14、水。四、结果与分析四、结果与分析优化的优化的 PCR 体系体系为为 50 L: 5 L 10PCR buffer（Mg2+ Plus ），），0.8 mol/L dNTP，1.75 U Taq DNA 聚合酶，聚合酶，RSO1/RSO2 引物对浓度为引物对浓度为 0.20 mol/L，CMS1/CMS2 引物对浓度为引物对浓度为 0.20 mol/L，PHY1/PHY2 引物对浓度为引物对浓度为 0.16 mol /L，加，加 ddH2O 至至 50 L。扩增程序为：。扩增程序为：94 5 min；94 30 s，60 40 s，72 1 min，29 个循环；个循环；72 10 min。四、

15、结果与分析四、结果与分析多重多重 PCR 特异性检测特异性检测M. DL1000分子标量；1-2. 马铃薯晚疫病菌、环腐病菌和青枯病菌；3-4. 感晚疫病、环腐病和青枯病的马铃薯植株；5. 马铃薯镰刀菌；6. 胡萝卜软腐果胶杆菌；7. 马铃薯灰霉；8. 大肠杆菌；9. 农杆菌；10. 乳酸杆菌；11. 马铃薯试管苗；12. 水。四、结果与分析四、结果与分析多重多重 PCR 检测体系的验证检测体系的验证M. DL1000分子标量；1. 提取的晚疫病菌、环腐病菌和青枯病菌DNA混合样本；2. 提取的感环腐病、晚疫病和青枯病的植株DNA样本；3. 感晚疫病和环腐病的植株DNA样本；4. 感环腐病和青

16、枯病的植株DNA样本；5. 感晚疫病和青枯病的植株DNA样本；6. 感环腐病植株DNA样本；7. 感晚疫病植株DNA样本；8.感青枯病植株DNA样本；9. 阴性对照。四、结果与分析四、结果与分析多重多重 PCR 检测体系的验证检测体系的验证五五、主要结论、主要结论1. 确定并克隆了用于检测马铃薯晚疫病、环腐病和确定并克隆了用于检测马铃薯晚疫病、环腐病和青枯病病原的分子，为马铃薯晚疫病菌青枯病病原的分子，为马铃薯晚疫病菌 rDNA-ITS 区（区（868 bp）、环腐病菌）、环腐病菌 pSC1 质粒上的质粒上的纤维素酶纤维素酶 A 基因基因（2503 bp）和青枯病菌质粒上）和青枯病菌质粒上 Hrp 基因簇基因簇的的 Hrpc 基因基因片段（片段（974 bp）。）。2. 设计设计并验证并验证了用于检测马铃薯晚疫病、环腐病和了用于检测马铃薯晚疫病、环腐病和青枯病的三对引物（青枯病的三对引物（PHY1/PHY2、CMS1/CMS2、RSO1/RSO2 ），可分别扩增出），可分别扩增出 363 bp、879 bp 和和 245 bp 的特异性条带。的特异性条带。五五、主要结论、主要结论3. 建立了一步法检测马铃薯晚疫病、青枯病和环建立了一步法检测马铃薯晚疫病、青枯病和